抗生素殘留對施用牛糞土壤氮素礦化的影響及amoA、nxrA基因的響應*

萬 辰 陳思瑋 馬瑛駿 張克強 王 風 沈仕洲#

(1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護科研監(jiān)測所，天津 300191；2.大理農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)國家野外觀測研究站，云南 大理 671004；3.云南農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境學院，云南 昆明 650201；4.東北農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境學院，黑龍江 哈爾濱 150030)

氮素是滿足作物生長和提高作物產(chǎn)量所必須的營養(yǎng)元素[1]。農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)氮素有多種輸入途徑，但作物獲取的氮素主要來源于土壤和肥料[2]，土壤中90%(質(zhì)量分數(shù))以上氮素以有機態(tài)氮的形式存在[3]，僅有部分小分子有機態(tài)氮能被作物吸收利用，大部分需經(jīng)過礦化作用轉(zhuǎn)化成銨態(tài)氮和硝態(tài)氮才能被作物吸收利用[4]。土壤氮素礦化釋放是微生物主導的生物化學過程，受土壤質(zhì)地、溫度、含水率、有機質(zhì)含量等因素影響[5-6]，土壤中污染物也會通過抑殺土壤微生物來抑制土壤氮素礦化作用。

抗生素是一類具有干擾、殺死微生物或生物細胞的有機化學物質(zhì)[7]，在畜禽養(yǎng)殖等方面被廣泛應用。有研究表明，只有部分抗生素參與動物的新陳代謝并被有效使用，大部分抗生素直接隨動物尿液和糞便排出體外[8]，并以原藥形式輸入環(huán)境系統(tǒng)[9]。中國畜禽糞便產(chǎn)量較大，2015年畜禽糞便總產(chǎn)量可達10.19億t[10]，其中80%未經(jīng)無害化處理直接用作農(nóng)作物肥料[11]。這些未經(jīng)處理并且殘留抗生素的糞便作為有機肥施用于農(nóng)田，不僅會造成土壤、水體污染[12]，還會選擇性抑殺某些土壤微生物，破壞土壤環(huán)境中微生物群落組成和結(jié)構(gòu)[13]。土壤氮素礦化作用依賴于微生物調(diào)控[14]，土壤或肥料中殘留的抗生素會干擾相關微生物活動，勢必會對土壤氮素礦化造成影響。不同抗生素的藥效不同，對氮素礦化的影響存在差異。YU等[15]研究發(fā)現(xiàn)，低濃度紅霉素對氨氧化菌有明顯抑制作用，而中濃度和高濃度紅霉素對氨氧化菌具有明顯增益作用。HAMMESFAHR等[16]利用磺胺嘧啶污染新鮮和腐熟的豬糞，結(jié)果顯示磺胺嘧啶明顯抑制氨氧化細菌和氨氧化古菌生長，降低氨氧化微生物的豐富度和多樣性，進而抑制氨氧化過程。

畜禽糞便中檢出率較高的抗生素類型有磺胺類、四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類和喹諾酮類[17]，雖然抗生素在堆肥過程中可由于生物降解等作用有所降低，但難以全部去除，最終通過施肥進入土壤。本研究以水稻土作為研究對象，在施加傳統(tǒng)有機肥條件下，通過室內(nèi)好氧培養(yǎng)試驗探究不同抗生素處理下的土壤氮素礦化特征，及對氮素礦化功能基因的影響，對指導畜禽糞便等有機物料合理利用具有重要的科學意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試土壤采自云南大理農(nóng)田耕層土壤(0～20 cm)，樣品經(jīng)過風干后過1 mm篩備用。供試牛糞采自某奶牛養(yǎng)殖場，經(jīng)測定無抗生素檢出，樣品經(jīng)堆肥腐熟和風干后過1 mm篩備用，供試土壤及牛糞基本理化性質(zhì)見表1。

