秦聖樂(lè)王玉濤蔡雪君王新華楊子峰

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院,廣州呼吸健康研究院,呼吸疾病國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣州 510182)

新冠疫情已在世界范圍大流行,死亡人數(shù)超過(guò)520 萬(wàn), SevereAcuteRespiratorySyndrome Coronavirus 2(SARS-CoV-2)是一種新型的人類感染性β 冠狀病毒[1]。 迄今為止,已發(fā)現(xiàn)7 種冠狀病毒可引起人類呼吸道疾病。 冠狀病毒是有包膜、單股正鏈Ribonucleic Acid(RNA)病毒,分為α、β、γ、δ 4 個(gè)屬,其中α、β 冠狀病毒屬與人類疾病有關(guān)。 目前引起人類呼吸道疾病的冠狀病毒Human coronavirus 229E(HCoV-229E)、Human coronavirus NL63(HCoVNL63)屬于α 屬,Human coronavirus OC43(HCoVOC43)、Human coronavirus HKU-1(HCoV-HKU-1)、SARS-CoV、 MiddleEastrespiratorysyndrome coronavirus (MERS-CoV)、SARS-CoV-2 屬于β 屬。HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-OC43、HCoV-HKU-1冠狀病毒可引起輕度呼吸道疾病,在免疫力低下人群中,還會(huì)引起肺炎和下呼吸道疾病[2]。 SARSCoV、MERS-CoV、SARS-CoV-2 病毒有高變異性和傳染性,可引起嚴(yán)重急性呼吸道綜合征。 由于RNA 病毒的高變異性,使得藥物研究困難重重。 本文對(duì)以冠狀病毒刺突蛋白,RNA 依賴性RNA 聚合酶,3C樣蛋白酶以及抗冠狀病毒中藥的體內(nèi)研究現(xiàn)狀進(jìn)行綜述,為抗冠狀病毒藥物研究提供理論依據(jù)。

1 冠狀病毒復(fù)制周期

吸附與進(jìn)入:冠狀病毒是有包膜、單股正鏈RNA 病毒。 病毒的膜表面有3 種蛋白,分別是刺突蛋(spike protein,S 蛋白)、包膜蛋白(envelope protein, E 蛋白)、膜蛋白(membrane protein,M 蛋白),其中S 蛋白是病毒入侵宿主細(xì)胞的關(guān)鍵[3]。病毒進(jìn)入人體后,其S 蛋白被宿主蛋白酶切割成S1和S2 兩個(gè)亞基,S1 亞基的受體結(jié)合區(qū)域與受體結(jié)合,病毒黏附在宿主細(xì)胞表面,S2 構(gòu)象發(fā)生改變。病毒進(jìn)入細(xì)胞包括膜融合和內(nèi)吞兩種方式,S2 的兩個(gè)串聯(lián)域七肽重復(fù)序列1(heptad repeat domains 1,HR1)和七肽重復(fù)序列2(heptad repeat domains,HR2),介導(dǎo)病毒與細(xì)胞之間膜融合途徑,使病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞[4],如MERS-CoV 病毒[5];此外,低pH值和pH 依賴性的內(nèi)質(zhì)體半胱氨酸蛋白酶等組織蛋白酶協(xié)助冠狀病毒由內(nèi)吞途徑進(jìn)入宿主細(xì)胞,如SARS-CoV 和SARS-CoV-2 病毒[6-7]。

復(fù)制與轉(zhuǎn)錄:病毒基因組的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄主要是由病毒的復(fù)制酶介導(dǎo)。 病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞并脫殼,病毒基因組RNA 釋放到細(xì)胞質(zhì)中后,Open Reading Frame 1a (ORF 1a)、 ORF 1b 翻譯多聚蛋白(polyprotein,pp)pp1a 和pp1ab,pp1a 和pp1ab 隨后被木瓜蛋白酶樣蛋白酶(papain-like protease,PLpro)和3C 樣蛋白酶(chymotrypsin-like protease,3CLpro) 切割, 產(chǎn)生 15 ～ 16 個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(nonstructure protein,NSPs),NSPs 組裝成復(fù)制-轉(zhuǎn)錄復(fù)合物(replicase-transcriptase complex,RTC),負(fù)責(zé)病毒 RNA 的復(fù)制和多個(gè)亞基因組 RNA(subgenomic RNAs,sgRNAs)的轉(zhuǎn)錄。 冠狀病毒復(fù)制以其正鏈RNA 為模板,通過(guò)RNA 依賴性RNA 聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRp)生成全長(zhǎng)的反義負(fù)鏈模板,用于合成新的基因組RNA 和重疊的亞基因組負(fù)鏈模板。

