HPLC雙波長法同時(shí)測定金烏骨通膠囊中3種成分

史 娟，陳 貴，盧婭玲，安 軍，張 華，鄧言歡，吳 征

(黔南州檢驗(yàn)檢測院，貴州 都勻 558000)

金烏骨通膠囊來源于傳統(tǒng)苗藥，由葛根、淫羊藿、補(bǔ)骨脂等十味中藥組成，功效為滋補(bǔ)肝腎、活血通絡(luò)、祛風(fēng)除濕，用于治療骨質(zhì)疏松、肝腎不足等癥[1-2]。金烏骨通膠囊現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中含量測定指標(biāo)為葛根素，缺少淫羊藿及補(bǔ)骨脂有效成分的含量控制。淫羊藿苷是淫羊藿中主含的黃酮類有效成分，補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素是補(bǔ)骨脂中主含的香豆素類有效成分，3種成分均作為含量測定指標(biāo)廣泛應(yīng)用于相應(yīng)藥材及其制劑的質(zhì)量控制，其中淫羊藿苷具有促進(jìn)雌性激素合成、調(diào)節(jié)血脂、保護(hù)受損神經(jīng)元等作用，補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素具有促進(jìn)骨生長和雌激素樣作用[3-6]。在報(bào)道的金烏骨通膠囊淫羊藿苷、補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素三種成分含量測定研究中，由于采用甲醇-水系統(tǒng)作為流動(dòng)相，補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素出峰較快，不能和其他成分較好分離[7]。本文采用乙腈-水系統(tǒng)作為流動(dòng)相，雙波長法同時(shí)測定金烏骨通膠囊中淫羊藿苷、補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的含量，各成分均有較好的響應(yīng)值，且分離度良好，為金烏骨通膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

1260Ⅱ型高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；AG135型電子天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)；DK-98-ⅡA型恒溫水浴鍋(天津市泰斯特公司)；SK250LHC型超聲儀(上?？茖?dǎo)公司)。

1.2 材料

對照品：淫羊藿苷(批號(hào)：110737-202017，以98.1%計(jì))，補(bǔ)骨脂素(批號(hào)：110739-201918，以99.6%計(jì))，異補(bǔ)骨脂素(批號(hào)：110738-202016，以99.4%計(jì))，均購于中國食品藥品檢定研究院；15批次金烏骨通膠囊樣品來源于藥品評價(jià)性抽檢，生產(chǎn)廠家為貴州盛世龍方制藥股份有限公司，具體信息見表1；狗脊、烏梢蛇、葛根、淫羊藿、木瓜、姜黃、威靈仙等陰性對照用飲片購于都勻市湘君大藥房，土牛膝、土黨參、補(bǔ)骨脂藥材由藥企提供，經(jīng)黔南州檢驗(yàn)檢測院陳貴主任藥師鑒定為正品，缺補(bǔ)骨脂和缺淫羊藿陰性對照樣品的制備參照金烏骨通膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的處方和制法；乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑為分析純。

表1 樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用安捷倫Eclipse Plus C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；以乙腈-水(25∶75)為流動(dòng)相；柱溫：20 ℃；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣10 μL；雙波長檢測：246 nm(用于兩種補(bǔ)骨脂素檢測)和270 nm(用于淫羊藿苷檢測)。

2.2 各溶液制備

2.2.1 對照品貯備液的制備 分別精密稱取3種對照品，用甲醇溶解并定容成每1 mL中含淫羊藿苷1 516.6 μg、補(bǔ)骨脂素1 257.0 μg和異補(bǔ)骨脂素1 529.8 μg的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 取適量的金烏骨通膠囊內(nèi)容物，研細(xì)，取約1 g，精密稱定，精密加入甲醇25 mL，稱定重量，置于水浴上回流30 min，放冷，再稱定重量，減失的重量用甲醇補(bǔ)足，濾過，取續(xù)濾液即得。

2.2.3 陰性供試溶液的制備 按處方組成及生產(chǎn)工藝，分別制備缺補(bǔ)骨脂和缺淫羊藿的兩種陰性供試品，照“2.2.2”項(xiàng)下方法分別制備相應(yīng)的陰性供試品溶液。

2.3 專屬性及系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

取“2.2.2”和“2.2.3”項(xiàng)下3種溶液及“2.4”項(xiàng)下定容至50 mL的混合對照品溶液，照“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣。結(jié)果表明供試品色譜圖中顯示與對照品相同保留時(shí)間的色譜峰，峰形較好，與相鄰峰分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)按3種成分計(jì)算均大于6 000，陰性對檢測沒有產(chǎn)生干擾。HPLC色譜見圖1。

注：A.混合對照品(270 nm)；B.混合對照品(246 nm)；C.金烏骨通膠囊樣品(270 nm)；D.金烏骨通膠囊樣品(246 nm)；E.缺淫羊藿陰性對照(270 nm)；F.缺補(bǔ)骨脂陰性對照(246 nm)；1.淫羊藿苷；2.補(bǔ)骨脂素；3.異補(bǔ)骨脂素。

2.4 線性關(guān)系考察

分別取“2.2.1”項(xiàng)下的混合對照品貯備液1 mL置于10、25、50、100和200 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，得到5個(gè)濃度對照品溶液。取上述溶液按照“2.1”項(xiàng)下條件分別進(jìn)樣測定，以各對照品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)、其對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)(Y)作線性回歸，結(jié)果見表2。

