液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定蝦類(lèi)中四環(huán)素類(lèi)物質(zhì)的不確定度評(píng)定

◎ 何詠欣，陳嘉欣，龔海錕，楊嘉鑫威，張 輝，林澤珊，黃景初，錢(qián)振杰

（廣州市食品檢驗(yàn)所，廣東 廣州 511400）

四環(huán)素類(lèi)物質(zhì)（四環(huán)素、土霉素、多西環(huán)素和金霉素）是一類(lèi)較為常見(jiàn)的獸藥，常用作廣譜抗病原微生物的快速抑菌劑，高濃度時(shí)能對(duì)某些細(xì)菌有殺菌效果。由于四環(huán)素類(lèi)抗生素抑菌效果好、價(jià)格便宜，具有防治腸道感染和促進(jìn)生長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)，在畜類(lèi)、禽類(lèi)、水產(chǎn)品飼料添加劑和藥品等產(chǎn)業(yè)領(lǐng)域中廣泛使用[1]。但在生產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)中無(wú)節(jié)制地使用四環(huán)素類(lèi)藥物會(huì)導(dǎo)致其在動(dòng)物食品及其制品中大量殘留，人們可通過(guò)食物攝入殘留藥物進(jìn)而危害身體健康。因此，在食品安全監(jiān)管的重點(diǎn)監(jiān)測(cè)項(xiàng)目中包括動(dòng)物源性食品中四環(huán)素類(lèi)藥物的殘留量。

目前，水產(chǎn)品中四環(huán)素類(lèi)獸藥殘留檢測(cè)主要采用高效液相色譜法[2-4]和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[5-8]。《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 水產(chǎn)品中土霉素、四環(huán)素、金霉素、多西環(huán)素殘留量的測(cè)定》（GB 31656.11—2021）增加了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定方法，方法檢出限更低，靈敏度更高。研究不確定度來(lái)源是對(duì)測(cè)量結(jié)果準(zhǔn)確度的重要評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)之一，能在一定程度上反映該測(cè)定方法的準(zhǔn)確性和可信度[9]。本文依據(jù)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中獸藥最大殘留限量》（GB 31650—2019）[10-13]、《化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南》（CNAS—GL006：2019）[14]和《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》（JJF 1059.1—2012）[15]等標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合日常檢測(cè)發(fā)現(xiàn)蝦類(lèi)樣品中四環(huán)素類(lèi)藥物殘留相對(duì)較多。本文對(duì)GB 31656.11—2021中高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定水產(chǎn)品中四環(huán)素殘留量的不確定度進(jìn)行分析與評(píng)定，為確保檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確度、可信度和加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量控制及規(guī)范養(yǎng)殖業(yè)用藥安全提供依據(jù)[16-20]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蝦類(lèi)，購(gòu)于廣州市場(chǎng)；鹽酸土霉素標(biāo)準(zhǔn)品（CAS No：2058-46-0）、四環(huán)素鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品（CAS No：64-75-5）、金霉素鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品（CAS No：64-72-2）和多西環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品（CAS No：24390-14-5），均為德國(guó)Dr.廠家提供；乙腈、甲醇、乙酸乙酯和正己烷（色譜純，美國(guó)Thermo 公司）；甲酸、鹽酸、乙二胺四乙酸二鈉、氫氧化鈉（分析純，廣州化學(xué)試劑廠）；檸檬酸、磷酸氫二鈉（分析純，廣東光華科技公司）；醋酸鉛（分析純，上海安譜公司）；Waters Oasis HLB固相萃取柱（60 mg/3 mL，沃特世公司）；氮?dú)猓?9.999%，大成廣州氣體公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

ABI 4000 QTRAP 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，配ESI離子源（美國(guó)AB 公司）；電子天平（精度0.01 g，德國(guó)賽多利斯公司）；電子天平（精度0.000 01 g，德國(guó)賽多利斯公司）；離心機(jī)（德國(guó)Sigma 公司）；渦旋振蕩器（德國(guó)IKA 公司）；超聲波清洗儀（上海安譜公司）；系列刻度吸管（A 級(jí)，天津天玻公司）；系列移液器（德國(guó)艾本德公司）；氮吹儀（美國(guó)Organomation 公司）；超純水機(jī)（法國(guó)Millipore 公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品制備

按照GB/T 30891—2014 附錄B 中的要求制樣，取均質(zhì)后的待測(cè)樣品為待測(cè)樣，取均質(zhì)后的空白樣品為空白樣，空白樣中添加20 μL 1.00 μg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)工作液為加標(biāo)樣。