1.2 試驗設計

參考有機肥常規(guī)施加量進行試驗設計，取104 g風干土樣于塑料瓶中，加入3.07 g風干牛糞，分別加入恩諾沙星(ENR)、四環(huán)素(TCY)和金霉素(CTC)3種畜禽養(yǎng)殖常用抗生素，調(diào)節(jié)混合土樣中抗生素質(zhì)量濃度分別為10、25、50、100 mg/kg。向混合土樣中加入20 mL蒸餾水，使其含水量與田間持水量基本持平。塑料瓶用蓋封口并扎孔保持通氣，于恒溫避光處培養(yǎng)。每個處理設置3個重復，以不加抗生素作為對照(CK)組。試驗期間，每隔2～3天稱量一次補充蒸餾水保持混合土樣含水量。為防止抗生素降解吸附以及微生物適應性增強等因素對試驗結(jié)果產(chǎn)生影響[18]，試驗培養(yǎng)周期設置為25 d，分別于第3、6、9、16、25 天時采樣。土壤礦質(zhì)氮包括銨態(tài)氮與硝態(tài)氮，因此稱取20 g土樣加入浸提瓶中并加入100 mL質(zhì)量濃度為2 mol/L的氯化鉀浸提液，在恒溫振蕩器中振蕩1 h，過濾收集浸提瓶中的水樣并測定氨氮及硝態(tài)氮含量，折算土樣中銨態(tài)氮、硝態(tài)氮質(zhì)量濃度[19]，試驗過程中土壤礦質(zhì)氮的增量即為氮素累積礦化量，礦質(zhì)氮的增速即為凈氮礦化速率。

1.3 土壤功能基因提取與分析

試驗結(jié)束后，準確稱取0.5 g土樣采用FastDNA?SPIN試劑盒(美國MP Biomedicals)進行脫氧核糖核酸(DNA)提取，每個土樣做3個重復，提取DNA后的樣品置于冰箱中-20 ℃下保存，用于后續(xù)分析檢測。

采用ABI7300型熒光定量聚合酶鏈式反應(qPCR)儀(美國Applied Biosystems)對amoA、nxrA基因進行qPCR分析。qPCR擴增過程如下：預變性95 ℃持續(xù)3 min；95 ℃變性5 s，58 ℃退火/延伸持續(xù)30 s，進行40個循環(huán)；熔點曲線分析在72 ℃進行。各DNA模板設置3組平行，以無菌雙蒸水為陰性對照[20]。

表1 供試土壤及牛糞的基本理化性質(zhì)Table 1 Basic chemical and physical characteristics of cow manure and soil

2 結(jié)果與分析

2.1 不同抗生素對土樣銨態(tài)氮的影響

施加不同水平的ENR、TCY、CTC后，土樣銨態(tài)氮的變化見圖1。由圖1(a)可見，在不同水平的ENR處理下，土樣銨態(tài)氮總體呈先上升后下降的變化趨勢。其中，ENR為10、25 mg/kg處理組的土樣銨態(tài)氮在第3天達到最大值后開始下降，而ENR為50、100 mg/kg處理組的土樣銨態(tài)氮在第6天達到最大值，分別為16.01、15.92 mg/kg，明顯高于其他處理組。CK處理組的土樣銨態(tài)氮在試驗前9天變化不大，基本維持在12 mg/kg左右，第9天后土樣銨態(tài)氮開始迅速下降；試驗進行到第16天后，各處理組土樣銨態(tài)氮含量趨于穩(wěn)定，試驗結(jié)束時，CK處理組土樣銨態(tài)氮為5.71 mg/kg，ENR為10、25、50、100 mg/kg的處理組土樣銨態(tài)氮分別為3.99、3.79、4.84、3.96 mg/kg，明顯低于CK處理組。由圖1(b)可見，試驗第3天時，TCY為10、25、50、100 mg/kg處理組的土樣銨態(tài)氮分別為12.68、14.23、14.52、14.91 mg/kg；第3天后，除100 mg/kg處理組的土樣銨態(tài)氮繼續(xù)升高，其他各處理組土樣銨態(tài)氮均有下降，其中TCY為10、25 mg/kg處理組的土樣銨態(tài)氮含量與CK處理組差異不明顯；第6天后，TCY為100 mg/kg處理組的土樣銨態(tài)氮含量也迅速下降，不同處理間差異逐漸縮??；各處理組土樣銨態(tài)氮含量均在第16天時達到最小值，然后稍有上升。試驗結(jié)束時，TCY為10、25、50、100 mg/kg處理組的土樣銨態(tài)氮分別為5.68、4.90、4.91、4.59 mg/kg。由圖1(c)可見，不同CTC處理組土樣銨態(tài)氮在試驗前3天無明顯變化；試驗第6天時，除CTC為10 mg/kg處理組及CK處理組土樣銨態(tài)氮有所下降外，CTC為25、50、100 mg/kg處理組土樣銨態(tài)氮均明顯上升，分別達到22.27、26.37、25.06 mg/kg，在第6天后，3個CTC處理組土樣銨態(tài)氮均迅速下降，各處理組之間差異逐漸減小。試驗結(jié)束時，CTC為10、25、50、100 mg/kg處理組的土樣銨態(tài)氮分別為5.62、5.58、5.53、5.64 mg/kg，與CK處理組無明顯差異。

