王倩倩,陸嘉惠,4,*,張 潔,徐 影,徐 可,張迦得,劉登奎

1 石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 石河子 832003 2 綠洲城鎮(zhèn)與山盆系統(tǒng)生態(tài)兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 石河子 832003 3 新疆植物藥資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 石河子 832003 4 石河子大學(xué)甘草研究所， 石河子 832003

土壤微生物主要由土壤細(xì)菌、古生菌和真菌組成,廣泛分布在根際和非根際土壤中,與植物體互惠共生,其多樣性和豐富度對(duì)植物的多樣性,調(diào)節(jié)土壤微環(huán)境和養(yǎng)分循環(huán)等生態(tài)系統(tǒng)功能起著關(guān)鍵作用[1—6]。研究表明,植被可能會(huì)影響土壤的物理和化學(xué)性質(zhì),進(jìn)而影響土壤的細(xì)菌群落和組成[7],同時(shí)微生物的種群結(jié)構(gòu)和代謝產(chǎn)物也可以調(diào)控藥用植物的生長(zhǎng),提高植物的抗性,影響植物的分布[8—9]。

脹果甘草(Glycyrrhizainflata)是《中國(guó)藥典》中記載的三種藥用甘草基原植物之一,野生脹果甘草主要分布于新疆塔里木盆地和東疆吐哈盆地,在甘肅也有少量分布[10—12],其原生境土壤鹽漬化程度較重,表層土壤總體含鹽量較高,在三種藥用甘草中,脹果甘草耐鹽能力最強(qiáng),具有抗寒、抗旱、抗鹽堿等優(yōu)良特性,能有效改良鹽堿地土壤[13],從中提取出的多種化學(xué)成分在制藥和加工材料等方面也有著很高的利用潛力,兼具重要生態(tài)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值[14—16]。

藥用植物原生境土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性特征,是揭示藥用植物、土壤、微生物相互關(guān)系,挖掘土壤中優(yōu)勢(shì)菌群,探尋藥用植物種群分布及道地性形成影響因素的重要依據(jù)。有研究表明,不同生境的黑果枸杞根際與非根際土壤的細(xì)菌、真菌優(yōu)勢(shì)類群(門、屬)的組成以及豐富度存在地區(qū)間差異[17]。孫曉等對(duì)干旱區(qū)沙生藥用植物鎖陽(yáng)的土壤微生物群落研究發(fā)現(xiàn)了不同產(chǎn)區(qū)土壤微生物群落多樣性的差異,并發(fā)掘了5個(gè)共有核心微生物組[18]。目前,已有五味子、細(xì)辛、百合等20種藥用植物研究明確了影響土壤微生物多樣性的因素和土壤微生物與藥用植物的關(guān)系,并篩選了生防菌株[19]。重樓根際土壤研究發(fā)現(xiàn)了重樓根際土壤真菌、根內(nèi)生菌、根莖內(nèi)生菌中的優(yōu)勢(shì)菌群[20]。目前對(duì)藥用甘草土壤微生物的研究主要在烏拉爾甘草內(nèi)生菌的分離和應(yīng)用、根際微生物、叢枝菌根的研究等方面[21—24],缺乏野生脹果甘草原生境土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性的研究,因此在揭示脹果甘草種群分布與土壤微生物關(guān)系、優(yōu)勢(shì)土壤菌群和鹽堿棄耕地修復(fù)機(jī)制、藥材道地性的影響因素方面缺少依據(jù)。

本研究系統(tǒng)、全面地進(jìn)行了野生脹果甘草分布區(qū)的原生境土壤調(diào)查,從脹果甘草5個(gè)主產(chǎn)區(qū)采集原生境土壤,測(cè)定土壤理化指標(biāo),并采用高通量測(cè)序技術(shù),結(jié)合Spearman、dbRDA方法開展以下研究：揭示不同分布區(qū)的微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性特征；發(fā)掘脹果甘草原生境土壤的優(yōu)勢(shì)或特殊真菌、細(xì)菌群落；微生物群落、土壤理化性質(zhì)、物種地理分布相關(guān)性分析。為棄耕鹽堿地的修復(fù)機(jī)制、野生脹果甘草種群恢復(fù)和藥材道地性研究提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 研究區(qū)概況

按照新疆植物志[25]記載的脹果甘草分布區(qū),在新疆阿拉爾、庫(kù)爾勒、哈密、鄯善,甘肅瓜州5個(gè)主產(chǎn)區(qū)(標(biāo)記為Z1—Z5)采集土壤樣本。5個(gè)分布區(qū)均為干旱半干旱荒漠地區(qū),溫帶大陸性氣候,夏季炎熱,冬季寒冷,晝夜溫差大；全年晴天多,光照充足,降水稀少；年降水量?jī)H為35—60 mm,年平均氣溫為8.98—11.67℃。野生脹果甘草伴生植物主要有蘆葦(Phragmitesaustralis)、拂子茅(Calamagrostisepigeios)、駱駝刺(Alhagisparsifolia)、苦豆子(Sophoraalopecuroides)、白刺(Nitrariatangutorum)、檉柳(Tamarixchinensis)、豬毛菜(Salsolacollina)等。

