黎偉豪 黃秀靜 葉燕綢★

3M 綜 合 征（Three M syndrome，OMIM #273750）是一種常染色體隱性遺傳病，由Miller、Mukusick、Malvaux 三位遺傳學家于1975 年首次發(fā)現(xiàn)并報道，其主要癥狀為嚴重宮內(nèi)和出生后生長遲緩，特殊面容，骨骼發(fā)育異常［1］。已報道3 個致病基因：CUL7（MIM 609577）基因、OBSL1（MIM 610991）基因和CCDC8（MIM 614145）基因，分別引起3M 綜合征的Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型三種類型。CUL7基因變異導致3M 綜合征占77.5%，OBSL1基因變異占16%，CCDC8基因變異少于5%，其他不明確基因變異約占1.5%［2-3］。

Netherton 綜 合 征（Netherton syndrome，NS，OMIM#256500）也是一種常染色體隱性遺傳病，于1958 年由Earl Netherton 首次報道，由SPINK5（MIM 605010）基因變異引起。NS 典型的臨床表現(xiàn)包括先天性魚鱗病樣紅皮病/回旋形線狀魚鱗病、毛發(fā)異常（套疊性脆發(fā)）和特應(yīng)性過敏體質(zhì)以及生長發(fā)育遲緩等［4］。NS臨床表現(xiàn)與其他多種皮膚病相似，可能造成漏診，估計NS約占新生兒紅皮病的20%［5］。

本文對一例產(chǎn)前超聲影像提示股骨發(fā)育速度明顯緩慢、面部發(fā)育異常、胸骨內(nèi)陷的胎兒進行了家系全外顯子組測序（Whole Exome Sequencing ，WES），研究報告如下：

1 材料與方法

1.1 一般資料

孕婦27 周歲，孕2 產(chǎn)1，早孕期超聲影像檢查提示胎兒頸后透明帶（Nuchal Translucency，NT）1.7 mm；早、中孕期唐氏篩查未見異常；無創(chuàng)產(chǎn)前篩查（Noninvasive Prenatal Test，NIPT）未提示異常。胎兒26+3 周產(chǎn)前超聲影像提示大小相當于22+周，長骨短，股骨、肱骨及尺橈骨、脛腓骨長相當于20～21 周（＜1%），雙頂徑（Biparietal Diameter，BPD）60.3 mm（+0.12 SD），頭圍（Head Circumference，HC）226.5 mm（+0.54 SD），腹圍（Abdominal Circumference，AC）188.8 mm（-1.01 SD），股骨長（Femur Length，F(xiàn)L）33.3 mm（-4.17 SD），考慮股骨發(fā)育速度明顯緩慢，面部輪廓顯示額部較前突，鼻梁低平，胸腹部矢狀切面顯示胸骨內(nèi)陷。孕婦否認近親結(jié)婚，孕期無放射性物質(zhì)接觸史，否認有家族史，否認孕期藥物服用史。孕婦夫妻無異常臨床表型，智力均正常。本研究經(jīng)孕婦及家屬的知情同意及本院倫理委員會的審批。

1.2 方法

1.2.1 家系全外顯子組測序

抽取臍帶血1 mL、胎兒父母外周血2 mL，用EDTA 抗凝劑抗凝。使用商品化核酸提取試劑盒（德國Qiagen）提取EDTA 抗凝血基因組gDNA，測定濃度及純度A260/A280 在1.8 左右，實驗建庫采用美國Roche 公司生產(chǎn)的定制基因片段捕獲探針（KAPA HyperExome）。實驗的標準操作流程包括基因組DNA 打斷、磁珠篩選、末端補平、3'端加堿基“A”、PCR 擴增及純化、目標基因外顯子及臨近剪切區(qū)捕獲及雜交、洗滌和洗脫、文庫單鏈環(huán)化、高通量測序。測序類型為PE100+10，測序完成后，得到原始測序數(shù)據(jù)，去除低質(zhì)量以及被接頭污染的讀長。將得到的可分析讀長用BWA 軟件（Burrows Wheeler Aligner）與hg19（GRch37：https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCF_000001405.13/）進行序列比對。用GATK 軟件進行SNV（single nucletide variant）和Indel（insertion and deletion）查詢，生成目標區(qū)域堿基多態(tài)性結(jié)果，隨后進行多種數(shù)據(jù)庫比對，參考數(shù)據(jù)庫有：NCBI dbSNP v147，dbNSDP v2.9.1，ESP6500 v2 HapMap，1000 human genome dataset 和database of 100 Chinese healthy adults，尋找出可疑的基因變異位點。結(jié)合ClinVar（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/ ）、OMIM（https：//www.omim.org/）、HGMD（http：//www.hgmd.cf.ac.uk/）等疾病數(shù)據(jù)，參考《美國醫(yī)學遺傳學與基因組學學會遺傳變異分類標準與指南2015》［6］規(guī)則對變異致病性進行解讀。以上檢測過程由深圳華大醫(yī)學檢驗實驗室完成。

