莫紹江 ，孫鵬亮 ，李虎，劉祥杰，李蓮瑞 *

（1塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300）

（2塔里木畜牧科技兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 阿拉爾 843300）

豬圓環(huán)病毒（porcine circovirus，PCV），是已知最小的動(dòng)物病毒之一，為單鏈環(huán)狀DNA病毒，長(zhǎng)度2 000 bp，粒子大小在17～20 nm之間。有二十面體的對(duì)稱結(jié)構(gòu)，無(wú)囊膜，對(duì)外界的理化環(huán)境具有較強(qiáng)的抵抗能力［1-4］。PCV按其基因型的差異分為四種類型，即 PCV1、PCV2、PCV3和 PCV4，其中 PCV2和PCV3是最具感染力和致病力的兩型［5］。據(jù)報(bào)道PCV3比PCV2對(duì)仔豬的致病力更強(qiáng)［6］。PCV3感染豬群可引起豬群全系統(tǒng)的炎癥反應(yīng)，嚴(yán)重者可導(dǎo)致母豬流產(chǎn)［7］。由于PCV2病毒已被廣泛研究，國(guó)內(nèi)關(guān)于PCV2的疫苗早已普遍應(yīng)用于各個(gè)豬場(chǎng)，使用之后大大降低了PCV2的感染率［8］，因此本次研究以PCV3為主。任敏等［9］通過(guò)對(duì)新疆PCV3的全基因組進(jìn)行測(cè)序并分析，發(fā)現(xiàn)所得的PCV3分離毒株與美國(guó)報(bào)告的毒株同屬于3b亞群，首次證實(shí)了新疆規(guī)?；i場(chǎng)中已經(jīng)存在PCV3感染的情況。魏其［10］通過(guò)對(duì)新疆最具代表性的13個(gè)地區(qū)進(jìn)行牛PCV3的分子流行病學(xué)調(diào)查和基因特征分析，發(fā)現(xiàn)PCV3已在新疆地區(qū)牛養(yǎng)殖場(chǎng)中廣泛存在。前人對(duì)新疆株P(guān)CV3Cap基因序列研究雖然相對(duì)較多，但關(guān)于阿克蘇地區(qū)PCV3感染情況的研究鮮有報(bào)道，所以本研究對(duì)新疆阿克蘇4個(gè)規(guī)?；i場(chǎng)的能繁母豬、仔豬和育肥豬的采樣樣本進(jìn)行PCV3檢測(cè)，以期知曉新疆阿克蘇地區(qū)PCV3感染與流行情況，為該地區(qū)PCV3感染防控工作打下理論基礎(chǔ)。

1 試驗(yàn)材料

1.1 樣品來(lái)源

2020—2021年對(duì)新疆阿克蘇地區(qū)4個(gè)規(guī)模化豬場(chǎng)的能繁母豬、仔豬和育肥豬共采584份全血樣本，詳情見表1。

表1 樣本列表

1.2 試驗(yàn)試劑

表2 試驗(yàn)試劑

1.3 試驗(yàn)儀器與設(shè)備

表3 儀器與設(shè)備

2 試驗(yàn)方法

2.1 樣品的預(yù)處理

吸取抗凝管中的全血樣品1 000μL加入到1.5 mL無(wú)菌離心管中，編號(hào)后置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 豬圓環(huán)病毒3型DNA提取

按照EasyPure?Viral DNA/RNA Kit試劑盒說(shuō)明書對(duì)全血樣本總DNA進(jìn)行提取，并將提取到的DNA放入-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 豬圓環(huán)病毒3型PCR擴(kuò)增檢測(cè)

引物選取參照王雪濤等［11］研究結(jié)果，由上海生工生物股份有限公司合成，引物序列和反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件見表4、表5。