蛋白翻譯:亞基因組mRNAs 的翻譯產(chǎn)生病毒的結(jié)構(gòu)蛋白和輔助蛋白,如刺突蛋白(S)、核衣殼磷酸蛋白(N)、血凝素-酯酶糖蛋白(HE)、膜糖蛋白(M)、外膜蛋白(E)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)行翻譯,并轉(zhuǎn)運(yùn)至高爾基體[8]。

組裝與釋放:病毒顆粒組裝過(guò)程主要是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體中間體中發(fā)生,N 蛋白與新生的基因組RNA 在胞漿內(nèi)組成螺旋核衣殼,核衣殼首先與M蛋白結(jié)合,E 蛋白與M 蛋白相互作用引發(fā)芽生,包裝核衣殼。 S 蛋白與HE 蛋白在翻譯時(shí)形成三聚體,包裝到成熟的病毒顆粒,最后通過(guò)胞吐釋放到胞外。

2 基于病毒蛋白靶點(diǎn)的抗冠狀病毒藥物

病毒復(fù)制周期中的酶和蛋白都是抗冠狀病毒藥物潛在的作用靶點(diǎn),目前對(duì)于抗冠狀病毒藥物的研究熱點(diǎn)主要集中在S 蛋白、 RdRp、 3CLpro、PLpro 等。

2.1 靶向于病毒刺突(S)蛋白

刺突(S)蛋白屬于病毒的結(jié)構(gòu)蛋白,成熟的S蛋白為穩(wěn)定的三聚體,具有受體及膜融合活性,S1和S2 之間存在蛋白酶的裂解位點(diǎn),S 蛋白的裂解活化是病毒入侵宿主細(xì)胞的關(guān)鍵[3]。 S 蛋白上的受體結(jié)合域(receptor-bindingdomain,RBD)與細(xì)胞表面受體結(jié)合,使病毒黏附于細(xì)胞表面,不同的冠狀病毒其受體不同,親和力也有區(qū)別,MERS-CoV 以人細(xì)胞表面蛋白二肽基肽酶4(dipeptidyl peptidase-4,DPP4)作為進(jìn)入受體,而SARS-CoV-2 和SARS-CoV以血管緊張素轉(zhuǎn)化酶II(angiotensin-converting 2,ACE2)作為受體,由于SARS-CoV-2 的S 蛋白與ACE2 受體親和力比SARS-CoV 高20 倍,導(dǎo)致該病毒在人類中的傳播速度更快[9]。

SARS-CoV-2 不僅需要ACE2 作為進(jìn)入受體,還須同時(shí)結(jié)合位于細(xì)胞表面上的硫酸乙酰肝素(heparan sulfate,HS)才能進(jìn)入宿主細(xì)胞,肝素結(jié)構(gòu)上類似于HS,可結(jié)合并誘導(dǎo)SARS-CoV-2 S 蛋白受體結(jié)合域構(gòu)象變化,抑制SARS-CoV-2 對(duì)Vero 細(xì)胞的感染[10],此外,肝素是一種硫酸多糖,有研究證實(shí)海參硫酸多糖(SCSP)可能通過(guò)抑制HS 和S 蛋白結(jié)合,阻止SARS-CoV-2 進(jìn)入宿主細(xì)胞[11]。