按照GB 31656.11—2021 所述方法進(jìn)行樣品前處理：稱(chēng)取2.0 g（準(zhǔn)確至±0.01 g）樣品使用提取液提取3 次，合并提取液后取部分提取液過(guò)固相萃取柱凈化，氮吹濃縮后及時(shí)測(cè)定。

1.3.2 混合標(biāo)準(zhǔn)工作液配制

稱(chēng)取標(biāo)準(zhǔn)品鹽酸土環(huán)素10.51 mg、四環(huán)素鹽酸鹽10.29 mg、金霉素鹽酸鹽10.76 mg、多西環(huán)素10.07 mg，分別用甲醇定容于10 mL 棕色容量瓶，分別配制成濃度為1.0 mg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。分別吸取1 000 μL 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液定容至10 mL，配制成10.00 μg·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。吸取1.0 mL混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液定容于10 mL容量瓶，配制成1.00 μg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

使用100 μL 或1 mL 量程的移液器分別準(zhǔn)確吸取0.05 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.50 mL 和1.00 mL 1.00 μg·mL-1四環(huán)素類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)工作液于一系列10 mL 容量瓶中，用甲醇定容，配制成濃度分別為5 ng·mL-1、10 ng·mL-1、20 ng·mL-1、50 ng·mL-1和100 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線溶液。每次實(shí)驗(yàn)現(xiàn)用現(xiàn)配，以標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 儀器條件

（1）液相色譜條件。色譜柱：C18色譜柱（150 mm×2.1 mm，5 μm）；流速：0.3 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：3 μL；流動(dòng)相：A 為甲醇，B 為0.1%甲酸溶液；梯度洗脫程序：0.01～1.00 min，75%B，1.00～4.00 min，75%B～30%B，4.00～5.40 min，30%B，5.40～5.50 min，30%B～75%B，5.50～7.00 min，75%B。

（2）質(zhì)譜條件。電離方式：ESI 離子源。離子噴霧電壓為5 500 V；霧化氣：氮?dú)猓?0 psi；干燥氣：氮?dú)?，流?0 L·min-1，溫度500 ℃；碰撞氣：氮?dú)?；掃描模式：MRM 正離子掃描模式。

1.3.5 數(shù)學(xué)模型的建立

試樣中四環(huán)素類(lèi)物質(zhì)殘留量的計(jì)算公式為

式中：X為試樣中四環(huán)素類(lèi)物質(zhì)殘留量，μg·kg-1；C為樣品溶液中四環(huán)素類(lèi)物質(zhì)的質(zhì)量濃度，ng·mL-1；V為提取液總體積，mL；m為試樣稱(chēng)取的質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 不確定度主要來(lái)源

通過(guò)分析實(shí)驗(yàn)方法和數(shù)學(xué)模型，不確定度來(lái)源主要包括標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制、前處理提取、樣品制備、儀器測(cè)定等步驟，參考文獻(xiàn)[21]將每個(gè)步驟細(xì)化繪制出不確定度來(lái)源圖，見(jiàn)圖1。

圖1 不確定度來(lái)源魚(yú)骨圖

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的不確定度

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品純度引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(S1)

經(jīng)標(biāo)物證書(shū)查詢可得鹽酸土霉素、四環(huán)素鹽酸鹽、金霉素鹽酸鹽和多西環(huán)素4 種標(biāo)準(zhǔn)品的純度及其擴(kuò)展不確定度，假設(shè)呈均勻分布根據(jù)文獻(xiàn)[14]可得標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度的計(jì)算公式為由標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度見(jiàn)表1。

表1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度表

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)品稱(chēng)量引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(S2)

使用十萬(wàn)分之一的電子天平稱(chēng)取標(biāo)準(zhǔn)品，依據(jù)該天平附的檢定證書(shū)，其最大允許誤差為±0.05 mg，按均勻分布，包含因子則根據(jù)文獻(xiàn)[14]計(jì)算公式可計(jì)算出計(jì)算得到4種四環(huán)素類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱(chēng)量引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 4 種四環(huán)素類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱(chēng)量引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度表

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液定容引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(C1)

配制標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液是用甲醇溶解并定容至10 mL 容量瓶中，依據(jù)《常用玻璃器具檢定規(guī)程》（JJG 196—2006）可得，10 mL A 級(jí)容量瓶容量允差為±0.020 mL，按均勻分布，則根據(jù)文獻(xiàn)[14]公式可計(jì)算得出容量瓶體積校準(zhǔn)引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