1.2.2 Sanger 測序驗證

對于在樣本發(fā)現(xiàn)的CUL7基因、SPINK5基因致病、可能致病變異，在每個變異所在片段的上下游50 bp 附近區(qū)域設(shè)計引物。進行PCR 擴增，產(chǎn)物進行Sanger 測序，所得結(jié)果與NCBI 數(shù)據(jù)庫中CUL7（NM_014780.5）、SPINK5（NM_006846.4）基因標準序列進行比對，從而驗證家系外顯組測序的結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 家系全外顯子組測序結(jié)果

2.1.1CUL7基因的復合雜合變異

CUL7；c.3291_3294delTCAC（p.His1098Cysfs*42）雜合變異，依據(jù)ACMG 指南被評判為致病，評判證據(jù)為PVS1+PM2+PM3，遺傳自母親。CUL7；c.4717C＞T（p.Arg1573*）雜合變異，依據(jù)ACMG 指南被評判為致病，評判證據(jù)為PVS1+PM2+PM3+PP4，遺傳自父親。見表1。

表1 胎兒家系全外顯子組測序結(jié)果Table 1 The results of the WES

2.1.2SPINK5基因的復合雜合變異

SPINK5；c.2474_2475delAG（p.Glu825Glyfs*2）雜合變異，依據(jù)ACMG 指南被評判為致病，評判證據(jù)為PVS1+PM2+PM3，遺傳自父親。SPINK5；c.2870delT（p.Leu957Gln*46）雜合變異，依據(jù)ACMG指南被評判為可能致病，評判證據(jù)為PVS1+PM2，遺傳自母親。見表1。

2.2 Sɑnger 測序結(jié)果

胎兒CUL7；c.3291_3294delTCAC 變異位點為雜合型，母親為雜合型，父親為野生型。見圖1。胎兒CUL7；c.4717C＞T 變異位點為雜合型，母親為野生型，父親為雜合型。見圖2。胎兒SPINK5；c.2474_2475delAG 變異位點為雜合型，母親為野生 型，父親為雜合型。見圖3。胎兒SPINK5；c.2870delT 變異位點為雜合型，母親為雜合型，父親野生型。見圖4。

圖1 胎兒及其家系CUL7 基因c.3291_3294delTCAC變異位點Sanger 測序圖Figure 1 Sanger sequencing showing the c.3291_3294delTCAC of the CUL7 gene in the fetus and parents

圖2 胎兒及其家系CUL7 基因c.4717C＞T 變異位點Sanger 測序圖Figure 2 Sanger sequencing showing the c.4717C＞T of the CUL7 gene in the fetus and parents

圖3 胎兒及其家系SPINK5 基因c.2474_2475delAG 變異位點Sanger 測序圖Figure 3 Sanger sequencing showing the c.2474_2475delAG of the SPINK5 gene in the fetus and parents

圖4 胎兒及其家系SPINK5 基因c.2870delT 變異位點Sanger 測序圖Figure 4 Sanger sequencing showing the c.2870delT of the SPINK5 gene in the fetus and parents

3 討論

據(jù)ACMG2020 年發(fā)布的胎兒全外顯子組測序在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用顯示［7］，通過超聲鑒定出結(jié)構(gòu)性缺陷的胎兒有30%可能為染色體核型異常，染色體微陣列可以額外檢出4%～6%的基因異常；產(chǎn)前全外顯子組測序在染色體核型和染色體微陣列正常的情況下額外檢出8%～10%的基因異常［8］。宮內(nèi)發(fā)育遲緩是一種胎兒期非特異性的表現(xiàn)，大約占所有活產(chǎn)兒的0.17%，可由多種不同類型的遺傳病引起，應(yīng)在產(chǎn)前進行全外顯子組測序提高診斷率［9］。本研究胎兒全外顯子組測序結(jié)果提示CUL7基因和SPINK5基因分別存在致病/可能致病復合雜合變異，其父母進行變異位點的Sanger測序驗證后，證實其父母分別為CUL7基因和SPINK5基因雜合變異攜帶者。