部分藥物可通過(guò)直接與病毒S 蛋白結(jié)合,如單克隆抗體7D10 與MERS-CoV S 蛋白的N 端結(jié)構(gòu)域(amino terminal domain,NTD)結(jié)合,與DPP4 競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合病毒S 蛋白,抑制了S 蛋白融合前到融合后的構(gòu)象變化,從而阻止MERS-CoV 進(jìn)入宿主細(xì)胞[12]?；蛲ㄟ^(guò)其他方式作用于S 蛋白,如重組蛋白Griffithsin 與SARS-CoV 的S 蛋白存在多個(gè)具有高親和力結(jié)合位點(diǎn),但其并不抑制S 蛋白與ACE2 結(jié)合,研究表明Griffithsin 在體外可預(yù)防SARS-CoV 感染,預(yù)處理可預(yù)防小鼠致命性的肺部感染,減輕小鼠肺部病理改變,降低小鼠肺部炎癥因子IL-1α、IL-1β、IL-6、G-CSF、MCP-1、和IL-12 的表達(dá)[13]。 化合物陽(yáng)離子改性殼聚糖N-(2-羥丙基)-3-三甲基銨殼聚糖氯(HTCC)通過(guò)與病毒S 蛋白之間的靜電相互作用,有效地阻斷了MERS-CoV 和SARS-CoV-2 進(jìn)入宿主細(xì)胞,且通過(guò)微調(diào)HTCC 可以靶向其他冠狀病毒,但目前該化合物尚未用于人類,需要進(jìn)一步深入研究[14]。

冠狀病毒S 蛋白與受體結(jié)合后,通過(guò)破壞融合前S 蛋白三聚體的穩(wěn)定性,引起S1 亞基脫落并從S2 亞基過(guò)渡到穩(wěn)定的融合后構(gòu)象,Arbidol 就通過(guò)阻斷SARS-CoV-2 刺突蛋白的三聚反應(yīng),從而抑制病毒的感染性[15],但其有效性和安全性需要進(jìn)一步的臨床研究。

S2 的兩個(gè)串聯(lián)域七肽重復(fù)序列1(HR1)和七肽重復(fù)序列2(HR2)可形成一個(gè)6-HB 的螺旋結(jié)構(gòu),協(xié)助SARS-CoV、MERS-CoV、SARS-CoV-2 與細(xì)胞之間膜融合途徑[4,16],SARS-CoV-2 的HR1 比SARSCoV 具有更高的螺旋度和熱穩(wěn)定性,與對(duì)應(yīng)的HR2親和性也更強(qiáng)[17],丹參的親水化合物丹參酚酸C,通過(guò)結(jié)合SARS-CoV-2 的HR1 區(qū)域中處于融合中間狀態(tài)的保守疏水囊,阻斷HR1 和HR2 之間6-HB 的形成,從而抑制SARS-CoV-2 感染[18]。 通過(guò)SARSCoV-2 蛋白HRC 結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)出的SARS-CoV-2 HRC脂肽,可通過(guò)抑制SARS-CoV-2、SARS-CoV 和MERSCoV 的S 蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞膜融合,從而有效地抑制病毒感染[19]。

Furin 裂解位點(diǎn)在S 蛋白融合活性中至關(guān)重要,有助于病毒合胞體形成, 其抑制劑 CMK 和Naphthofluorescein 在體外可抑制SARS-CoV-2 的復(fù)制,該類抑制劑可作為先導(dǎo)化合物,進(jìn)一步開(kāi)發(fā)為抗病毒藥物[20],此外,組織蛋白酶L(CTSL)切割SARS-CoV-2 刺突蛋白,協(xié)助病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞,有研究表明COVID-19 患者的組織蛋白酶L(CTSL)水平升高,且與疾病的嚴(yán)重程度呈正相關(guān),因此組織蛋白酶L(CTSL)有望開(kāi)發(fā)成為抗SARS-CoV-2 病毒藥物的靶標(biāo)[21]。