配制標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液除了容量瓶標(biāo)定引入的不確定度外，還有溫度引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度，實(shí)驗(yàn)室的溫度變化范圍是（20±5）℃，溫度影響引入的不確定度可通過(guò)估算該溫度范圍和體積膨脹系數(shù)計(jì)算，液體的體積膨脹遠(yuǎn)大于容量瓶的體積膨脹，因此只考慮溶劑的體積系數(shù)，甲醇的膨脹系數(shù)為1.19×10-3℃-1，產(chǎn)生的體積變化為±（10×5×1.19×10-3）=0.059 5 mL，按均勻分布，則根據(jù)文獻(xiàn)[14]計(jì)算公式可得溫度引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

根據(jù)文獻(xiàn)[14]計(jì)算公式可得標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液定容引入的不確定度為

根據(jù)文獻(xiàn)[14]計(jì)算公式可得標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液定容引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)中間液及標(biāo)準(zhǔn)曲線配制過(guò)程中引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(C2)

配制成1.00 μg·mL-1中間液：使用100 μL 移液器分別依次吸取99.9 μL、98.7 μL、94.4 μL 和95.4 μL 的多西環(huán)素、四環(huán)素鹽酸鹽、金霉素鹽酸鹽、鹽酸土霉素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液定容至10 mL 配制成濃度為10.00 μg·mL-1四環(huán)素類(lèi)混標(biāo)溶液，再使用1 mL 移液器吸取1 mL 混標(biāo)溶液配制成1.00 μg·mL-1混標(biāo)中間液。

標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液按1.3.3 步驟配制。根據(jù)證書(shū)查詢并計(jì)算可得溶劑為甲醇時(shí)移液槍和容量瓶產(chǎn)生的不確定度，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 溶劑為甲醇時(shí)移液槍和容量瓶產(chǎn)生的不確定度表

則可計(jì)算得出配制標(biāo)準(zhǔn)中間液和標(biāo)準(zhǔn)工作液過(guò)程中引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.3 稱(chēng)量樣品引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(m)

實(shí)驗(yàn)稱(chēng)取2 g（準(zhǔn)確至±0.02 g）樣品，由電子天平檢定證書(shū)可得，當(dāng)稱(chēng)樣范圍在0～50 g 時(shí)，其最大允許誤差為±0.01 g，采用B 類(lèi)方法評(píng)定，按均勻分布，則稱(chēng)量樣品引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(m)為0.002 89。

2.4 樣品處理引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(V總)

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中影響定量的步驟有3 部分。①樣品提取3 次，分3 次加入6 mL Na2EDTA-Mcllvaine 緩沖溶液和1 次2.0 mL 醋酸鉛溶液提取，使用10 mL 分度吸量管3次，使用2 mL分度吸量管1次。②精確取10.0 mL提取液上樣固相萃取柱，使用10 mL 分度吸量管1 次。③用1.0 mL 的0.1%甲酸水溶液溶解殘留物，使用1 mL 移液槍1 次。產(chǎn)生不確定度的主要來(lái)源是吸取提取液的10 mL 刻度吸管、2 mL 刻度吸管和1 mL 移液槍。根據(jù)檢定證書(shū)可得10 mL 刻度吸管的允許誤差為±0.05 mL，2 mL 刻度吸管的允許誤差為±0.012 mL，采用B 類(lèi)方法評(píng)定，按均勻分布，根據(jù)文獻(xiàn)[14]計(jì)算公式可得10 mL 分度吸量管引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(V10mL)為0.004 81，2 mL 分度吸量管引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(V2mL)為0.003 46。根據(jù)表3可得1 mL 移液槍引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(V1mL)為0.005 77。實(shí)驗(yàn)用的提取液均用純水配制，緩沖鹽等物質(zhì)占比較小，所以提取液的膨脹系數(shù)均以水的膨脹系數(shù)計(jì)算。水的膨脹系數(shù)為2.08×10-4℃-1，實(shí)驗(yàn)室的溫度變化范圍是（20±5）℃，按均勻分布，則由溫度引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

由此可得實(shí)驗(yàn)過(guò)程中樣品前處理經(jīng)過(guò)稀釋濃縮富集后引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(curve)

將標(biāo)準(zhǔn)曲線的5 個(gè)濃度點(diǎn)的工作液上液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀器檢測(cè)，每個(gè)濃度點(diǎn)重復(fù)測(cè)定3 次，橫坐標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，縱坐標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)曲線液質(zhì)圖譜峰面積，最小二乘法擬合得到線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)，標(biāo)準(zhǔn)曲線及加標(biāo)樣測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4和表5，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程及其擬合引入的相對(duì)不確定度表見(jiàn)表6。

表4 標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定峰面積表

表5 加標(biāo)樣測(cè)定結(jié)果表（n=6)

