驢乳中脂肪酸的氣相色譜定性與定量分析方法建立與應(yīng)用

許濤，劉瑞鑫，賈瑜艷，方雷，李楊輝，周小玲*，于治成

（1塔里木大學動物科學與技術(shù)學院，新疆 阿拉爾 843300）

（2塔里木畜牧科技兵團重點實驗室，新疆 阿拉爾 843300）

（3新疆阿勒泰地區(qū)青河縣夢圓生物科技有限公司，新疆 青河 836200）

驢乳中活性物質(zhì)豐富，具有防治心血管疾病、抗疲勞、抗腫瘤的作用［1］，還具有抗菌、抑菌、提高機體免疫力、調(diào)節(jié)腸道菌群、潤膚美容、輔助治療和食療康復等作用［2］，近年來越來越多的國內(nèi)外學者參與到有關(guān)驢乳及驢乳制品的研究中［3-8］。有研究表明，驢乳平均水分含量為90%、脂肪含量為0.28%～2.00%、蛋白質(zhì)含量為1.2%～2.0%、乳糖含量為5.8%～7.4%、灰分含量為 0.4%～0.5%［4］。與牛乳、羊乳、駱駝乳相比，驢乳中蛋白質(zhì)、乳糖含量與人乳更為接近，具有致敏性較低、能增強免疫力等特點［2,9］。驢乳的脂肪酸組成與人乳脂肪酸組成比較接近［10］，含有豐富的人體必需脂肪酸（essential fatty acid，EFA）。驢乳中所含多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFA）n-3略高于人乳，遠高于牛乳；驢乳中α-亞麻酸（α-Linolenic acid，ALA）百分比含量遠高于人乳和牛乳，亞油酸（linoleic acid，LA）百分比含量和人乳較為接近，高于牛乳；驢乳中花生四烯酸（arachidonic acid，AA）百分比含量遠低于人乳和牛乳，二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）百分比含量高于人乳和牛乳，因此造成了驢乳較低的PUFA n-3/n-6和AA/EPA比值，適合牛奶蛋白過敏嬰幼兒食用［11］。

氣相色譜法因其高效的分離效能和靈敏的檢測限，成為脂肪酸分析的常用技術(shù)，在乳脂肪酸分析中應(yīng)用廣泛。關(guān)于驢乳脂肪酸的定性定量檢測近年來也有報道，如張巖春等［10］采用氣相色譜法分析測定了驢乳；于靜等［12］采用氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）聯(lián)用分析生鮮驢乳；錢宗耀等［13］采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測定驢乳粉。但由于飼養(yǎng)條件不同，乳汁營養(yǎng)成分不同，造成檢測結(jié)果有差異，因此，有必要研究本地新疆驢驢乳樣品。本試驗利用島津GC-2014C氣相色譜儀，以37種脂肪酸甲酯標準品為基礎(chǔ)，建立定性分析乳中脂肪酸、峰面積外標法和定量測定驢乳中脂肪酸含量的分析方法，并對測定結(jié)果的重現(xiàn)性和準確度進行評價，以期為驢乳脂肪酸檢測方法提供更多參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗動物為塔里木大學動物科學與技術(shù)學院實訓基地飼養(yǎng)的新疆驢，樣品采自5頭同一飼養(yǎng)標準下處于泌乳中期的母驢，手工擠奶并經(jīng)四層棉質(zhì)紗布過濾后，樣品置于-20℃下冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

脂肪酸標準品：37種脂肪酸甲酯標準品購自上海西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司，詳見表1。

表1 37種脂肪酸甲酯標準品及其中英文名稱

續(xù)表1

試劑：正己烷（天津致遠化學試劑有限公司），氫氧化鈉（天津致遠化學試劑有限公司），鹽酸、己酸、庚酸、辛酸、甲醇均為分析純試劑（成都西隴化學試劑玻璃儀器有限公司）。

儀器：GC-2014C氣相色譜儀（日本島津儀器有限公司），AL204電子天平（上海梅特勒-托利多國際貿(mào)易有限公司），HH-S4數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州邁科諾儀器有限公司），H2050R-1臺式高速離心機（湘儀離心機儀器有限公司），H2050R高速冷凍離心機（湘儀離心機儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 提取乳脂