1.2 樣地設(shè)置和樣品采集

土壤采樣點(diǎn)信息見表1,5個(gè)分布區(qū),每個(gè)分布區(qū)設(shè)3個(gè)樣地,共15個(gè)采樣地。每個(gè)采樣地根據(jù)研究區(qū)域脹果甘草生長(zhǎng)狀況、分布特點(diǎn)等差異,按W型每隔50 m選取1個(gè)有脹果甘草均勻分布的樣點(diǎn),共5個(gè)樣點(diǎn)(面積為2 m×2 m),在每樣點(diǎn)按V型選取3個(gè)重復(fù)土樣[26],采集0—30 cm的土壤,將取到的土樣混合置于平鋪的牛皮紙上捏碎混合均勻,按四分法(取對(duì)角線)制成混合土樣后,分裝3份。一份置于鋁盒中用于測(cè)定土壤含水量(Soil Water Content, SWC)和pH值；一份置于密封袋中帶回實(shí)驗(yàn)室自然風(fēng)干后剔出植物根系及石礫等雜物,磨碎,過100目篩,用于測(cè)定土壤有機(jī)碳(Total Organic Carbon, TOC)、總氮(Total Nitrogen, TN)和總含鹽量(Total Dissolved Salts, TDS)。最后一份置于PV離心管中迅速液氮冷凍后保存于-80℃冰箱,用于土壤微生物測(cè)序。

1.3 研究方法

1.3.1 土壤理化性質(zhì)

土壤理化指標(biāo)的測(cè)定采用常規(guī)分析法[27]。土壤含水量(SWC)測(cè)定采用干燥法。土壤pH值用pH計(jì)測(cè)定。土壤有機(jī)碳(TOC)測(cè)定采用重鉻酸鉀容量法。土壤總氮(TN)測(cè)定采用半微量開氏法。土壤總含鹽量(TDS)測(cè)定采用殘?jiān)娓煞ā?/p>

1.3.2 測(cè)序方法

土壤DNA提取、PCR擴(kuò)增和單端測(cè)序均由北京康普森生物技術(shù)有限公司完成。采用 SDS-CTAB 方法對(duì)來(lái)自5個(gè)地區(qū)共計(jì)15個(gè)土壤樣本的基因組 DNA 進(jìn)行提取。利用16S rRNA的保守區(qū)設(shè)計(jì)通用引物擴(kuò)增16S/18S/ITS的區(qū)域。以稀釋后的基因組 DNA 為模板,根據(jù)測(cè)序區(qū)域的選擇,使用帶 Barcode 的特異引物(表2)進(jìn)行擴(kuò)增,得到相應(yīng)的產(chǎn)物。

PCR反應(yīng)體系為Phusion Master Mix (2×)15 μL,Primer (2 μM) 3 μL,gDNA (1 ng/μL) 10 μL, H2O 2 μL。反應(yīng)程序?yàn)?8℃預(yù)變性1 min；30個(gè)循環(huán)(98℃,10 s；50℃,30 s；72℃,30 s) ；72℃,5 min。PCR產(chǎn)物使用2%濃度的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè),剪切回收目標(biāo)條帶。

表1 野生脹果甘草原生境土壤樣品采集點(diǎn)

表2 野生脹果甘草原生境土壤樣品PCR擴(kuò)增引物

新古菌16S： 古菌1106F：真核生物18S： 真菌ITS：文庫(kù)構(gòu)建和上機(jī)測(cè)序：根據(jù)所擴(kuò)增區(qū)域的特點(diǎn),基于IonS5TMXL測(cè)序平臺(tái),利用單端測(cè)序(Single-End)的方法,構(gòu)建小片段文庫(kù)進(jìn)行單端測(cè)序。使用Thermofisher 公司的Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns 建庫(kù)試劑盒進(jìn)行文庫(kù)的構(gòu)建,構(gòu)建好的文庫(kù)經(jīng)過Qubit 定量和文庫(kù)檢測(cè)合格后,使用Thermofisher的Ion S5TMXL上機(jī)測(cè)序。

1.4 數(shù)據(jù)處理

1.4.1 測(cè)序數(shù)據(jù)處理

使用Cutadapt[28](V1.9.1, http://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/)先對(duì)reads進(jìn)行低質(zhì)量部分剪切,再根據(jù)Barcode從得到的reads中拆分出各樣品數(shù)據(jù),截去Barcode和引物序列初步質(zhì)控得到原始數(shù)據(jù)(Raw reads)。經(jīng)過以上處理后得到的Reads需要進(jìn)行去除嵌合體序列的處理,Reads序列通過[29](https://github.com/torognes/vsearch/)與物種注釋數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)檢測(cè)嵌合體序列,并最終去除其中的嵌合體序列[30],得到最終的有效數(shù)據(jù)(Clean Reads)。