表4 PCV3 PCR引物序列

表5 PCV3 PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件

2.4 瓊脂糖凝膠電泳

配制1%的瓊脂糖凝膠，用PCV3(Cap)-F/R PCR擴(kuò)增產(chǎn)物點(diǎn)樣，設(shè)置電壓（120 V）、電流（110 mA）、時(shí)間（25～30 min），使用凝膠成像系統(tǒng)于電泳后拍照保存。

2.5 PCR產(chǎn)物回收與純化

將PCV3(Cap)-F/R PCR擴(kuò)增基因片段的凝膠，按照普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒使用說(shuō)明操作，對(duì)擴(kuò)增基因片段的凝膠進(jìn)行切膠回收，將回收的目的基因置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.6 PCV3 Cap基因序列測(cè)定及同源性分析

使用純化后的PCR產(chǎn)物送上海生工測(cè)序，利用DNAStar軟件，將PCR產(chǎn)物測(cè)得的序列與GenBank選取的國(guó)內(nèi)15株P(guān)CV3Cap基因參考序列進(jìn)行同源性比對(duì)，參考序列見表6。

表6 PCV3 Cap基因參考序列

3 結(jié)果

3.1 臨床樣品中PCV3 PCR擴(kuò)增結(jié)果

以新疆阿克蘇地區(qū)4家規(guī)?；i場(chǎng)采集的584份豬全血樣本的DNA為模板，采用PCV3Cap基因的特異性引物，利用PCR進(jìn)行PCV3Cap基因的擴(kuò)增，共測(cè)出44份陽(yáng)性樣本，擴(kuò)增的目的條帶與預(yù)期大小一致，部分電泳圖見圖1。

圖1 部分樣本的PCV3 Cap基因PCR擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果

3.2 PCV3 Cap基因序列同源性分析

在NCBI上對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析，將44份陽(yáng)性樣本PCR產(chǎn)物測(cè)序后進(jìn)行同源性比對(duì)，獲得2種PCV3Cap基因序列，分別命名為AKesuCap-1（育肥場(chǎng)）和AKesuCap-2（繁育場(chǎng)）。通過(guò)DNAStar軟件對(duì)2種檢測(cè)出的PCV3Cap基因序列與15株國(guó)內(nèi)流行株Cap基因序列進(jìn)行同源性比較，并制作PCV3Cap基因同源性表（圖2）及基因系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（圖3）。

圖2 PCV3 Cap基因序列與國(guó)內(nèi)毒株核苷酸同源性分析

圖3 PCV3 Cap基因序列與國(guó)內(nèi)毒株的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析

將AKesuCap-1（育肥場(chǎng)）、AKesuCap-2（繁育場(chǎng)）和15株中國(guó)PCV3Cap基因參考序列構(gòu)建同源性表及基因系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，AKesuCap-1和15株中國(guó)PCV3Cap基因參考序列的同源性在98.9%～100%之間，且與CN/Xinjiang-AK16/2018株同源性達(dá)到了100%，反映了該育肥場(chǎng)存在CN/Xinjiang-AK16/2018毒株感染的情況。同時(shí)，AKesuCap-2和15株中國(guó)PCV3Cap基因參考序列的同源性介于98.5%～99.6%之間，與NWHEB21、PCV3-CN-ZJ-QZ-2-2017同源性為99.6%。而且，AKesuCap-1和AKesuCap-2同源性為98.5%。由此可知，2株P(guān)CV3Cap基因核苷酸序列與國(guó)內(nèi)15株P(guān)CV3Cap基因參考核苷酸序列具有高度同源性。而基因系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹則揭示了AKesuCap-1（育肥場(chǎng)）和AKesuCap-2（繁育場(chǎng)）具有明顯的遺傳距離，AKesuCap-1與CN/Xinjiang-AK16/2018（MK562412.1）屬于同一分支，AKesuCap-2與 NWHEB21（MG564174.1）在同一分支上。

