核苷（酸）類似物初治的慢性乙型肝炎患者發(fā)生低病毒血癥的影響因素及其動態(tài)變化分析

程齊齊，楊麗霞，蔡天盼，王 亮，孫 俊，梁佳圓，劉麗萍，甘 廈，阮寧杭，葛善飛

1南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院a.感染性疾病科，b.信息處，南昌 330006；2南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院，南昌 330031

慢性乙型肝炎（CHB）是由HBV持續(xù)感染引起的肝臟慢性炎癥性疾病。全世界約有2.57億人感染HBV［1］，我國HBV感染者高達普通人群的10%［2］，而CHB患者約有3000萬人［3］。因此，CHB仍是我國乃至全球肝臟疾病相關(guān)死亡率的主要原因。抗病毒治療是CHB的核心治療，核苷（酸）類似物（NAs）抗病毒效果強、服用方便且不良反應(yīng)少，在臨床上被廣泛應(yīng)用，但因其不能直接作用于肝細胞核內(nèi)的共價閉合環(huán)狀DNA（cccDNA），導(dǎo)致HBV感染難以完全治愈。隨著HBV DNA檢測靈敏度不斷的提高，許多既往認為獲得持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答（SVR）的患者經(jīng)高敏HBV DNA檢測后發(fā)現(xiàn)血清HBV DNA呈低水平復(fù)制，即低病毒血癥（low－level viremia，LLV）?，F(xiàn)有的研究［4－7］發(fā)現(xiàn)，LLV可引起耐藥、病毒學(xué)突破，甚至與肝纖維化、肝硬化以及肝癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。目前關(guān)于LLV預(yù)測模型及HBV血清學(xué)標志物的動態(tài)變化研究較少。本研究旨在通過回顧性分析NAs初治的CHB患者的臨床資料，明確LLV發(fā)生的影響因素以及治療期間患者的血清病毒學(xué)指標動態(tài)變化。

1 資料與方法

1.1 研究對象 回顧性分析2020年11月—2022年3月在南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院感染科門診就診的CHB患者。納入標準：所有CHB患者符合《慢性乙型肝炎防治指南（2019版）》［8］；接受一線NAs抗病毒治療至少12個月；基線HBV DNA≥2000 IU/mL。排除標準：同時合并其他類型肝炎病毒、HIV、EB病毒等；合并自身免疫性疾病、惡性腫瘤、嚴重基礎(chǔ)疾病等；至2022年3月，HBV DNA≥2000 IU/mL的患者；依從性差的患者；HBV耐藥突變的患者；基線資料或動態(tài)資料不全的患者。

1.2 研究方法 根據(jù)CHB患者治療期間的HBV DNA水平，將患者分為SVR組和LLV組。SVR組的定義是在達到了完全病毒學(xué)應(yīng)答后，HBV DNA持續(xù)檢測不到（＜20 IU/mL）；LLV組的定義為接受一線抗病毒藥物治療至少48周，患者血清HBV DNA持續(xù)性或間歇性可檢測到（≥20 IU/mL，但＜2000 IU/mL）［9］。