1.4.2 OTU聚類和物種注釋

利用Uparse軟件[31](Uparse v7.0.1001,http://www.drive5.com/uparse/)對(duì)所有樣品的全部 Clean Reads 進(jìn)行聚類,默認(rèn)以97%的一致性(Identity)將序列聚類成為OTUs(Operational Taxonomic Units),選取OTUs的代表性序列。對(duì)OTUs序列進(jìn)行物種注釋,用Qiime軟件(Version 1.9.1)中的blast方法(http://qiime.org/scripts/assign_taxonomy.html)[32]與Unit(v7.2)數(shù)據(jù)庫(kù)[33](https://unite.ut.ee/)進(jìn)行物種注釋分析。使用MUSCLE[34](Version 3.8.31,http://www.drive5.com/muscle/)軟件進(jìn)行快速多序列比對(duì),得到所有OTUs序列的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系。最后對(duì)各樣品的數(shù)據(jù)進(jìn)行均一化處理,以樣品中數(shù)據(jù)量最少的為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行均一化處理,后續(xù)的Alpha多樣性分析和Beta多樣性分析都是基于均一化處理后的數(shù)據(jù)。使用R軟件繪制venn圖,Origin、Visio軟件繪制物種相對(duì)豐度柱形圖,并用vcd包 ternaryplot命令進(jìn)行Ternaryplot三元相圖分析。使用ArcMap軟件導(dǎo)入采樣點(diǎn),Visio軟件繪制豐度前三的優(yōu)勢(shì)真菌和細(xì)菌種類圖。

1.4.3 多樣性指數(shù)分析

多樣性指數(shù)顯著差異柱形圖使用Origin、Visio軟件繪制。β多樣性：用Qiime軟件(Version 1.9.1)計(jì)算Unifrac距離,使用R軟件(Version 2.15.3)繪制PCoA圖,PCoA可以通過樣品之間的聚集和分開情況來(lái)判斷群落結(jié)構(gòu)差異度。使用R軟件進(jìn)行Beta多樣性指數(shù)組間差異分析。LEfSe分析使用LEfSe軟件,默認(rèn)設(shè)置LDA Score的篩選值為4。組間差異顯著的物種分析利用R軟件做組間T_test檢驗(yàn)并作圖。

1.4.4 理化性質(zhì)特征和環(huán)境因子關(guān)聯(lián)分析

SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析,Origin軟件、Visio軟件繪制理化性質(zhì)的方差分析柱形圖。在進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析時(shí),首先用R中psych包的corr.test函數(shù)計(jì)算物種和環(huán)境因子的Spearman相關(guān)系數(shù)值并檢驗(yàn)其顯著性,然后用Origin軟件繪制熱圖。使用vegan包中的rda函數(shù)進(jìn)行的排序分析,然后使用非冗余的環(huán)境因子進(jìn)行dbRDA分析。

2 結(jié)果

2.1 土壤真菌和細(xì)菌OTU水平分析

過濾出低質(zhì)量和短序列reads后,ITS測(cè)序共得到1129760條cleanreads,有效序列的平均長(zhǎng)度為244bp。16S測(cè)序共得到1201313條reads,有效序列的平均長(zhǎng)度為253bp。得到有效數(shù)據(jù)后進(jìn)行OTUs聚類。圖1中顯示,Z1—Z5通用的真菌OTUs為524個(gè),特有的真菌OTUs數(shù)分別為248、199、154、177和201個(gè)。Z1—Z5共有的細(xì)菌OTUs為1813個(gè),特有的細(xì)菌OTUs數(shù)分別為1295、1058、567、785和802個(gè)。

圖1 脹果甘草土壤真菌和細(xì)菌基于OTUs的維恩圖Fig.1 Soil fungi and bacteria of Glycyrrhiza inflata are based on the Venn diagram of OTUsOTUs：Operational taxonomic units可操作分類單元；Z1：采集地新疆阿拉爾；Z2：采集地新疆庫(kù)爾勒；Z3：采集地新疆哈密；Z4：采集地新疆鄯善；Z5：采集地甘肅瓜州

2.2 微生物群落組成

根據(jù)物種注釋結(jié)果,脹果甘草分布區(qū)土壤樣品中真菌和細(xì)菌群落屬水平上的組成結(jié)構(gòu)和相對(duì)豐度排名前十的物種如圖2所示。真菌中,優(yōu)勢(shì)物種為曲霉菌屬(Aspergillus)、地絲霉屬(Geomyces)、鐮刀菌屬(Fusarium)。其中,相對(duì)豐度值最高的為曲霉菌屬(Aspergillus),在各分布區(qū)均有分布,但豐度不同,在Z3.2、Z3.3、Z4.1地區(qū)的相對(duì)豐度明顯高于其他地區(qū)。細(xì)菌中,優(yōu)勢(shì)物種為寡氧單胞菌屬(Stenotrophomonas)、Marinimicrobium、Idiomarina。其中,Marinimicrobium在Z1.1地區(qū)的相對(duì)豐度明顯高于其他地區(qū)。Idiomarina在Z1.3地區(qū)的相對(duì)豐度明顯高于其他地區(qū)。