表2 3種成分線性關(guān)系

2.5 精密度試驗(yàn)

取“2.4”項(xiàng)下定容至50 mL的混合對照品溶液，照“2.1”項(xiàng)下條件重復(fù)進(jìn)樣測定6次，結(jié)果淫羊藿苷、補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素3種成分峰面積的RSD分別為0.06%、0.12%和0.05%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取金烏骨通膠囊樣品(批號(hào)：210117)，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，照“2.1”項(xiàng)下條件分別測定供試品制備后0、2、4、6、8和12 h的含量，結(jié)果測得淫羊藿苷、補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素3種成分含量的RSD分別為1.85%、0.39%和0.68%，表明供試品溶液在制備后12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取金烏骨通膠囊樣品(批號(hào)：210117)，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制得6份重復(fù)性試驗(yàn)用溶液，照“2.1”項(xiàng)下條件測定，結(jié)果測得淫羊藿苷、補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素3種成分含量平均值分別為0.609 mg/g、0.557 mg/g和0.757 mg/g，RSD分別為0.93%、0.18%和0.29%，表明方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

分別精密稱取3種對照品(淫羊藿苷10.09 mg、補(bǔ)骨脂素9.29 mg、異補(bǔ)骨脂素12.42 mg)置于500 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋制得加樣回收用貯備液。取適量的金烏骨通膠囊(批號(hào)：210117)樣品研細(xì)，精密稱取6份，每一份0.5 g，分別精密加上述加樣回收用貯備液15 mL，再分別精密加甲醇10 mL，稱重后回流提取30 min，放冷后再稱重，減失的重量用甲醇補(bǔ)足，濾過，取續(xù)濾液照“2.1”項(xiàng)下條件測定，分別計(jì)算3種成分的加樣回收率。結(jié)果見表3。

表3 3種成分加樣回收率測試結(jié)果 (n=6)

2.9 樣品測定

分別取不同批次的金烏骨通膠囊樣品，每批次稱取2份，供試品溶液按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備，再按照“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣，采用外標(biāo)法計(jì)算，3種成分含量測定結(jié)果見表4。

表4 15批次金烏骨通膠囊樣品中淫羊藿苷等3種成分的含量測定結(jié)果

3 討論

3.1 檢測波長選擇

實(shí)驗(yàn)在線采集淫羊藿苷等3種成分在200～400 nm范圍內(nèi)的吸收光譜，結(jié)果淫羊藿苷在270 nm、兩種補(bǔ)骨脂素在246 nm處有最大吸收，在各自最大吸收波長處，各成分均有較好的響應(yīng)值，且與相鄰成分均有效分離，因此采用246 nm和270 nm雙波長進(jìn)行測定。

3.2 流動(dòng)相選擇

實(shí)驗(yàn)分別考察了甲醇-水(55∶45)和乙腈-水(30∶70)[8-10]作為流動(dòng)相對3種成分分離的影響，結(jié)果在兩種流動(dòng)相條件下分離效果均不理想，但后者略優(yōu)于前者，當(dāng)把流動(dòng)相調(diào)整為乙腈-水(25∶75)時(shí)，3種成分均得到有效分離。

3.3 提取條件選擇

實(shí)驗(yàn)對提取條件進(jìn)行考察，分析不同條件對3種成分提取的影響。提取方式考察超聲和回流提取，提取溶劑考察稀乙醇、70%甲醇和甲醇，結(jié)果3種溶劑在回流條件下均有較好提取，其中以甲醇效果最好。然后考察甲醇的用量(25 mL和50 mL)以及回流的時(shí)間(15 min、30 min、4 min和60 min)，結(jié)果使用25 mL和50 mL溶劑提取無顯著差異，回流30 min可達(dá)到3種成分的有效提取，因此提取條件選擇用25 mL甲醇回流提取30 min。

3.4 方法耐用性

實(shí)驗(yàn)考察3種色譜柱[Agilent Eclipse Plus C18、Waters Atlantis?T3 C18、太瑋JADE-PAK?KP C18，規(guī)格均為(250 mm×4.6 mm，5 μm)]和4種不同柱溫(20 ℃、25℃、30 ℃和35 ℃)對樣品中各成分檢測的影響。結(jié)果Agilent C18柱在20 ℃、25 ℃、30 ℃，Waters C18柱在20 ℃、25 ℃、30 ℃，太瑋C18柱在20 ℃、25 ℃時(shí)，各成分與相鄰峰均達(dá)到基線分離，因此建議柱溫設(shè)定在20～25 ℃。

4 結(jié)語

從含量測定結(jié)果來看，15批次金烏骨通膠囊樣品中淫羊藿苷含量范圍為0.509～1.323 mg/g，平均值為0.720 mg/g；兩種補(bǔ)骨脂素總含量的范圍為0.930～1.588 mg/g，平均值為1.286 mg/g，以平均值下浮30%確定含量限度，建議本品每1 g含淫羊藿苷不得低于0.50 mg，含兩種補(bǔ)骨脂素的總量不得低于0.90 mg，15批次樣品測定結(jié)果均高于擬定的含量限度。本實(shí)驗(yàn)建立的HPLC方法分離效果好，方法耐用，可應(yīng)用于金烏骨通膠囊的質(zhì)量控制。