趙振榮史 洺劉繼紅邵思邁游言文張紫娟郝 莉張振強

(1.河南中醫(yī)藥大學醫(yī)學院,鄭州 450046;2.河南中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥科學院,鄭州 450046)

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)的主要癥狀是運動遲緩、靜止性震顫和肌強直[1]。 PD主要神經病理改變是中腦黑質多巴胺能神經元變性死亡,由此引起紋狀體多巴胺含量減少和α-突觸核蛋白(α-synuclein,α-syn)沉積。 這些病理改變可能與神經元氧化應激、炎癥反應和線粒體功能障礙等有關。 線粒體功能障礙可由多種原因引起,如線粒體生物發(fā)生障礙、活性氧(reactive oxygen species,ROS)生成增加及線粒體動力學異常等[2]。 近年來,PD 中線粒體動力學異常引起了廣泛關注。 所以,本文就線粒體動力學、線粒體動力相關蛋白1 及其與PD 中異常表達的α-syn、LRRK、PINK1、Parkin 等的病理關系進行綜述。

1 線粒體動力學

線粒體是存在于大多數(shù)真核細胞中的細胞器[3],是一系列細胞生命過程如三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate,ATP)的產生、關鍵代謝物的合成、內源性ROS 的產生等,并且是細胞程序性和非程序性死亡發(fā)生的場所[4]。 線粒體動力學是指線粒體通過不斷的分裂和融合,為細胞提供能量,調節(jié)細胞自噬和凋亡的過程[5]。 其中,線粒體分裂有利于新線粒體的生物發(fā)生和通過自噬清除功能異常的線粒體,動力相關蛋白1(dynaminrelated protein1,Drp1)參與的線粒體分裂異?？梢鹕窠浲诵行圆∽?、心血管疾病和癌癥等[6];線粒體融合包括線粒體融合蛋白1(mitofusion 1,Mfn1)和線粒體融合蛋白2(mitofusion 2,Mfn2)介導的外膜融合和由視神經萎縮癥蛋白1(optic atrophy 1,OPA1)介導的內膜融合,融合缺陷可引起線粒體DNA 丟失[7]。 分裂與融合的動態(tài)平衡有助于維持線粒體的正常功能[8]。

2 線粒體動力相關蛋白1

Drp1 又名DNM1L(dynamin-1 like)[9],正常情況下,Drp1 主要分布于細胞質內,可維持線粒體動力學平衡,調節(jié)分裂和融合。 線粒體分裂時,細胞質內的Drp1 被募集到分裂處,水解GTP 釋放能量,微管環(huán)收縮繼而切斷線粒體。 隨著Drp1 的表達水平降低,分裂逐漸停止,轉向融合[10]。 因此,Drp1水平的上調或下調可用于檢測線粒體動力學的變化。

Drp1 由Shin 等[11]首先報道,分布于人的12p11.21,小鼠的16 和大鼠的11q23[12]。 人Drp1有六個剪接變體:變體1 編碼736 個氨基酸,分子量為81.6×103;變體2 外顯子15 被剪切;變體3 編碼699 個氨基酸,外顯子15 和16 被剪切;變體4 編碼725 個氨基酸;變體5 編碼710 個氨基酸;變體6 編碼749 個氨基酸[13]。 與人Drp1 相似,小鼠也存在Drp1 的多種變體。 變體1 編碼712 個氨基酸組成,分子量為78.3×103;變體2 的外顯子3 被剪接掉;變體3 的外顯子15 和16 被剪接掉[13]。

Drp1 是一種高度保守的 GTP (Guanosine triphosphate)酶,包括4 個結構域[12]。 不同結構域的不同位點可以與線粒體外膜上的受體結合,其中GTP 酶結構域與線粒體外膜上的受體結合;中間結構域主要介導Drp1 的寡聚化,裂變過程由Drp1 在分裂點周圍形成環(huán)狀螺旋結構,然后由GTP 酶依賴性收縮;C 末端GTP 酶效應結構域刺激GTP 酶的活性并介導Drp1 同源二聚體復合物的形成和穩(wěn)定[14]。

Drp1 翻譯后修飾主要包括磷酸化、小泛素相關修飾物(smallubiquitin-relatedmodifier,SUMO)化、泛素化和S-亞硝基化,它們調控著Drp1 的活性。Ser637 的磷酸化抑制Drp1 活性,而Ser616 的磷酸化激活Drp1 活性。 當SUMO 蛋白附著在Drp1 上時,有助于Drp1 修飾,尤其是在線粒體外膜(outer mitochondrial membrane, OMM)。 然而, Drp1 在OMM 的SUMO 化結果尚不明確。 定位于線粒體外膜的E3 泛素連接酶可使從胞質轉移到線粒體的Drp1 發(fā)生泛素化,并被蛋白酶體降解,同時誘導線粒體自噬。 Drp1 中Cys644 半胱氨酸殘基的S-亞硝基化增強Drp1 活性,促進線粒體分裂[15]。