稱取驢乳樣品40 mL置于50 mL離心管中，以6 000 r/min離心30 min，吸出上層奶油后置于5 mL離心管中，以15 000 r/min冷凍離心30 min，在冰水中取出上層奶油。

1.2.2 乳脂皂化酯化

1）氫氧化鈉-甲醇溶液（0.5 mol/L）：稱取2 g氫氧化鈉，用甲醇溶解并定容至100 mL，混勻。

2）鹽酸-甲醇溶液（5 vt%）：取5 mL鹽酸，用甲醇定容至100 mL，混勻。

3）提取的驢乳奶油在室溫融化后，吸取100 μL于具塞玻璃管中，加入6 mL氫氧化鈉-甲醇溶液，置于60℃下水浴15 min，再加入6 mL鹽酸-甲醇溶液，在80℃下水浴60 min，冷卻至室溫后，最后加入5 mL蒸餾水和5 mL正己烷，振搖，靜置分層后，取上清液2 mL，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾后，放入進樣瓶中，進氣相色譜儀測定。

1.2.3 色譜條件

色譜柱：CP-sil88，100 m×0.25 mm×0.2 μm；檢測器：FID，260 ℃；入口壓力：200 kPa；色譜柱流量：N21.0 mL/min；分流比（30:1）；進樣口：230℃。

程序升溫：初始溫度70℃，保持4 min，以13℃/min的速度上升至175℃，保持27 min，以4℃/min的速度上升至210℃，保持8 min，最后以5℃/min的速度上升至230℃，保持13 min，程序共72.83 min，可使37種脂肪酸完全分離。

1.3 脂肪酸定性、定量分析方法的建立

1.3.1 定性分析

驢乳樣品中脂肪酸的保留時間與標準品中脂肪酸的保留時間進行比較，來確定各脂肪酸的峰位。

1.3.2 定量分析

以正己烷為溶劑將37種脂肪酸甲酯標準品配制成稀釋液，分別為原液濃度的1/10、2/10、4/10、6/10和8/10。取1.0 μL進氣相色譜儀分析，連續(xù)多次測定，采用峰面積外標法，建立線性回歸方程。

1.3.3 精密度、相對標準偏差和回收率

精密度計算：在重復條件下獲得兩次獨立的測定結(jié)果的絕對差值與算術(shù)平均值之比，以不超過算術(shù)平均值的15%為標準，標準參考GB/5009.168—2016《食品中脂肪酸的測定》［14］。

相對標準偏差（RSD）：所測樣品含量的標準偏差/所測樣品含量的平均值×100。

回收率計算：在測定樣品時，于同一樣品中加入一定量的標準物質(zhì)進行測定，將測定結(jié)果扣除樣品的測定值，計算回收率。

2 結(jié)果與討論

2.1 37種脂肪酸甲酯標準品中脂肪酸的定性、定量分析

2.1.1 37種脂肪酸甲酯標準品中脂肪酸的定性分析

37種脂肪酸甲酯標準品中脂肪酸保留時間及定性結(jié)果如圖1所示。分離度（R）是評價色譜柱總分離效能的指標，R值越大分離越完全，通常R≥1.5表示相鄰兩峰完全分離。若樣品峰保留時間與標準品峰保留時間差小于0.1 min，則定性為同一種脂肪酸［15］。通過計算和出峰圖綜合分析，該標準品分離完全，此分析方式可作為一種定性分析乳中脂肪酸的較為準確的方法。

圖1 37種脂肪酸甲酯標準品中脂肪酸色譜圖

2.1.2 37種脂肪酸甲酯標準品中脂肪酸的定量分析

37種脂肪酸甲酯標準品中脂肪酸的定量結(jié)果如表2所示，在所選濃度范圍內(nèi)，各脂肪酸工作曲線的相關(guān)系數(shù)r>0.997，說明在該濃度范圍內(nèi)峰面積與濃度線性相關(guān)性較好。RSD值介于0.29%～4.88%之間，說明該方法能有效地定量測定驢乳中各脂肪酸濃度，重復性較好；精密度介于0.37%～6.89%之間，表明此方法的精密度較高，可滿足精確測量的要求?；厥章试?0.43%～110.78%之間；表明該方法準確度高，可有效測定驢乳中各脂肪酸濃度?？傮w來說，該方法所測結(jié)果重復性、精密度、準確度都可滿足測試要求，可用于后續(xù)驢乳脂肪酸定量測定。