圖2 脹果甘草土壤中屬水平的真菌和細(xì)菌的相對(duì)豐度Fig.2 Relative abundance of fungi and bacteria at the genus level in the soil of Glycyrrhiza inflataOthers：所有其他屬的相對(duì)豐度之和；Aporospora：Aporospora屬；Gymnoascus：裸子囊菌屬；Scleroderma：硬皮馬勃屬；Inocybe：絲蓋傘屬；Penicillium：青霉屬；Geopora：地孔菌屬；Alternaria：鏈格孢屬；Fusarium：鐮刀菌屬；Geomyces：地絲霉屬；Aspergillus：曲霉菌屬；Sphingomonas：鞘氨醇單胞菌屬；Salegentibacter：需鹽桿菌屬；Proteus：變形桿菌屬；Streptomyces：鏈霉菌屬；Salinimicrobium：Salinimicrobium屬；Aliifodinibius：Aliifodinibius屬；Halomonas：嗜鹽單胞菌屬；Idiomarina：Idiomarina屬；Marinimicrobium：Marinimicrobium屬；Stenotrophomonas：寡養(yǎng)單胞菌屬

通過對(duì)調(diào)查數(shù)據(jù)匯總及分析,將5個(gè)地區(qū)采樣地微生物豐度為前三的優(yōu)勢(shì)屬的類群進(jìn)行了統(tǒng)計(jì),如圖3所示。5個(gè)地區(qū)采樣地豐度前三的真菌屬均有鐮刀菌屬(Fusarium)。庫(kù)爾勒地區(qū)、哈密地區(qū)和鄯善地區(qū)的豐度前三的真菌屬種類相同,為曲霉菌屬(Aspergillus)、鐮刀菌屬(Fusarium)、鏈格孢屬(Alternaria),哈密地區(qū)、鄯善地區(qū)和瓜州地區(qū)的豐度前三的細(xì)菌屬種類相同,為嗜鹽單胞菌屬(Halomonas)、Salinimicrobium、鏈霉菌屬(Streptomyces)。

圖3 脹果甘草采樣點(diǎn)及豐度前三大屬的優(yōu)勢(shì)真菌和細(xì)菌種類Fig.3 Dominant fungi and bacteria species of Glycyrrhiza inflata sampling sites and the first three genera in abundance

LEfSe統(tǒng)計(jì)結(jié)果分析顯示,大部分真菌種類相似,個(gè)別菌種有差異,Z1、Z3組中真菌物種無(wú)差異顯著,故此組缺失。Z2地區(qū)的小子囊菌科支頂孢屬的煙曲霉菌(Aspergillusfumigatus),Z4地區(qū)的鏈格孢屬(Alternariaatra),Z5地區(qū)的帚霉屬布朗氏帚霉(Scopulariopsisbrumptii)是具有顯著差異的真菌。部分細(xì)菌種類有差異,其中,Z2、Z4組中細(xì)菌物種無(wú)差異顯著,故此組缺失。Z1地區(qū)的Idiomarins,Z3地區(qū)的鏈霉菌屬(Streptomyces)、考克氏菌屬(Kocuria),Z5地區(qū)的芽孢桿菌科(Bacillaceae)是具有顯著差異的物種。

圖4 脹果甘草土壤真菌和細(xì)菌的LDA值進(jìn)化分支圖和分布柱狀圖Fig.4 Evolutionary clade and distribution histogram of LDA values of soil fungi and bacteria of Glycyrrhiza inflataLDA：線性判別分析 Linear discriminant analysis;p：門;c：綱;o：目;f：科;g：屬;s：種;Scopulariopsis：帚霉屬;brumptii：布朗氏;atra：atra種;Microascales：小囊菌目;Microascaceae：小囊菌科;fumigatus：煙曲霉;Acremonium：枝頂孢屬;Bacillales：芽孢桿菌目;Bacillaceae：芽孢桿菌科;Actinobacteria：放線菌門;unidentified：未確定的;Micrococcales：微球菌目;Streptomycetaceae：鏈霉菌科;Streptomycetales：鏈霉菌目;Micrococcaceae：微球菌科;Cytophagales：噬纖維菌目;Kocuria：考克氏菌屬;Poteobacteria：變形菌門;Gammaproteobacteria：伽馬變形菌綱;在進(jìn)化分支圖中,由內(nèi)向外輻射的圓圈代表了從門到屬(或種)的分類等級(jí),小圓圈的直徑與相對(duì)豐度大小成正比;LDA值分布柱狀圖顯示LDA得分大于設(shè)定值(默認(rèn)設(shè)置為4)的物種,即組間具有統(tǒng)計(jì)差異的生物標(biāo)記物;無(wú)顯著差異的物種統(tǒng)一著色為黃色,差異物種Biomarker跟隨組進(jìn)行著色,若圖中某一組缺失,則表明此組中并無(wú)差異顯著的物種,故此組缺失