3 Drp1 參與PD 的病理過程

PD 是僅次于阿爾茨海默病(Aizheimer’ s disease,AD)的第二大神經退行性疾病[16]。 1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP)促進Drp1 表達,繼而引起ATP 減少和ROS 產生增多[17]。 MPTP 可選擇性引起多巴胺神經元變性損傷[18]。 由于1-甲基-4-苯基-吡啶離子(1-methyl-4-phenylpyridinium,MPP+)是MPTP 的活性代謝物,被選擇性地吸收到DA 神經元中,抑制線粒體復合物I 的活性,減少ATP 合成[19]。 研究發(fā)現(xiàn),MPP+可使Drp1 表達增加,導致處于融合、分裂平衡的線粒體趨向于過度分裂,出現(xiàn)線粒體碎片化并伴有線粒體功能障礙,這些改變的出現(xiàn)早于神經元自噬和死亡[20]。 所以在PD 神經毒素模型中,Drp1 在介導MPP+毒性中發(fā)揮了重要作用[21]。

PD 黑質中殘存的神經元胞質內不溶性α-syn聚集形成路易小體。 PD 模型發(fā)生機制研究表明,αsyn 通過調節(jié)分裂、融合蛋白影響線粒體動力學[22]。α-syn 定位于線粒體膜,影響線粒體分裂,直接或間接影響著Drp1 活性。 α-syn 促進Drp1 從細胞質移位至線粒體外膜,與相應受體結合,形成螺旋寡聚體,包裹線粒體使其分裂[23],同時還可引起線粒體自噬減少[22]。 實驗發(fā)現(xiàn)α-syn 聚集形成的毒性可被Drp1 抑制劑降低,這進一步說明α-syn 聚集與Drp1 介導的線粒體分裂相關[24]。 但是,PD 中線粒體分裂主要是由α-syn 觸發(fā)還是由α-syn 與Drp1 之間的相互作用引起的仍不清楚[25]。

LRRK2(Leucine-rich repeat kinase 2)是PD 的致病基因[26],具有調控囊泡運輸、自噬、氧化應激、神經毒性和線粒體動力學等功能。 LRRK2 基因編碼的蛋白包含功能性激酶和GTP 酶結構域。LRRK2 在多巴胺能神經元表達高于其他神經元,促使Drp1 從胞質向線粒體轉移和募集[27]。 LRRK2通過轉移磷酸鹽來增加線粒體自噬,從而激活Drp1。 Ho 等[28]等發(fā)現(xiàn)LRRK2 通過Drp1 以激酶依賴性方式引起神經元線粒體分裂和動力學失衡,繼而參與PD 病理過程。 LRRK2 基因突變與PD 相關,G2019S 是LRRK2 家族中最常見的致病突變,它可增加激酶活性。 PD 模型中,野生型LRRK2 直接與Drp1 相互作用,導致線粒體分裂,這在G2019S LRRK2 突變中更加明顯[29]。

PINK1(PTEN induced putative kinase 1)與PD相關,是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,主要位于OMM,促進PD 中受損的線粒體通過自噬被清除[30]。PINK1 可在Ser616 位點磷酸化Drp1,缺乏PINK1的細胞和小鼠組織中Drp1 Ser616 磷酸化明顯降低。在PINK1 突變的PD 患者成纖維細胞中檢測到Drp1 Ser616 磷酸化降低[31]。 PINK1 通過抑制Drp1從胞質移位線粒體,恢復線粒體功能,減少線粒體分裂,保護神經細胞免受損傷[32]。 PD 線蟲模型中,ROS 的產生和線粒體膜電位的丟失上調Drp1 表達,進行PINK1 依賴的線粒體分裂和自噬[33]。 PINK1缺陷果蠅的線粒體復合體I 的功能受影響,引起線粒體膜電位降低和ATP 減少[34]。 在PINK1 基因敲除小鼠中,Drp1 抑制劑可促進多巴胺的釋放,改善線粒體功能障礙和緩解氧化應激。

Parkin 是一種E3 泛素連接酶,也是PD 相關蛋白。 Parkin 可在體內外與Drp1 相互作用并泛素化Drp1,促進其蛋白酶體降解。 若Parkin 突變或敲低可使Drp1 泛素化和降解均減少,Drp1 活性增強和線粒體分裂增加,最終導致PD[35]。 Parkin 在神經元過度表達不僅會增加線粒體數(shù)量還能延長果蠅的壽命。

PINK1 對底物的磷酸化有利于Parkin 從胞質移位到線粒體和參與后續(xù)的線粒體自噬[36]。PINK1 和Parkin 突變的果蠅體內,過表達Drp1 引起線粒體過度分裂,分裂后形成的碎片通過線粒體自噬消除[37]。 PINK1 或Parkin 功能缺失會增加Drp1依賴的線粒體片段化[38]。 在PD 的Drp1 敲低或敲除模型中,PINK1/Parkin 調節(jié)的線粒體自噬在黑質中受到明顯抑制,這提示Drp1 參與了PINK1/Parkin調節(jié)的線粒體自噬,Drp1 在其中除了依賴性線粒體分裂作用以外,是否還有其他的作用方式還需進一步的實驗證實。