表6 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程及其擬合引入的相對(duì)不確定度表

線性回歸方程的標(biāo)準(zhǔn)差Sy的計(jì)算公式為

標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度計(jì)算公式為

標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合引入相對(duì)不確定度計(jì)算公式為

式中：Sy為標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)差；n為標(biāo)準(zhǔn)曲線校準(zhǔn)點(diǎn)的測(cè)量次數(shù)；a為校準(zhǔn)曲線的斜率；b為校準(zhǔn)曲線的截距；Ai為第i次測(cè)量時(shí)標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積；ci為第i次測(cè)量時(shí)標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，ng·mL-1；p為樣品溶液測(cè)量次數(shù)；c0為代入標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程所得的樣品溶液濃度的平均值，ng·mL-1；c曲線為標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度點(diǎn)的平均濃度，ng·mL-1。

2.6 樣品重復(fù)性測(cè)定引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(X)

取空白樣品加標(biāo)，加標(biāo)含量為20 μg·kg-1，經(jīng)提取處理后上機(jī)，用該曲線對(duì)加標(biāo)樣重復(fù)測(cè)定6 次，通過(guò)公式計(jì)算得到樣品重復(fù)性測(cè)定引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度，結(jié)果見(jiàn)表7。

標(biāo)準(zhǔn)偏差Sx的計(jì)算公式為

樣品重復(fù)性測(cè)定及回收率的標(biāo)準(zhǔn)不確定度的計(jì)算公式為

計(jì)算樣品重復(fù)測(cè)定及回收率的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

式中：Sx為樣品重復(fù)性測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)偏差；n為測(cè)量次數(shù)；Xi為樣品的測(cè)定值，μg·kg-1；為測(cè)定樣品的平均值，μg·kg-1。

2.7 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(W)

根據(jù)上述分析的不確定度計(jì)算合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(W)，結(jié)果見(jiàn)表7。計(jì)算公式為

表7 加標(biāo)樣對(duì)應(yīng)含量及其相關(guān)不確定度表

2.8 擴(kuò)展不確定度

根據(jù)表7中測(cè)得樣品中4 種化合物的平均含量，合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度的計(jì)算公式為u=urel(W)×，可得u(CTC)=0.053 9×18.6=1.002 54 μg·kg-1；u(DC)=0.049 3×18.8=0.926 84 μg·kg-1；u(OTC)=0.048 6×19.3=0.937 98 μg·kg-1；u(TC)=0.049×19.2=0.940 8 μg·kg-1。

根據(jù)《化學(xué)分析中測(cè)量不確定度評(píng)估指南》對(duì)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的規(guī)定[14]，在置信區(qū)間P=95%時(shí)，擴(kuò)展因子取k=2，擴(kuò)展不確定度計(jì)算公式為U=k×u。因此，U(CTC)=2×1.002 54=2.005 08 μg·kg-1；U(DC)=2×0.926 84=1.853 68 μg·kg-1；U(OTC)=2×0.937 98=1.875 96 μg·kg-1；U(TC)=2×0.940 8=1.881 6 μg·kg-1。最終測(cè)得金霉素含量為（18.6±2.0）μg·kg-1（k=2）；多西環(huán)素含量為（18.8±1.9）μg·kg-1（k=2）；土霉素含量為（19.3±1.9）μg·kg-1（k=2）；四環(huán)素含量為（19.2±1.9）μg·kg-1（k=2）。根據(jù)不確定度分析計(jì)算結(jié)果繪制四環(huán)素類(lèi)化合物不確定度分量占比圖，見(jiàn)圖2。

圖2 測(cè)定四環(huán)素類(lèi)4 種化合物的不確定度分量柱狀圖

3 結(jié)論

本研究依據(jù)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 水產(chǎn)品中土霉素、四環(huán)素、金霉素、多西環(huán)素殘留量的測(cè)定》（GB 31656.11—2021）測(cè)定蝦中四環(huán)素類(lèi)藥物的殘留量，對(duì)實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)生的各種不確定度進(jìn)行計(jì)算與評(píng)定。結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)曲線配制引入的不確定度最高，其次是標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度，而其他因素引入的不確定度相對(duì)較小。因此，通過(guò)選擇適合量程的高等級(jí)移液器與容量瓶、選擇合適的濃度點(diǎn)、減少標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋次數(shù)和標(biāo)曲擬合中選擇合適的權(quán)重方式，可提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度。同時(shí)，采取增加樣品測(cè)定次數(shù)、加標(biāo)回收、儀器比對(duì)、人員比對(duì)等質(zhì)控方式降低實(shí)驗(yàn)誤差，也是減小試驗(yàn)不確定度的有效途徑。