胎兒CUL7基因c.3291_3294delTCAC 變異和c.4717C＞T 變異，其中c.3291_3294delTCAC 為首次報道的致病變異，依據(jù)ACMG 指南評判為致病，評判證據(jù)項為PVS1+PM2+PM3，SIFT（http：//sift.jcvi.org）、MutationTaster（http：//www.mutationtaster.org）、PolyPhen（http：//genetics.bwh.harvard.edu/pph）等多個蛋白結(jié)構(gòu)/功能和進化保守性軟件預(yù)測該變異有害，導致蛋白功能缺陷。3M 綜合征患者影像學檢查表現(xiàn)為骨骼畸形，包括長骨細長、脊柱前凸、椎體高等，表明CUL7參與了骨細胞的生長和增殖。迄今為止，3M 綜合征的基因型與表型關(guān)系仍未完全清楚，有待進一步的科學研究［10］。

胎兒SPINK5基因c.2474_2475delAG 變異和c.2870delT 變異，其中c.2870delT 變異為首次報道的致病變異，依據(jù)ACMG 指南被評判為可能致病，評判證據(jù)項為PVS1+PM2，多個蛋白結(jié)構(gòu)/功能和進化保守性軟件預(yù)測該變異有害，導致蛋白功能缺陷。SPINK5基因位于5q31-32，含有33 個外顯子，編碼含有1 064 個氨基酸的上皮和粘膜表面的淋巴上皮Kazal 型抑制物（Lymphoepithelial Kazal-Type-Related Inhibitor，LEKTI）蛋白，屬于一種多結(jié)構(gòu)域絲氨酸蛋白激酶。有研究表明絲氨酸蛋白酶在脫屑、上皮的抗炎抗菌和皮膚屏障調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用［11］。NS 患兒在出生時皮膚障礙就嚴重受損且伴有炎癥信號分子顯著上升，破壞了皮膚的屏障功能［12］。NS 胎兒出生時即存在彌漫性鱗屑性紅皮病樣皮損，新生兒期經(jīng)常出現(xiàn)危及生命的并發(fā)癥，大多數(shù)患兒可以對癥治療，悉心照顧可活至成年［13-15］。

3M 綜合征與NS 都是罕見的遺傳病，3M 綜合征發(fā)病率不詳；NS 發(fā)病率約為1/20 萬［16］。胎兒同時發(fā)生3M 綜合征及NS 的概率極低，本研究為全球首次報道，并且分別增加了一個CUL7基因和一個SPINK5基因新的致病變異，從而擴大了3M 綜合征及NS 的基因型譜。NS 患兒的臨床表型大多是是出生后才能被發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)前很難通過超聲影像檢查發(fā)現(xiàn)。引產(chǎn)胎兒外觀全身皮膚彌漫性魚鱗病樣紅皮，與NS 新生兒皮膚特征相符，但家屬拒絕行相關(guān)的皮膚檢查，所以缺乏NS 疾病的詳細臨床表型資料。胎兒NS 疾病的發(fā)現(xiàn)是因“胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩、特殊面容”做基因診斷時的額外發(fā)現(xiàn)，在遺傳咨詢過程中，應(yīng)結(jié)合胎兒的宮內(nèi)發(fā)育狀況、基因結(jié)果、家族史進行客觀全面的分析，進行個體化解讀，為患者做出最準確的診斷和優(yōu)生優(yōu)育咨詢。

單基因隱性遺傳病的發(fā)生，通常是因患兒父母同為遺傳病致病基因的攜帶者。3M 綜合征和NS 為不連鎖的兩種單基因隱性遺傳病。按照孟德爾遺傳規(guī)律，一種隱性遺傳病攜帶的父母生出患兒的概率為1/4，本研究的胎兒父母生出兩種疾病患兒的概率為1/16，生出其中一種遺傳病患兒的概率為6/16，生出攜帶者的概率為8/16，生出完全健康的胎兒的概率只有1/16。該孕婦再次妊娠，胎兒為綜合征患者的再發(fā)風險大大增加，必須進行產(chǎn)前診斷，也可以考慮借助單基因疾病植入前檢測（Preimplantation Genetic Testing for Monogenic，PGT-M）輔助生殖技術(shù)進行診斷［17］。