4 Drp1 作為治療靶點的相關研究

誘發(fā)PD 的神經毒素和相關蛋白與線粒體動力學有關。 神經毒素如6-羥基多巴胺、魚藤酮和MPP+可誘導Drp1 從胞質轉移至線粒體,引起線粒體分裂,從而導致多巴胺能神經元缺失。 PD 相關蛋白如Pink1、Parkin 和α-syn 可通過Drp1 調控線粒體融合/分裂來影響線粒體形態(tài)和功能。 另外,條件性敲除Drp1 的小鼠黑質和紋狀體多巴胺能神經元容易受到分裂蛋白缺失的影響。 因此,PD 中靶向Drp1 介導的線粒體分裂對抑制神經變性非常重要。

十余年來,線粒體分裂抑制劑的開發(fā)取得了一定的進展。 第一個線粒體分裂抑制劑 1(mitochondrial division inhibitor 1,Mdivi-1)可透過血腦屏障、特異性降低Drp1 活性。 2008 年,Cassidy-Stone 等[39]在酵母中發(fā)現(xiàn)Mdivi-1 可明顯減弱線粒體分裂,是DNM1 的GTP 酶特異性抑制劑。 隨后,Mdivi-1 逐漸被證實可阻止人和哺乳動物細胞中的Drp1 從胞質轉移到OMM 聚集,可防止GTP 酶激活水解GTP 和Drp1 寡聚化,從而抑制線粒體分裂,增加線粒體網(wǎng)絡穩(wěn)定。 此外,Reddy 等[40]研究表明,Midvi-1 在降低Drp1 的同時,增加線粒體融合蛋白水平,這說明Midvi-1 在抑制分裂的同時可促進融合。

Mdivi-1 在Pink1 基因敲除和MPTP 處理的PD小鼠模型中具有神經保護作用[41]。 在過表達人A53T 突變α-syn 基因的PD 大鼠模型體內的實驗結果顯示Mdivi-1 減少了神經變性、α-syn 聚集,并使模型大鼠運動功能正?；?這可能與Mdivi-1 減少線粒體過度分裂、改善氧化應激有關[24]。 PD 中,Pink1 突變促進線粒體分裂并阻止融合,而Mdivi-1明顯減輕了Pink1 突變誘導的線粒體缺陷[42]。 這些結果表明Drp1 是一種治療PD 的潛在靶點,特異性抑制Drp1 活性可直接減少線粒體分裂和片段化,進而緩解或逆轉PD 癥狀。 截至目前,Mdivi-1 是研究最多的Drp1 抑制劑,但是,實驗結果尚未顯示Mdivi-1 在PD 中如何影響Drp1 的GTP 酶活性及其機制,因此,需要進一步研究Mdivi-1 如何靶向PD中神經元Drp1 和線粒體分裂。

另一種Drp1 選擇性抑制劑是P110,它是一種能透過血腦屏障的生物可利用肽。 P110 通過減少線粒體碎片和ROS 產生來改善線粒體膜電位,減少PD 細胞模型中多巴胺能神經元的丟失[43]。 在加入MPP+的神經元中,P110 通過抑制Drp1 介導的線粒體功能障礙來減少多巴胺能神經元變性[44]。LRRK2 G2019S 突變是PD 最常見的遺傳原因。P110 減少了攜帶LRRK2 G2019S 的PD 患者成纖維細胞的線粒體分裂,并降低了自噬水平。 LRRK2 G2019S 在Ser595 直接結合并磷酸化Drp1,而P110可消除這種磷酸化,抑制了Drp1 活性[45]。 除了磷酸化,目前尚不清楚P110 是否還能通過其他修飾方式起作用。

另外,Dynasore 是一種細胞滲透分子,它不僅會產生一種構象來阻止Drp1 聚合,還會阻止Drp1 的GTP 水解[46]。 Mitoquinone 是一種線粒體靶向抗氧化劑,它通過抑制Drp1 從胞質轉向線粒體,明顯減輕由PD 相關神經毒素誘導的線粒體分裂[47]。

5 結語

Drp1 對于線粒體分裂至關重要,PD 中Drp1 表達水平升高,增加的Drp1 會導致線粒體過度分裂、融合減少以及線粒體功能缺陷。 降低Drp1 表達水平可減少線粒體分裂,有助于維持線粒體穩(wěn)態(tài),這對于治療PD 起到了重要作用。

目前,在Drp1 抑制劑Mdivi-1、P110 和Dynasore等的體內外研究中已初步取得了一些成果[48]。 因此以Drp1 為切入點開發(fā)線粒體分裂的抑制劑有望成為治療PD 等神經退行性疾病的新靶標。 但是,現(xiàn)有的Drp1 抑制劑在不同PD 模型中作用機制尚不十分明確,進一步深入研究其中的作用機制是當務之急。 從而為Drp1 抑制劑應用于PD 等神經退行性疾病的臨床治療奠定堅實的理論和實驗基礎。