圖1 不同抗生素對土樣銨態(tài)氮的影響Fig.1 Effect of different antibiotics on ammonium nitrogen in soil samples

2.2 不同抗生素對土樣硝態(tài)氮的影響

施加不同水平的ENR、TCY、CTC后，土樣硝態(tài)氮的變化見圖2。由圖2(a)可見，在不同水平的ENR處理下，土樣硝態(tài)氮含量總體均呈上升趨勢。試驗前6天，僅CK處理組土樣硝態(tài)氮逐漸上升，其余4個ENR處理組土樣硝態(tài)氮總體無明顯變化。第6天后，ENR處理組土樣硝態(tài)氮開始迅速上升，但與CK處理組間的差距持續(xù)增大。第9天后，各處理組土樣硝態(tài)氮上升趨勢放緩，試驗結(jié)束時，ENR為10、25、50、100 mg/kg處理組的土樣硝態(tài)氮分別為52.95、50.37、48.93、45.25 mg/kg，CK處理組土樣硝態(tài)氮則達到75.87 mg/kg，明顯高于4個ENR處理組。由圖2(b)可見，TCY處理下土樣硝態(tài)氮變化趨勢與ENR處理基本相似，但與CK處理組土樣硝態(tài)氮的差異有所減小，試驗結(jié)束時，TCY為10、25、50、100 mg/kg處理組的土樣硝態(tài)氮分別為65.33、65.07、65.29、52.80 mg/kg。由圖2(c)可見，試驗期間CTC為10 mg/kg處理組的土樣硝態(tài)氮變化與CK處理組十分接近，除試驗第6天時，CTC為25、50、100 mg/kg處理組的土樣硝態(tài)氮出現(xiàn)下降，明顯低于CK處理組，此后各處理組土樣硝態(tài)氮均迅速上升，處理組間差異逐漸減小。試驗結(jié)束時，CTC為10、25、50、100 mg/kg處理組的土樣硝態(tài)氮分別為75.95、73.54、72.80、73.49 mg/kg，與CK處理組差異不大。

圖2 不同抗生素對土樣硝態(tài)氮的影響Fig.2 Effect of different antibiotics on nitrate nitrogen in soil samples

2.3 不同抗生素對土樣凈氮礦化速率的影響

試驗期間，不同抗生素處理下土樣的凈氮礦化速率計算結(jié)果見表2。在0～3 d，3種抗生素處理組的凈氮礦化速率均低于CK處理組，其中ENR處理組及TCY為10、25、50 mg/kg處理組顯著低于CK處理組，CTC處理組略低于CK處理組。在3～6 d，CK處理組土樣的凈氮礦化速率達到2.47 mg/(kg·d)，ENR處理組及TCY處理組較CK處理組最高分別下降了1.96、2.30 mg/(kg·d)，CTC處理組與CK處理組差異不顯著。在6～9 d，ENR處理組及TCY處理組的凈氮礦化速率與CK處理組的差異達到最大，其中ENR為100 mg/kg處理組土樣凈氮礦化速率較CK處理組差距最大，相差8.17 mg/(kg·d)；CTC為10 mg/kg處理組的土樣凈氮礦化速率高于CK處理組，其余CTC處理組均低于CK處理組。在9～16 d，各ENR處理組間土樣凈氮礦化速率無顯著差異，且與CK處理組的差異減小，最大凈氮礦化速率差僅為0.36 mg/(kg·d)；TCY為10 mg/kg處理組及CTC為50、100 mg/kg處理組土樣凈氮礦化速率高于CK處理組，其余處理組均低于CK處理組。在16～25 d，除CTC為25 mg/kg處理組土樣凈氮礦化速率顯著高于CK處理組，其余處理組與CK處理組間均無顯著差異。