1.3 觀察指標 收集患者的一般資料，包括性別、年齡、BMI、家族史、有無肝硬化、有無代謝相關(guān)性脂肪性肝?。∕AFLD）；NAs類型包括恩替卡韋（ETV）、富馬酸替諾福韋（TDF）和富馬酸丙酚替諾福韋（TAF）；實驗室指標：基線及12、24、36及48周HBV DNA、HBsAg定量等HBV血清學(xué)標志物、肝腎功能、血常規(guī)；影像學(xué)指標：腹部彩超、LSM等。高敏HBV DNA定量檢測采用TaqMan實時熒光定量PCR（儀器：美國羅氏480實時熒光定量PCR儀），檢測下限為20 IU/mL。血清HBV標志物采用的是美國雅培公司Abbott ARCHITECT儀器及試劑分析。血常規(guī)、血生化等指標均在南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗科完成。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS26.0和MedCalc 20.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理，Graphpad Prism 8.0軟件進行繪圖。符合正態(tài)分布的計量資料采用±s表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；非正態(tài)分布的計量資料用M（P25～P75）表示，兩組間比較采用Mann－Whitney U檢驗。計數(shù)資料兩組間比較采用χ2檢驗或Fisher精確檢驗。多因素二元Logistic回歸分析CHB患者發(fā)生LLV的獨立影響因素，并建立預(yù)測模型，采用Hosmer－Lemeshow檢驗評估模型的擬合度，運用受試者工作特征曲線（ROC曲線）并計算曲線下面積（AUC）評估相關(guān)因素及模型對CHB患者發(fā)生LLV的預(yù)測價值。采用Kaplan－Meier分析HBV DNA累積陰轉(zhuǎn)率，應(yīng)用Log－rank檢驗進行比較。采用重復(fù)測量資料方差分析比較兩組間或組內(nèi)0、12、24、36、48周HBV DNA和HBsAg水平及其變化的差異。HBV DNA及HBsAg定量進行l(wèi)g轉(zhuǎn)化。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 本研究共納入CHB患者78例，SVR組58例（74.4%），LLV組20例（25.6%）?；颊叨酁槟行裕?9.2%），年齡29～39歲，中位年齡32歲。LLV組HBeAg陽性率、HBV DNA、HBsAg水平高于SVR組，年齡、ALT、AST、LSM低于SVR組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P值均＜0.05）（表1）。

2.2 CHB患者發(fā)生LLV多因素分析及預(yù)測模型建立 將單因素分析（表1）中差異具有統(tǒng)計學(xué)意義的指標納入多因素Logistic回歸分析，使用BOX－Tidwell方法檢驗自變量與因變量的logit轉(zhuǎn)換值之間是否存在線性關(guān)系，運用容忍度、方差膨脹因子檢驗自變量之間的多重共線性，結(jié)果顯示容差值均0.1～1.0，VIF值均＜10，表明所納入的自變量之間不存在共線性。多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示，基線HBV DNA（OR＝2．365，95%CI：1．220～4．587，P＝0.011）、基線HBsAg（OR＝4．229，95%CI：1.098～16．287，P＝0.036）是影響CHB患者發(fā)生LLV的獨立危險因素，而ALT（OR＝0．965，95%CI：0．937～0.994，P＝0.018）是獨立保護性因素。根據(jù)多因素分析結(jié)果，將HBV DNA、HBsAg和ALT再次行二元Logistics回歸分析，根據(jù)回歸系數(shù)作為危險因素的權(quán)重（表2），建立CHB患者發(fā)生LLV的預(yù)測模型（MLLV），計算公式為：Logit（MLLV）＝－8.668＋1.441×lgHBsAg＋0.598×lgHBV DNA－0.016×ALT，LLV發(fā)生概率P＝elogit（MLLV）/（1＋elogit（MLLV））。回歸模型系數(shù)的綜合檢驗結(jié)果顯示P＜0.001，采用Hosmer－Lemeshow檢驗，結(jié)果顯示χ2＝11.625，P＝0.169，表明模型與觀察值擬合度較好（圖1）。

表2 MLLV模型的建立Table 2 Establishment of the MLLV model

圖1 Logistic回歸模型的校準度Figure 1 Calibration curve of logistic regression model

表1 CHB患者基線臨床特征和實驗室指標分析Table 1 Analysis of baseline clinical characteristics and laboratory indexes of CHB patients

2.3 MLLV模型預(yù)測價值的分析 通過繪制HBV DNA、HBsAg、ALT和MLLV模型的ROC曲線，分析各指標和模型的預(yù)測價值（表3，圖2）。結(jié)果顯示，MLLV模型預(yù)測CHB患者發(fā)生LLV的AUC值明顯大于HBV DNA、HBsAg、ATL單獨預(yù)測的AUC值。MLLV模型的最佳截斷值為0.44，對應(yīng)的敏感度為85.00%，特異度為93.10%，AUC值為0.931，95%CI為0.850～0.976，提示該模型具有較好的預(yù)測效能（P＜0.001）。