2.3 生物多樣性分析

2.3.1 α多樣性

脹果甘草原生境真菌和細(xì)菌的豐富度和多樣性指數(shù)的顯著性檢驗(yàn)(圖5)顯示,細(xì)菌的香農(nóng)、Chao1、ACE指數(shù)均無(wú)顯著差異。細(xì)菌Chao1指數(shù)平均值均大于真菌,表明細(xì)菌的OTU數(shù)均多于真菌。在真菌中,Z2庫(kù)爾勒地區(qū)的香農(nóng)指數(shù)平均值最高,Z1阿拉爾地區(qū)最低,表明庫(kù)爾勒地區(qū)真菌群落的多樣性最高,阿拉爾地區(qū)最低。Z5瓜州地區(qū)ACE指數(shù)平均值最高,Z1阿拉爾地區(qū)最低,表明瓜州地區(qū)真菌群落的豐富度最高,阿拉爾地區(qū)最低。阿拉爾地區(qū)的真菌、細(xì)菌香農(nóng)指數(shù)均低,表明本地區(qū)微生物多樣性最低。

圖5 野生脹果甘草原生境土壤樣品微生物豐富度和多樣性指數(shù)的顯著性檢驗(yàn)(P<0.05)Fig.5 Microbial richness and diversity index of soil samples inwild Glycyrrhiza inflata habitat(P<0.05)

2.3.2 β多樣性

基于Unweighted unifrac距離的主坐標(biāo)分析(圖6)和Adonis分析(表3)顯示,真菌的組成結(jié)構(gòu)在Z1與Z4；Z1與Z5；Z2與Z4；Z4與Z5組間差異顯著,在Z1與Z2；Z1與Z3；Z2與Z3；Z2與Z5；Z3與Z4組間差異不顯著。細(xì)菌的組成結(jié)構(gòu)在Z1與Z2；Z1與Z3；Z1與Z4；Z1與Z5；Z2與Z3；Z2與Z5組間差異顯著,在Z2與Z4；Z3與Z4；Z3與Z5；Z4與Z5組間差異不顯著。

圖6 基于Unweighted unifrac距離的脹果甘草土壤真菌和細(xì)菌群落的主坐標(biāo)分析Fig.6 PCoA of soil fungus and bacteria communities in Glycyrrhiza inflata based on Unweighted unifrac distancePCoA：主坐標(biāo)分析 Principal co-ordinates analysis；PC：主成分 Principal component

2.4 土壤理化性質(zhì)特征

土壤理化性質(zhì)方差分析如圖7所示。不同分布區(qū)除土壤pH無(wú)顯著差異外,土壤含水量SWC、總鹽量TDS、有機(jī)碳TOC、總氮TN均有顯著差異。Z1地區(qū)含水量最高,Z2地區(qū)含水量次之,Z3、Z4、Z5最低,說明由新疆阿拉爾地區(qū)至甘肅瓜州地區(qū),隨著經(jīng)度升高,土壤含水量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。土壤總含鹽量隨著經(jīng)度的升高呈現(xiàn)出先升高再降低的趨勢(shì),其中Z2庫(kù)爾勒地區(qū)土壤總含鹽量最高,與Z1、Z4、Z5地區(qū)差異顯著。Z2、Z4地區(qū)的土壤有機(jī)碳含量最高,Z1地區(qū)最低,地區(qū)差異顯著。全氮的含量與土壤有機(jī)碳趨勢(shì)相同。Z1地區(qū)的土壤有機(jī)碳和土壤全氮量均為最低,說明Z1地區(qū)的土壤肥力最低。

圖7 脹果甘草分布區(qū)土壤理化性質(zhì)方差分析Fig.7 Analysis of variance histogram of soil physical and chemical properties in distribution area of Glycyrrhiza inflata不同小寫字母表示不同處理之間差異顯著(P< 0.05)

2.5 微生物組成與環(huán)境因子關(guān)聯(lián)分析

屬水平的Spearman相關(guān)分析(圖8)結(jié)果表明,不同種類的微生物與環(huán)境因子之間存在正相關(guān)或負(fù)相關(guān)關(guān)系。在真菌中,含鹽量與裸子囊菌屬(Gymnoascus)、Aporospora呈極顯著正相關(guān)。含水量與鐮刀菌屬(Fusarium)、青霉屬(Penicillium)呈極顯著負(fù)相關(guān)。有機(jī)碳與絲蓋傘屬(Inocybe)、硬皮馬勃屬(Scleroderma)呈極顯著負(fù)相關(guān)。全氮與硬皮馬勃屬(Scleroderma)呈極顯著負(fù)相關(guān)。在細(xì)菌前10屬中,pH與Marinnimicrobium呈極顯著正相關(guān),與鏈霉菌屬(Streptomyces)顯著負(fù)相關(guān)。含鹽量與6個(gè)屬的細(xì)菌呈極顯著正相關(guān),分別為Marinimicrobium、Idiomarina、嗜鹽單胞菌屬(Halomonas)、Aliifodinibius、Salinimicrobium、需鹽桿菌屬(Salegentibacter)；與2個(gè)屬的細(xì)菌呈極顯著負(fù)相關(guān),分別為鏈霉菌屬(Streptomyces)和鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)。含水量與Marinnimicrobium,Idiomarina和需鹽桿菌屬(Salegentibacter)呈極顯著正相關(guān),與鏈霉菌屬(Streptomyces)呈極顯著負(fù)相關(guān)。