表2 不同抗生素處理下土樣凈氮礦化速率變化1)Table 2 Changes of net nitrogen mineralization rate in soil after treated by different antibiotics

2.4 不同抗生素對amoA、nxrA基因的影響

經(jīng)計算，培養(yǎng)結(jié)束時CK處理組氮素累積礦化量為62.89 mg/kg，ENR為25、50、100 mg/kg處理組的氮素累積礦化量分別為35.27、35.08、30.79 mg/kg，TCY為25、100 mg/kg處理組的氮素累積礦化量分別為51.27、38.70 mg/kg，顯著低于CK處理組(P<0.05)，各濃度CTC處理組的氮素累積礦化量均與CK處理組無顯著差異(P>0.05)，說明土壤中的CTC殘留不會降低有機肥氮素礦化量。為探究土壤中抗生素對有機肥氮素礦化機制的影響，選取與CK處理組氮素累積礦化量存在顯著差異的處理組土樣進行氮素礦化功能基因檢測，其中包括amoA和nxrA基因，結(jié)果見圖3。

圖3 抗生素處理對amoA、nxrA基因的影響Fig.3 Effect of antibiotics on amoA gene and nxrA gene

與CK處理組相比，TCY為25 mg/kg處理組amoA基因豐度無顯著差異，nxrA基因豐度提高0.84%，當TCY上升到100 mg/kg時，amoA、nxrA基因豐度分別下降了35.35%、52.38%，且為各處理組中的最低水平。ENR為25 mg/kg時，amoA、nxrA基因豐度分別比CK處理組下降了28.17%、31.38%，ENR上升到50、100 mg/kg時，amoA、nxrA基因豐度有所上升，且兩處理組間無顯著差異。

3 討 論

抗生素進入土壤后將對土壤微生物結(jié)構(gòu)和數(shù)量造成影響，進而影響土壤中的氮素礦化。本研究中，ENR在培養(yǎng)開始后便對氮素礦化產(chǎn)生抑制作用，試驗6～9 d抑制作用最明顯，該階段10、25、50、100 mg/kg的ENR對土樣凈氮礦化速率的抑制率分別為43.67%、48.95%、55.71%、71.79%；第16天后，ENR對氮素礦化抑制強度減弱，試驗后期不同ENR處理組土樣的凈氮礦化速率與CK處理組無顯著差異。分析原因，主要是由于ENR對硝化作用產(chǎn)生抑制導致，培養(yǎng)結(jié)束時，各ENR處理組的硝態(tài)氮含量明顯低于CK處理組。閆賽紅[21]研究指出，ENR限制了土壤細菌、放線菌和真菌數(shù)量增長，高濃度下對氨氧化細菌和氨氧化古菌基因豐度表達和脲酶活性存在顯著抑制。本研究發(fā)現(xiàn)隨著ENR處理濃度梯度上升，培養(yǎng)結(jié)束后氮素累積礦化量呈遞減趨勢，而amoA、nxrA基因豐度卻呈上升趨勢，原因可能是高濃度ENR雖然不會對微生物菌群數(shù)量產(chǎn)生影響，但會通過降低主導氮素礦化的微生物酶活性來抑制氮素礦化。