圖2 HBV DNA、HBsAg、ALT和MLLV模型的ROC曲線Figure 2 ROC curve of HBV DNA，HBsAg，ALT and MLLV models

2.4 不同基線HBV DNA和HBsAg的CHB患者DNA累積陰轉(zhuǎn)率 根據(jù)基線HBVDNA的截斷值（表3）將患者分為HBV DNA＞7.29 lgIU/mL組和HBV DNA≤7.29 lgIU/mL組，進一步使用二元Logistic回歸分析，結(jié)果提示基線HBV DNA＞7.29 lgIU/mL的患者LLV的發(fā)生風(fēng)險是基線HBV DNA≤7.29 lgIU/mL患者的8.944倍（P＜0.001）；同樣對根據(jù)HBsAg截斷值分組的患者進行分析，發(fā)現(xiàn)HBsAg＞4.38 lgIU/mL患者LLV的發(fā)生風(fēng)險是HBsAg≤4.38 lgIU/mL患者的35.417倍（P＜0.001）。進一步使用Kaplan－Meier曲線分析不同基線HBV DNA的CHB患者的HBV DNA累積陰轉(zhuǎn)率，發(fā)現(xiàn)隨著治療時間的延長，兩組患者HBV DNA的陰轉(zhuǎn)率逐漸提高，但基線HBV DNA＜7.29 lgIU/mL組患者HBV DNA陰轉(zhuǎn)率始終高于另一組（χ2＝22．52，P＜0.001）（圖3a）；同樣使用Kaplan－Meier曲線分析不同基線HBsAg的CHB患者HBV DNA的累積陰轉(zhuǎn)率，結(jié)果顯示，基線HBsAg≤4.38 lgIU/mL組患者HBV DNA陰轉(zhuǎn)率始終高于另一組（χ2＝26．35，P＜0.001）（圖3b）。

圖3 不同基線HBV DNA和HBsAg的CHB患者HBV DNA累積轉(zhuǎn)陰率Figure 3 Cumulative negative rate of HBV DNA in CHB patients with different baseline HBV DNA and HBsAg

表3 HBV DNA、HBsAg、ALT和MLLV對LLV發(fā)生的預(yù)測價值Table 3 Predictive value of HBV DNA，HBsAg，ALT and MLLV for the occurrence of LLV

2.5 治療期間HBV DNA、HBsAg動態(tài)變化分析 CHB患者治療期間HBV DNA、HBsAg水平均逐漸下降（圖4），呈先快后慢的趨勢，HBV DNA在第12周下降幅度最大［（3.07±1.39）lgIU/mL］，在治療12周后下降幅度逐漸減?。▓D5a），而HBsAg在第24周下降幅度最大［（0.77±0.32）lgIU/mL］（圖5b）。

圖4 兩組患者HBV DNA和HBsAg水平變化Figure 4 Dynamic changes of HBV DNA and HBsAg in two groups

圖5 所有患者HBV DNA和HBsAg下降幅度變化Figure 5 The decrease range changes of HBV DNA and HBsAg

LLV組和SVR組患者隨著治療時間的延長，HBV DNA和HBsAg水平均持續(xù)下降，組內(nèi)比較差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P值均＜0.05）（表4），且LLV組患者在治療基線、12周、24周、36周、48周時的HBV DNA和HBsAg水平始終高于SVR組（P值均＜0.05）。LLV組在第12周和第24周時的HBV DNA下降幅度分別為（3.27±1.07）lgIU/mL、（4.41±1.36）lgIU/mL，而SVR組第12周和第24周時的HBV DNA下降幅度分別為（3.01±1.49）lgIU/mL、（3.80±1.49）lgIU/mL，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P值均＞0.05）。對兩組在第12周和第24周的HBsAg下降幅度進行分析，發(fā)現(xiàn)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P值均＞0.05）。