表2 37種脂肪酸甲酯標準品中脂肪酸的線性特征、RSD、精密度和回收率

續(xù)表2

2.2 驢乳樣品中脂肪酸的定性、定量測定

由表3可知，從驢乳中檢測出C6:0、C8:0、C10:0、C11:0、C12:0、C13:0、C14:0、C14:1、C15:0、C16:0、C16:1、C17:1、C18:0、C18:ln9c、C18:2n6c、C20:1、C18:3n-6共17種脂肪酸，但各樣品中脂肪酸種類和含量存在較大差異。其余20種脂肪酸在本試驗驢乳樣本中并未檢出或含量甚微。

表3中從各脂肪酸的組成來看，乳樣5含量明顯高于其余4個樣本，推測與乳樣5的母驢采食及產(chǎn)奶量相關(guān)。在試驗過程中，個別母驢會出現(xiàn)喜愛吃粗飼料，對精料采食較少的情況。而驢是單胃草食動物，粗飼料中中性洗滌纖維（neutral detergent fiber，NDF）所占比例較高，在驢后腸經(jīng)微生物作用下轉(zhuǎn)化為乙酸為主的短鏈脂肪酸（SCFA）［16］，乙酸是生脂前體物［17］，有利于乳脂的合成［18-19］，這樣會造成乳中乳脂比例較高，產(chǎn)奶量相對較低的現(xiàn)象，從而改變?nèi)槌煞趾浚愃频默F(xiàn)象在馬乳［20-21］中也有報道。因此我們認為乳樣5各脂肪酸含量高，與驢飼料營養(yǎng)因素有關(guān)。

表3 驢乳樣品脂肪酸組成及含量

驢乳中以C8:0、C10:0、C12:0、C14:0、C16:0、C18:ln9c、C18:2n6c這7種為主，尤其以C18:2n6c為多，平均占比為20.6%，這與張巖春等［10］、豆智華等［22］報道結(jié)果相近。從飽和脂肪酸上來看，以C10:0、C12:0、C14:0和C16:0為主，而其中C10:0～C14:0稱為中鏈飽和脂肪酸，此類脂肪酸可直接被小腸吸收為機體供能［23］；另外月桂酸（C12:0）在體內(nèi)被認為具有抗病毒和抗菌能力；肉豆蔻酸（C14:0）可以同時提高LDL-C和HDL-C的含量；棕櫚酸（C16:0）能調(diào)節(jié)人體脂肪的形成［24］，并且還有抗炎、調(diào)節(jié)糖尿病患者胰島素分泌等功能［25］。在本研究中，不飽和脂肪酸中以亞油酸（C18:2n6c）和油酸（C18:ln9c）為主，分別占15.57%和20.6%，這與豆智華等［22］的報道相近。亞油酸具有“血管清道夫”稱號，可降低人體血液中膽固醇和甘油三酯等［26］，在醫(yī)學和食品健康領(lǐng)域受到廣泛重視。油酸可促進傷口愈合，且具有降血糖，調(diào)節(jié)血脂，保護心臟等作用［27］。UFA/SFA比值是反映食品中脂肪酸營養(yǎng)價值的重要指標，本研究測得驢乳樣本中UFA/SFA比值為0.63，這與張巖春等［10］、豆智華等［22］

人報道結(jié)果不同，均小于他們所得結(jié)果，但與敖維平等［28］報道結(jié)果接近。其原因可能與飼養(yǎng)管理或個體差異有關(guān)，MARTINI M等［29］也曾對驢乳中UFA/SFA值個體差異較大有過報道。

3 結(jié)論

本研究運用外標法，以37種脂肪酸甲酯標準品為基礎(chǔ)，建立了定性、定量分析驢乳中脂肪酸的分析方法。該方法具有較好的準確性和精密度，能有效地分離驢乳中各脂肪酸。采用該方法可較好地從驢乳脂肪中分離出17種脂肪酸樣本，其中亞油酸（C18:2n6c）占20.6%，月桂酸（C12:0）占15.78%，油酸（C18:1n9c）占 15.57%，癸酸（C10:0）占 14.34%，棕櫚酸（C16:0）占14.09%，肉豆蔻酸（C14:0）占9.64%，表明此方法適用于驢乳脂肪酸的分析。