試驗前3天，僅TCY為100 mg/kg處理組未對氮素礦化產(chǎn)生顯著影響，其余各TCY處理組土樣凈氮礦化速率顯著低于CK處理組。隨著試驗的進行，各TCY處理組對氮素礦化抑制作用均有所增強，其中TCY為100 mg/kg處理組在6～9 d的凈氮礦化速率抑制作用最明顯，抑制率達到45.61%。試驗第9天后，TCY對氮素礦化抑制作用逐漸減弱，各TCY處理組凈氮礦化速率與CK處理組均無顯著差異。TCY對氮素礦化作用的抑制主要體現(xiàn)在對硝化作用的影響上，各TCY處理組土樣硝態(tài)氮含量明顯低于CK處理組。有研究指出TCY對土壤細菌和真菌生長有顯著抑制作用，高濃度TCY可顯著抑制土壤酶活性[22]；張繼旭等[23]研究表明，低濃度TCY對土壤氮素礦化及硝化過程均產(chǎn)生促進；吳穎等[24]研究表明，高濃度TCY可顯著抑制amoA、nxrA基因豐度。本研究也發(fā)現(xiàn)，TCY為100 mg/kg處理組土樣amoA、nxrA基因豐度分別比CK處理組下降了35.35%、52.38%。本研究發(fā)現(xiàn)TCY由25 mg/kg上升至100 mg/kg時，amoA、nxrA基因豐度均顯著降低，說明TCY會對土壤氮素礦化相關的功能微生物菌群數(shù)量產(chǎn)生影響。

試驗3～6 d，CTC為25、50、100 mg/kg處理組土樣硝態(tài)氮含量明顯下降，該階段CTC抑制了硝化作用，隨著試驗時間延長，CTC對硝化的抑制作用立即減弱。試驗結(jié)束時，不同濃度CTC處理對土樣氮素累積礦化量均無顯著影響，這與其他研究結(jié)果不同。易良銀[25]研究發(fā)現(xiàn)，隨著土壤培養(yǎng)時間延長，CTC會顯著抑制土壤礦化過程，不同濃度處理間無顯著差異；袁德梽[26]的研究也表明CTC對土壤礦化存在抑制作用。本研究中外源添加CTC未對土樣累積氮素礦化量產(chǎn)生影響，分析原因可能是本研究使用土樣為施肥土壤，使CTC在土壤中快速降解或被土壤強烈吸附[27]，降低了其對氮素礦化和硝化相關微生物的毒害作用，施肥后土樣中微生物活性較高，對CTC脅迫適應性強，而CTC對氮素礦化影響時間較短暫，導致試驗過程中未能表現(xiàn)出對氮素礦化的影響。

總體看來，不同抗生素對土壤氮素礦化的影響并不相同，ENR、TCY對氮素礦化具有抑制作用，CTC對土壤氮素礦化影響不明顯。ENR、TCY對氮素礦化的抑制強度隨培養(yǎng)時間的延長呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢，且均體現(xiàn)在對硝化作用的影響上，但對氮素礦化及硝化的影響不會持續(xù)存在。從功能基因豐度上看，ENR、TCY對氮素礦化的抑制存在差異，ENR主要通過降低主導氮素礦化的微生物酶活性來抑制氮素礦化，而TCY對相關的功能微生物菌群數(shù)量產(chǎn)生影響。若土壤中有ENR或TCY殘留時，會抑制有機物料的礦質(zhì)氮釋放，可能造成作物減產(chǎn)和品質(zhì)下降。

4 結(jié) 論

(1) 不同抗生素對土壤氮素礦化的影響并不相同。培養(yǎng)試驗結(jié)束時，各ENR處理組及TCY為25～100 mg/kg處理組土樣銨態(tài)氮均明顯低于CK處理組，各ENR處理組及各TCY處理組土樣硝態(tài)氮均明顯低于CK處理組，而各TCT處理組土樣銨態(tài)氮與硝態(tài)氮與CK處理組相差均不明顯。

(2) ENR、TCY對氮素礦化的抑制強度隨培養(yǎng)時間的延長呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢，試驗6～9 d的抑制作用最明顯，第16天后抑制強度減弱，各處理組間無顯著差異，說明抗生素對氮素礦化及硝化的影響不會持續(xù)存在。ENR、TCY對氮素礦化的抑制作用均體現(xiàn)在對硝化作用的影響上。

(3) ENR、TCY對氮素礦化的抑制存在差異，ENR可能主要通過降低主導氮素礦化的微生物酶活性來抑制氮素礦化，而TCY可能主要對相關的功能微生物菌群數(shù)量產(chǎn)生影響。