表4 CHB患者治療期間HBV DNA和HBsAg動態(tài)變化Table 4 Dynamic changes of HBV DNA level and HBsAg level in CHB patients during treatment

3 討論

HBV感染是我國終末期肝病發(fā)生的主要原因，而口服NAs仍是抗病毒治療的主要方法，一些具有強效抑制病毒和低耐藥的藥物，如ETV、TDF、TAF，已被推薦為一線用藥［10－11］。然而，隨著核酸檢測技術(shù)的不斷進步，HBV DNA的檢測下限逐漸被突破，越來越多的患者在抗病毒治療過程中檢測到HBV DNA呈低水平復(fù)制。日本學(xué)者［12］研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)ETV治療48周的CHB患者，約19.9%的患者HBV DNA陽性，而TDF和TAF單藥治療的患者HBV DNA陽性率分別為21.2%和21.5%［13］。其他真實世界的研究表明，即使是使用一線抗病毒藥物，仍有20%～40%的患者會發(fā)生LLV［6，14－15］，本研究中CHB患者的LLV發(fā)生率為25.6%，與既往臨床研究結(jié)果大致相符。目前，關(guān)于NAs經(jīng)治的CHB患者發(fā)生LLV的機制尚未完全明確，可能的機制有：（1）NAs藥物競爭性抑制的局限性；（2）宿主免疫功能較弱或未恢復(fù)；（3）部分患者肝細胞處于增殖不活躍狀態(tài)［15］。

ALT水平可反應(yīng)宿主免疫狀態(tài)，在宿主對感染肝細胞的免疫清除過程中，ALT隨著免疫反應(yīng)的增強而逐漸升高，因此高水平的ALT是宿主免疫活躍的標志。有文獻［16］報道，NAs治療的CHB患者ALT在正常范圍內(nèi)或處于低水平可能與LLV的發(fā)生相關(guān)。另有研究［17］發(fā)現(xiàn)，ALT＞2倍正常值上限（ULN）的CHB患者經(jīng)NAs治療后HBV DNA下降的比例高于ALT在1.3～2×ULN的患者。本研究結(jié)果顯示，達到SVR的患者在接受NAs抗病毒治療時的ALT水平＞2×ULN，明顯高于發(fā)生LLV的患者，說明接受抗病毒治療時高水平的ALT是發(fā)生LLV的保護性因素（OR＝0．965，95%CI：0．937～0．994，P＝0.018）。因此，基線高ALT的CHB患者接受抗病毒治療后可能會獲得更好的病毒學(xué)應(yīng)答效果。

HBV DNA可直接反映CHB患者體內(nèi)病毒復(fù)制水平，在患者治療和隨訪過程中具有非常重要的作用。一項納入875例CHB患者的研究［9］結(jié)果顯示基線HBV DNA水平與LLV相關(guān)。Zhang等［18］研究發(fā)現(xiàn)基線高水平HBV DNA（＞6 lgIU/L）時LLV發(fā)生率明顯高于基線HBV DNA≤6 lgIU/L患者。本研究中，LLV組患者基線HBV DNA水平顯著高于SVR組，基線HBV DNA是LLV發(fā)生獨立危險因素。進一步對HBV DNA分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)基線HBV DNA＞7.29 lgIU/mL時，HBV DNA陰轉(zhuǎn)率會降低，而LLV發(fā)生風(fēng)險將增加8倍以上，提示基線HBV DNA水平越高，發(fā)生LLV風(fēng)險越大。

HBsAg作為HBV感染的重要標志物在臨床上廣泛應(yīng)用，HBV感染的不同階段，HBsAg水平差別甚大。有研究［19］認為HBsAg是以cccDNA模板合成的，可在一定程度上反映HBV的復(fù)制情況。本研究對CHB患者的HBsAg與LLV的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，基線高水平HBsAg是LLV發(fā)生獨立危險因素，HBsAg越高，HBV DNA陰轉(zhuǎn)率會降低，LLV發(fā)生風(fēng)險越高。這與其他研究的結(jié)果大致相同［20－21］。