圖8 脹果甘草土壤中豐度前十的屬真菌、細(xì)菌的Spearman相關(guān)性分析熱圖Fig.8 Spearman correlation analysis heat map of the top ten abundance soil fungi and bacteria in the soil of Glycyrrhiza inflata垂直方向是環(huán)境因子信息,水平方向是物種信息,熱圖對(duì)應(yīng)的是斯皮爾曼相關(guān)系數(shù)r的值,介于-1,1之間;r<0為負(fù)相關(guān),r>0為正相關(guān)

冗余分析(圖9)表明,在真菌中,含水量是與群落分布相關(guān)程度最大的因子,含鹽量是第二重要的環(huán)境因子；在細(xì)菌中,含水量是與群落分布相關(guān)程度最大的因子,而有機(jī)碳是第二重要的環(huán)境因子。土壤含水量均對(duì)真菌和細(xì)菌群落分布影響大,而總含鹽量只對(duì)土壤中真菌群落分布影響大,對(duì)細(xì)菌群落分布影響小。

圖9 環(huán)境因子與土壤真菌、 細(xì)菌在屬水平的冗余分析Fig.9 Redundant analysis of environmental factors and soil fungi and bacteria at the genus leveldbRDA：基于距離的冗余分析 Distance-based redundancy analysis；土壤理化性質(zhì)用箭頭表示,連接箭頭的長(zhǎng)度表示一個(gè)理化因子與微生物群落分布的相關(guān)程度

2.6 分布區(qū)內(nèi)生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性的差異

本研究中,阿拉爾、哈密地區(qū)的采樣點(diǎn)包括鹽堿荒漠、鹽堿棄耕地和林下不同生境,通過三元相圖可直觀查看采樣點(diǎn)內(nèi)三組樣本在屬水平上優(yōu)勢(shì)物種的差異,揭示鹽堿地土壤微生物結(jié)構(gòu)多樣性特征,挖掘鹽堿地特殊菌群。如圖10所示,阿拉爾地區(qū)和哈密地區(qū)的土壤真菌在鹽堿荒漠生境(Z1.3、Z3.1)豐度最低,而在林下農(nóng)田邊(Z1.1和Z1.2；Z3.2,Z3.3)豐度高；哈密地區(qū)的真菌僅有曲霉屬(Aspergillus)豐度較高。Z1.2、Z3.1的土壤細(xì)菌豐度低,但I(xiàn)diomarina在Z1.3豐度較高；Marinimicrobium在Z1.1豐度較高,呈現(xiàn)出鹽堿地和非鹽堿地土壤優(yōu)勢(shì)細(xì)菌種類不同。

圖10 真菌、細(xì)菌屬水平上豐度排名前10的三元相圖Fig.10 Ternaryplot of fungi and bacteria at genus level圖中3個(gè)頂點(diǎn)代表3個(gè)樣本分組,圓圈代表物種,圓圈大小和相對(duì)豐度成正比,圓圈離哪一頂點(diǎn)越接近,表示此物種在這個(gè)分組中含量越高

表3 組間Adonis分析

3 討論

3.1 土壤優(yōu)勢(shì)微生物

本研究中,物種注釋結(jié)果表明,曲霉屬 (Aspergillus)、地絲霉屬(Geomyces)、鐮刀菌屬(Fusarium)為屬水平上脹果甘草原生境土壤的優(yōu)勢(shì)真菌。烏拉爾甘草的內(nèi)生真菌研究中發(fā)現(xiàn),曲霉屬(Aspergillus)和鐮刀菌屬(Fusarium)為優(yōu)勢(shì)真菌[35—36],本研究脹果甘草原生境中也存在這兩個(gè)優(yōu)勢(shì)菌群,說明同屬藥用甘草原生境土壤中優(yōu)勢(shì)菌群和內(nèi)生菌有相似性。遼寧藥用植物研究[19]從14種藥用植物土壤中分離真菌,發(fā)現(xiàn)鐮刀菌屬(Fusarium)在14種藥用植物土壤中均可分離得到,說明Fusarium屬真菌在一些藥用植物的土壤中具有普遍性。本研究在野生脹果甘草原生境土壤中分離出曲霉屬,潘爭(zhēng)艷等在五味子土壤中也分離出曲霉屬,說明曲霉屬真菌的來(lái)源廣泛。不止如此,曲霉屬真菌次生代謝產(chǎn)物多樣,近年來(lái)也有新類型的發(fā)現(xiàn),具有進(jìn)一步研究的價(jià)值[37—38]。

寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)、Marinimicrobium、Idiomarina為脹果甘草原生境土壤的屬水平上的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌。黃芪、人參等藥用植物的土壤中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌為土壤桿菌(Agrobacterium)、芽孢桿菌(Bacillus)、假單胞菌(Pseudomonas),本研究結(jié)果與之不同[19]。其中,寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)細(xì)菌中能夠提取出paritriside A等多種次生代謝產(chǎn)物,此屬資源豐富,其次生代謝產(chǎn)物的利用具有重要的價(jià)值[39]。

通過比較土壤中優(yōu)勢(shì)真菌群落,我們發(fā)現(xiàn),真菌和細(xì)菌豐度低的地區(qū)生境為鹽堿荒漠或棄耕鹽堿地；真菌和細(xì)菌豐度均較高的地區(qū),生境類型為林下和農(nóng)田邊。結(jié)合土壤理化性質(zhì)及dbRDA分析,認(rèn)為這可能與鹽堿棄耕地的低含水量有關(guān)。另外,含有鏈格孢屬(Alternaria)真菌和鏈霉菌屬(Streptomyces)細(xì)菌的地區(qū),生境均為林下。其中,鏈霉菌屬(Streptomyces)是具有應(yīng)用前景的生防菌株。在優(yōu)勢(shì)細(xì)菌中,Idiomarina屬在鹽堿生境中含量豐富,有研究表明,所有的Idiomarina屬物種都是從鹽堿地環(huán)境中分離出來(lái)的,本屬細(xì)菌的部分種可能具有在生物技術(shù)和工業(yè)應(yīng)用中生產(chǎn)蛋白酶的潛力[40]。

眾多研究表明,微生物肥料的利用,對(duì)土壤荒漠化、鹽漬化的治理有重要的價(jià)值。因此,對(duì)原生境特殊和優(yōu)勢(shì)土壤微生物的利用有望對(duì)野生甘草種群恢復(fù)提供幫助,同時(shí),也有助于脹果甘草野生馴化和栽培種植。

3.2 影響微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性的土壤理化因子

本研究調(diào)查涉及的樣點(diǎn),由新疆天山南麓阿拉爾地區(qū)至甘肅省河西走廊西部的瓜州縣,緯度跨越不大,但經(jīng)度相差15度,海拔梯度較大,落差接近800m。因此,經(jīng)度和緯度梯度上,土壤微生物結(jié)構(gòu)多樣性特征具有較大的空間分布異質(zhì)性。相關(guān)研究均表明,土壤微生物的豐度、菌群組成與土壤的pH值、含水量、有機(jī)質(zhì)含量等物理化學(xué)性質(zhì)密切相關(guān),其中,土壤含水量和鹽度是關(guān)鍵因素[41—46]。本研究結(jié)果也表明野生脹果甘草分布區(qū)土壤微生物結(jié)構(gòu)多樣性特征的空間分布異質(zhì)性,主要與分布區(qū)土壤的理化性質(zhì)有關(guān),尤其是水、鹽因子。

有研究表明,土壤含水量在0—15%范圍內(nèi)時(shí),干旱半干旱區(qū)土壤細(xì)菌、真菌群落的多樣性與土壤含水量呈顯著正相關(guān)關(guān)系[47]。本研究結(jié)果顯示脹果甘草原生境含水量與曲霉屬(Aspergillus)、鐮刀菌屬(Fusarium)、鏈格孢屬(Alternaria)、青霉屬(Penicillium)真菌呈顯著負(fù)相關(guān)；與Marinnimicrobium,Idiomarina、Aliifodinibius和需鹽桿菌屬(Salegentibacter)細(xì)菌呈顯著正相關(guān),與鏈霉菌屬(Streptomyces)細(xì)菌呈顯著負(fù)相關(guān)。其中,青霉屬和曲霉屬真菌,能夠產(chǎn)生多種次生代謝產(chǎn)物,具有抗菌、抗腫瘤、抗氧化等作用[48—49]。