3.3 PCV3感染情況調(diào)查

3.3.1 2020—2021年樣品中PCV3感染情況

經(jīng)過(guò)對(duì)2020—2021年新疆阿克蘇地區(qū)4個(gè)規(guī)?；i場(chǎng)的584份樣本進(jìn)行PCV3檢測(cè)，共檢出PCV3陽(yáng)性樣品44份，總陽(yáng)性檢出率為7.53%。

3.3.2 不同類型豬場(chǎng)PCV3感染情況

通過(guò)PCR技術(shù)對(duì)來(lái)自不同豬場(chǎng)的共584份樣品進(jìn)行PCV3檢測(cè)，結(jié)果顯示，繁育場(chǎng)PCV3平均陽(yáng)性率為14.07%（19/135），而育肥場(chǎng)（1、2和3）平均陽(yáng)性率為5.57%（25/449）。經(jīng)過(guò)對(duì)比可以發(fā)現(xiàn)，繁育場(chǎng)的PCV3檢出率較育肥場(chǎng)要高，詳情見表7。

表7 不同類型豬場(chǎng)PCV3檢測(cè)情況

3.3.3 不同生長(zhǎng)階段的豬群PCV3感染情況

不同生長(zhǎng)階段的豬群對(duì)PCV3的感染情況不同，能繁母豬和仔豬的感染陽(yáng)性率分別為9.09%和17.50%，而育肥豬（1、2、3）的感染陽(yáng)性率分別為3.33%、5.14%和7.79%。由此可知仔豬的PCV3感染陽(yáng)性率最高，其次是能繁母豬，育肥豬最低，詳見表8。

表8 不同生長(zhǎng)階段的豬群PCV3 PCR抗原檢測(cè)情況

4 討論

PCV3是近些年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一類豬圓環(huán)病毒，自2016年在美國(guó)報(bào)道后，其逐漸在世界范圍內(nèi)傳播開來(lái)［12-13］。中國(guó)作為全球最大的豬肉生產(chǎn)和消費(fèi)大國(guó)也有PCV3的相關(guān)報(bào)道［14］。阿克蘇地處我國(guó)西部邊陲，通過(guò)對(duì)該地區(qū)四個(gè)規(guī)模化養(yǎng)豬場(chǎng)展開調(diào)查，發(fā)現(xiàn)PCV3各豬場(chǎng)陽(yáng)性發(fā)生率為100%，平均陽(yáng)性率達(dá)7.53%，表明該地區(qū)的養(yǎng)豬場(chǎng)已經(jīng)普遍存在PCV3感染。

通過(guò)數(shù)據(jù)分析可知，阿克蘇地區(qū)部分豬場(chǎng)PCV3陽(yáng)性率結(jié)果與李靜等［15］研究結(jié)果相比要更低，推測(cè)可能與樣品來(lái)源的差異有關(guān)。所有陽(yáng)性數(shù)據(jù)中，仔豬陽(yáng)性率最高，育肥豬陽(yáng)性率最低，且能繁母豬和仔豬的PCV3陽(yáng)性率要高于育肥豬群。這與黃翠琴等［16］研究結(jié)果一致。

通過(guò)對(duì)44份陽(yáng)性樣本PCR產(chǎn)物測(cè)序進(jìn)行同源性比對(duì)分析，得到2種PCV3Cap基因序列。測(cè)序結(jié)果表明，AKesuCap-1、AKesuCap-2和15株中國(guó)PCV3Cap基因參考序列同源性較高，且與2018年QIAO M F等［17］在新疆阿克蘇地區(qū)商品豬場(chǎng)所發(fā)現(xiàn)的PCV3毒株相一致，推測(cè)可能PCV3的Cap基因在當(dāng)?shù)剡M(jìn)化具有相對(duì)穩(wěn)定性，要想進(jìn)一步證實(shí)，還需要開展更廣泛的針對(duì)PCV3的研究。

5 結(jié)論

新疆阿克蘇地區(qū)部分規(guī)?；i場(chǎng)存在PCV3感染，繁育場(chǎng)豬比育肥場(chǎng)豬感染率更高。