2.2 靶向于RNA 依賴性RNA 聚合酶

RNA 依賴性RNA 聚合酶(RdRp,Nsp12)是冠狀病毒RTC 的重要組成部分,冠狀病毒在復(fù)制過(guò)程需自身編碼的RdRp 參與,主要負(fù)責(zé)病毒復(fù)制過(guò)程中鏈引發(fā)和鏈延伸兩個(gè)階段,是研究抗冠狀病毒的主要靶標(biāo)[22]。

瑞德西韋(remdesivir)是一種新型核苷類似物,靶向于RdRp,通過(guò)摻入到RNA 復(fù)制過(guò)程中,添加3個(gè)核苷酸從而誘導(dǎo)RdRp 遇到易位屏障,終止鏈延伸,抑制病毒復(fù)制[23],因此瑞德西韋也具有廣譜性,對(duì)SARS-CoV、MERS-CoV、SARS-CoV-2 均有抗病毒活性[24],臨床上瑞德西韋副作用小,多用于治療呼吸道病毒感染,但對(duì)于COVID-19 重癥患者沒(méi)有顯著的臨床和抗病毒效果[25]。 蘇拉明(suramin)在酶水平上,是瑞德西韋的三磷酸活性形式的20 倍以上,通過(guò)與RdRp 活性位點(diǎn)結(jié)合,抑制病毒RNA 模板與引物和底物結(jié)合,同時(shí)抑制了RdRp 聚合酶活性[26]。 而利托那韋可與SARS-CoV-2 RdRp 蛋白結(jié)合,可能通過(guò)抑制RdRp 蛋白3’到5’外切酶活性,可提高藥物治療COVID-19[27]。 利巴韋林多被用于治療由呼吸道合胞病毒(RSV)引起的呼吸道相關(guān)疾病,其在宿主細(xì)胞內(nèi)磷酸化后,可能通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性地抑制病毒的三磷酸鳥(niǎo)苷合成,或是抑制病毒mRNA 合成和抑制RdRp 實(shí)現(xiàn)抗病毒作用[28],有研究提出干擾素-α2b 和利巴韋林聯(lián)合使用可有效減少M(fèi)ERS-CoV、SARS-CoV 的體外復(fù)制[29],且能改善被MERS-CoV 感染后恒河猴體內(nèi)病毒載量和肺組織病理變化[30],對(duì)于嚴(yán)重的MERS-CoV 感染患者,干擾素-α2b 和利巴韋林聯(lián)合治療可改善14 d 生存率[31]。

2.3 靶向于3C 樣蛋白酶

3C 樣蛋白酶(3CLpro, Nsp5)負(fù)責(zé)切割病毒基因組翻譯的蛋白前體,是冠狀病毒復(fù)制的重要酶。3CLpro 在β 屬冠狀病毒中保守性較高[32],其相關(guān)的抑制劑對(duì)于MERS-CoV、SARS-CoV 和SARS-CoV-2 有廣泛的抗病毒活性[33]。

目前有許多化合物通過(guò)靶向3CLpro 顯示抗病毒活性,如吲哚-氯吡啉基酯衍生物GRL-0820 和GRL-0920 可與SARS-CoV-2 的3CLpro 共價(jià)結(jié)合,在體外具有抑制SARS-CoV-2 作用。 GRL-0820 吲哚氮上有一個(gè)額外的丙烯取代基,相比之下GRL-0920對(duì)SARS-CoV-2 具有更強(qiáng)的抗病毒活性[34]。 針對(duì)3CLpro 設(shè)計(jì)出的TG-0205221 能夠減少SARS-CoV和HCoV-229E 病毒滴度,顯示出一定的抗病毒活性[35]。 GC-376 和鈣蛋白酶抑制劑II、XII 則具有雙重作用機(jī)制,在Vero 細(xì)胞中同時(shí)抑制病毒3CLpro和宿主組織蛋白酶L 的活性,對(duì)SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV 以及HCoV-229E、OC43 和NL63 均有抗病毒活性[36]。 阿扎那韋與3CLpro 氫鍵結(jié)合,可抑制SARS-CoV-2 的3CLpro 酶活性,與利托那韋聯(lián)用還可以下調(diào)病毒誘導(dǎo)的IL-6 和TNF-α水平[37]。 洛匹那韋是HIV-1 蛋白酶抑制劑,常與利托那韋聯(lián)合使用提高血藥濃度,其靶向于3CLpro,對(duì)冠狀病毒有一定的抗病毒活性,預(yù)防性給予洛匹那韋/利托那韋可降低MERS-CoV 在小鼠體內(nèi)病毒載量,治療性使用可改善肺功能,但不減少病毒復(fù)制和嚴(yán)重的肺病理改變[38],早期的洛匹那韋/利托那韋治療可縮短SARS-CoV-2 病毒在病人體內(nèi)的排毒時(shí)間[39]。