脹果甘草原生境土壤總含鹽量,與曲霉屬(Aspergillus)、裸子囊菌屬(Gymnoascus)、Aporospora真菌呈顯著正相關(guān),與鐮刀菌屬(Fusarium)、絲蓋傘屬(Inocybe)、硬皮馬勃屬(Scleroderma)真菌呈顯著負(fù)相關(guān)；總鹽含量與Marinimicrobium、Idiomarina、嗜鹽單胞菌屬(Halomonas)、Aliifodinibius、Salinimicrobium、需鹽桿菌屬(Salegentibacter)這6種細(xì)菌的豐富度存在顯著正相關(guān)關(guān)系,與鏈霉菌屬(Streptomyces)和鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)細(xì)菌呈顯著負(fù)相關(guān)。細(xì)菌Marinimicrobium、Idiomarina、Salinimicrobium為20年內(nèi)發(fā)現(xiàn)的新屬,現(xiàn)有研究較少；而嗜鹽單胞菌屬(Halomonas)、Aliifodinibius、需鹽桿菌屬(Salegentibacter)均為嗜鹽細(xì)菌,原生境中豐富度高的嗜鹽細(xì)菌可能與脹果甘草的鹽適應(yīng)和耐鹽機(jī)制有密切關(guān)系。嗜鹽細(xì)菌能夠產(chǎn)生活性物質(zhì)、胞外多糖和各種酶可以在高鹽、高pH值情況下發(fā)揮作用[50],對(duì)鹽堿地的治理有重要的作用。因此,以上高豐度的嗜鹽單胞菌屬(Halomonas)、Aliifodinibius、需鹽桿菌屬(Salegentibacter)嗜鹽細(xì)菌的發(fā)現(xiàn),有助于利用耐鹽堿微生物改良土壤鹽堿環(huán)境,修復(fù)土壤功能,對(duì)野生脹果甘草種群恢復(fù)和鹽堿棄耕地修復(fù)具有重要價(jià)值,值得后續(xù)研究。

另外,野生脹果甘草土壤真菌和細(xì)菌空間分布的異質(zhì)性也與生境類型有關(guān)。本研究中Z1.3地區(qū)真菌豐度低,Z3.1地區(qū)真菌和細(xì)菌豐度均低,可能與其鹽堿生境有關(guān)。通常認(rèn)為,碳源充足的地區(qū)中,土壤微生物的種類較豐富[51]。本研究中,林下、農(nóng)田邊生境中的植物根系及凋落物較鹽堿地、棄耕地多,土壤中碳源更加豐富,因此土壤微生物種類豐富；但有機(jī)碳對(duì)脹果甘草原生境土壤的真菌群落和細(xì)菌群落的影響并不相同,對(duì)真菌影響小,對(duì)細(xì)菌影響大,其影響機(jī)制值得進(jìn)一步研究。

3.3 地理環(huán)境影響微生物分布

圖4顯示,哈密地區(qū)和鄯善地區(qū)的豐度前三屬真菌種類相同,哈密、鄯善、瓜州地區(qū)豐度前3屬的細(xì)菌種類相同,3個(gè)地區(qū)均為溫帶大陸性干旱氣候,光照豐富,日照充沛,晝夜溫差大,適宜脹果甘草生長(zhǎng),且都是脹果甘草單獨(dú)分布區(qū),說明優(yōu)勢(shì)微生物的種類與地理環(huán)境密切相關(guān)。

野生脹果甘草主要分布于新疆,另有少量分布于甘肅。在新疆分布在塔里木盆地和東疆吐哈盆地的鹽堿荒漠草甸,在甘肅分布在河西走廊的干旱半干旱地帶[14,52]。本研究樣點(diǎn)由新疆天山南麓塔克拉瑪干沙漠北沿至甘肅河西走廊西端,覆蓋了野生脹果甘草的分布區(qū)域,新疆阿拉爾、庫(kù)爾勒位于南疆,哈密、鄯善位于東疆,瓜州地區(qū)位于甘肅西北部,沿甘肅向東南,根據(jù)我們野外調(diào)查和采集,發(fā)現(xiàn)原植物志記載的脹果甘草分布區(qū),已采集不到野生脹果甘草。這可能與近幾十年來(lái)新疆和甘肅河西地區(qū)氣溫升高,降水量增加的變化[53—54]有關(guān)。土壤鹽分的動(dòng)態(tài)變化受氣溫和降水的變化的影響,而鹽分是對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)影響很大的因素,能夠通過改變土壤肥力影響微生物群落的生長(zhǎng)環(huán)境[55],因此,地理環(huán)境也是影響土壤微生物結(jié)構(gòu)和多樣性的重要因素。

4 結(jié)論

本研究挖掘出野生脹果甘草原生境土壤中優(yōu)勢(shì)真菌和細(xì)菌,并發(fā)現(xiàn)不同分布區(qū)真菌和細(xì)菌的多樣性和豐富度的差異。野生脹果甘草原生境土壤真菌和細(xì)菌的空間分布異質(zhì)性與土壤的含水量、總含鹽量密切相關(guān),也與野生脹果甘草的生境類型、地理環(huán)境相關(guān)。

另外,本研究中發(fā)現(xiàn)嗜鹽細(xì)菌嗜鹽單胞菌屬(Halomonas)、Aliifodinibius、需鹽桿菌屬(Salegentibacter),有研究表明這些細(xì)菌能夠產(chǎn)生活性物質(zhì)、胞外多糖和各種酶,因此我們推測(cè)其在改良土壤鹽堿環(huán)境,修復(fù)土壤功能的方面可能具有作用,該發(fā)現(xiàn)對(duì)野生脹果甘草種群恢復(fù)和鹽堿棄耕地修復(fù)具有重要價(jià)值,為土壤微生物的利用方面提供了新的視角。