HBeAg作為HBV核心基因的一部分，是HBV復(fù)制的重要指標。有研究［22］發(fā)現(xiàn)長期ETV經(jīng)治的CHB患者中LLV患者的陽性率為88.2%，本研究中LLV組患者HBeAg的陽性率達90%，與既往研究大致相符。Kim等［15］研究發(fā)現(xiàn)基線HBeAg陽性是長期ETV經(jīng)治CHB患者發(fā)生LLV的獨立危險因素，陳賀等［22］研究也得出此結(jié)論。本研究結(jié)果顯示，HBeAg陽性并非CHB患者發(fā)生LLV的獨立危險因素，與上述文獻觀點有所不同，考慮與本研究中HBeAg陽性和HBeAg陰性患者的基線ALT水平［127.5（54.0～217.0）U/L vs 111.4（44.3～230.0）U/L］差異無統(tǒng)計學(xué)意義（Z＝1．214，P＝0.225），兩組患者所處的免疫狀態(tài)有關(guān)，其次可能與樣本量較少有關(guān)。

關(guān)于LLV發(fā)生預(yù)測模型的研究較少，本研究以HBV DNA、HBsAg和ALT構(gòu)建了LLV發(fā)生的預(yù)測模型MLLV，結(jié)果顯示MLLV預(yù)測效能最高（AUC＝0.931），敏感度、特異度分別為85.00%、93.10%，為LLV的發(fā)生提供了簡捷、可靠的預(yù)測模型，該模型以反映HBV復(fù)制及肝臟炎癥為基礎(chǔ)構(gòu)建，可較客觀呈現(xiàn)CHB患者肝細胞內(nèi)病毒復(fù)制和肝臟損傷情況，對CHB患者抗病毒治療的預(yù)后有一定的參考價值。進一步對CHB患者血清HBV DNA及HBsAg的動態(tài)變化分析發(fā)現(xiàn)，抗病毒治療過程中HBV DNA和HBsAg都呈逐漸下降趨勢，但發(fā)生LLV的患者HBV DNA及HBsAg水平始終高于SVR患者，隨著治療時間的延長，兩者下降的速度也逐漸減慢。Lim等［23］研究發(fā)現(xiàn)，使用NAs抗病毒治療過程中，HBsAg動態(tài)變化是HBsAg清除的有力預(yù)測因子。因此，對CHB患者在抗病毒治療過程中監(jiān)測血清HBV DNA及HBsAg的動態(tài)變化具有重要的意義。

綜述所述，基線HBV DNA、HBsAg和ALT是NAs治療的CHB患者發(fā)生LLV的獨立影響因素，以此建構(gòu)的預(yù)測模型可以較準確的預(yù)測LLV的發(fā)生發(fā)展。此外，HBV DNA、HBsAg的動態(tài)變化對CHB患者抗病毒治療具有一定的指導(dǎo)作用。但本研究樣本量較少，只構(gòu)建了預(yù)測模型，尚未能進行驗證模型驗證，下一步將擴大樣本量，驗證該模型及結(jié)論，積極探討LLV的干預(yù)措施，并進一步探究其發(fā)生的機制，為LLV患者的管理提供參考。

倫理學(xué)聲明：本研究于2021年8月19日經(jīng)南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準實施，批號：（2021）醫(yī)研倫審第（8－016）號。所有患者均簽署知情同意書。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監(jiān)護人以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻聲明：程齊齊負責(zé)數(shù)據(jù)采集、數(shù)據(jù)分析、文章撰寫；楊麗霞、蔡天盼、甘廈負責(zé)支持指導(dǎo)、修改論文；王亮、孫俊、梁佳圓、劉麗萍、阮寧杭負責(zé)數(shù)據(jù)采集及分析；葛善飛負責(zé)研究設(shè)計，擬定寫作思路，指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。