通過(guò)體外分子篩查,篩選出槲皮素有望成為靶向于3Clpro 的抗SARS-CoV-2 候選藥物[40]。 肉桂硫胺可能通過(guò)抑制3Clpro 來(lái)抑制SARS-CoV 復(fù)制[41]。 表沒(méi)食子兒茶素- 3 - 沒(méi)食子酸酯( epigallocatechin-3-gallate, EGCG ) 和 Nsubstited Isatin 可抑制3Clpro,具有作為抗冠狀病毒藥物的潛力[32,42]。 中藥雙黃連制劑靶向于SARS-CoV-2 3Clpro,抑制病毒在VERO-E6 細(xì)胞中復(fù)制,成劑量依賴關(guān)系,其活性成分黃芩苷和黃芩素在體外也顯示較好抗病毒活性[43]。

3 抗冠狀病毒中藥的體內(nèi)研究

傳統(tǒng)中藥在我國(guó)已廣泛使用,其成本低,療效好,能有效緩解癥狀,減少?gòu)妮p度到中度或重度的發(fā)展,改善治愈率,降低死亡率,促進(jìn)患者的康復(fù)等。 新冠病毒流行期間,以“三藥三方”為代表的中藥在新冠病毒的防治方面發(fā)揮了重大作用[44],基于中藥多成分、多靶點(diǎn)、多通路的特點(diǎn),因此體內(nèi)模型驗(yàn)證其有效性具有重要意義,由于冠狀病毒受體限制,因此中藥抗冠狀病毒的動(dòng)物模型評(píng)價(jià)研究有限。

3.1 甘草干燥根和山茶水提物的小鼠體內(nèi)抗新冠病毒研究

GB-2 主要由甘草干燥根和山茶通過(guò)水提獲得,為了研究GB-2 的體內(nèi)抗SARS-CoV-2 效應(yīng),以小鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型每天口服200 mg/kg 的GB-2。在GB-2 治療1 周后,小鼠未有死亡,且小鼠活動(dòng)或體重都沒(méi)有顯著變化。 此外,GB-2 組與對(duì)照組比較,血清肌酐、谷氨酸草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶和谷氨酸-丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶水平?jīng)]有顯著升高,表明GB-2 沒(méi)有明顯的腎毒性或肝毒性。 肺和腎是ACE2 相對(duì)高表達(dá)的重要器官,是SARS-CoV-2 的潛在靶點(diǎn),因此研究了GB-2 對(duì)ACE2 和TMPRSS2 蛋白在兩個(gè)器官組織中的表達(dá)影響。 GB-2 治療1 周(200 mg/kg,口服),肺和腎的免疫組織化學(xué)(IHC)數(shù)據(jù)顯示,GB-2組的ACE2 和TMPRSS2 與對(duì)照組比較明顯減少。結(jié)果表明,GB-2 可能阻斷ACE2 和ACE2TMPRSS2在肺和腎組織中的表達(dá)且無(wú)副作用,包括腎毒性和肝毒性[45]。

3.2 通過(guò)建立人冠狀病毒肺炎疫毒襲肺證小鼠模型,該研究評(píng)價(jià)熱炎寧合劑、復(fù)方芩蘭口服液、柴銀顆粒、金柴抗病毒膠囊的有效性

熱炎寧合劑由蒲公英、虎杖、北敗醬、半枝蓮4味中藥組成,結(jié)果顯示熱炎寧合劑能顯著降低人冠狀病毒肺炎疫毒襲肺證小鼠的肺指數(shù),提高小鼠外周血CD8+T 淋巴細(xì)胞和CD4+T 淋巴細(xì)胞百分比,其低劑量組(14.67 mL/(kg·d))能提高總B 淋巴細(xì)胞百分比,降低小鼠肺組織中人冠狀病毒載量和炎癥因子TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-10 含量,提示熱炎寧合劑對(duì)人冠狀病毒肺炎疫毒襲肺證具有較好療效,主要表現(xiàn)在改善肺部病變,增強(qiáng)小鼠免疫機(jī)能,降低體內(nèi)炎癥因子等方面[46]。

復(fù)方芩蘭口服液由金銀花、黃芩、連翹、板藍(lán)根4 味中藥組成,其高(22 mL/(kg·d))、低劑量(11 mL/(kg·d))可降低人冠狀病毒肺炎疫毒襲肺證小鼠的肺指數(shù),抑制率分別為59.01%、47.72%,此外,復(fù)方芩蘭口服液可降低人冠狀病毒肺炎疫毒襲肺證小鼠的肺組織病毒載量,提升其外周血CD4+T淋巴細(xì)胞、CD8+T 淋巴細(xì)胞及總B 淋巴細(xì)胞百分比,降低肺組織中炎癥因子IL-6、IL-10、TNF-α 及IFN-γ 表達(dá),明顯改善肺組織炎癥[47]。

柴銀顆粒是由柴葛解肌湯和銀翹散化裁,由柴胡、金銀花、黃芩、葛根、荊芥、青蒿、連翹、桔梗、苦杏仁、薄荷、魚腥草11 味中藥組成,其高(8.8 g/(kg·d))、低劑量(4.4 g/(kg·d))能降低人冠狀病毒肺炎疫毒襲肺證小鼠的肺指數(shù),抑制率分別為61.02%,55.45%,提高小鼠外周血CD4+T 淋巴細(xì)胞、CD8+T 淋巴細(xì)胞、總B 淋巴細(xì)胞百分比,降低小鼠肺組織炎癥因子IL-10、TNF-α、IFN-γ 含量[48]。

金柴抗病毒膠囊由金銀花、柴胡、連翹、黃芩、清半夏、西洋參、綿馬貫眾等中藥組成,可增加寒濕疫毒襲肺證小鼠的活動(dòng)度和反應(yīng)能力,改善小鼠皮毛和大便狀態(tài),金柴抗病毒膠囊高(1.76 g/(kg·d))、低劑量組(0.88 g/(kg·d))可以顯著降低肺指數(shù),明顯提升CD4+T 細(xì)胞,CD8+T 細(xì)胞,B 細(xì)胞含量,低劑量組顯著降低血清中MTL 含量,降低肺組織中病毒載量和炎癥因子IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ 表達(dá),改善肺組織病理?yè)p傷[49]。

4 結(jié)語(yǔ)

新冠病毒感染具有潛伏期長(zhǎng)、傳染性強(qiáng)等特點(diǎn),且不斷出現(xiàn)變異株,導(dǎo)致傳播性增強(qiáng),免疫逃逸,增加疾病嚴(yán)重性以及降低疫苗的有效性[50]。 目前尚無(wú)有效的抗新冠病毒藥物批準(zhǔn)用于臨床,現(xiàn)有藥物研究主要集中在病毒相關(guān)靶蛋白,由于冠狀病毒為RNA 病毒,易發(fā)生突變,因此單靶點(diǎn)藥物極易產(chǎn)生耐藥性。 因此,針對(duì)冠狀病毒及可能的新出現(xiàn)毒株的藥物治療,應(yīng)根據(jù)其致病特點(diǎn),深入研究病毒復(fù)制周期及病毒-宿主相互作用的特點(diǎn),不斷探索新靶點(diǎn),將不同靶點(diǎn)藥物聯(lián)合使用降低耐藥性及減少毒副作用,此外,“老藥新用”及中西醫(yī)并重的治療策略都為抗病毒藥物研究提供了新思路。