丁成龍 劉瀅 劉爽(佳木斯大學(xué) 附屬第一醫(yī)院病理科,黑龍江 佳木斯 5400; 臨床醫(yī)學(xué)院; 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院)

微小核糖核酸(microRNA) 又稱(chēng)miRNA 或miR,是目前研究最為深入的一類(lèi)非編碼RNA。至今人類(lèi)已發(fā)現(xiàn)超過(guò)2 000 種與疾病相關(guān)的miRNA。即使miRNA 的檢測(cè)方法眾多,但有部分學(xué)者認(rèn)為,想要真正證明miRNA 的作用和位置,原位雜交(ISH)技術(shù)必不可少。因此,本文從探針、標(biāo)記物、檢測(cè)系統(tǒng)等方面總結(jié)ISH 技術(shù)的當(dāng)前進(jìn)展,分析探討其優(yōu)勢(shì)和局限性,為臨床病理檢測(cè)提供新路徑。

1 ISH 概述

ISH 是指通過(guò)已知特定的標(biāo)記探針與組織樣本中待檢測(cè)的分子特異性結(jié)合的分子檢測(cè)技術(shù),廣泛用于分子和細(xì)胞病理學(xué)研究領(lǐng)域。ISH 起源于20世紀(jì)70年代,最初是由美國(guó)耶魯大學(xué)的Gall 等〔1〕使用核糖體基因探針確定其定位于卵母細(xì)胞的核仁中。同年,Buongiorno-Nardelli 等〔2〕在中國(guó)倉(cāng)鼠組織切片中使用3H 標(biāo)記的rRNA 探針,首次成功使用ISH。由于同位素標(biāo)記探針使用范圍局限,傳統(tǒng)生物標(biāo)記法和核酸探針不斷改良,ISH 檢測(cè)范圍也從提供基因和染色體的相對(duì)位置關(guān)系逐漸擴(kuò)展到原位檢測(cè)RNA 和miRNA。MiRNA 是一類(lèi)長(zhǎng)約22 個(gè)核苷酸的非編碼小RNA 分子。它們通常在介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后發(fā)生基因沉默。因其不作為蛋白質(zhì)合成的直接模板不能進(jìn)行免疫組化檢查。其中能對(duì)單個(gè)細(xì)胞水平和定位了解的唯一方式就是ISH。2006年,Nelson等〔3〕首次使用ISH 檢測(cè)miRNA。近年來(lái)隨著ISH在miRNA 研究的重要性不斷提高,其檢測(cè)方法也不斷細(xì)化。從材料上看,已經(jīng)報(bào)道的miRNA ISH 實(shí)驗(yàn)方案中包括應(yīng)用石蠟組織切片、低溫冷凍組織切片和細(xì)胞等。由于石蠟包埋組織塊便于長(zhǎng)期保存,有利于回顧性研究,因此石蠟組織切片在miRNA ISH技術(shù)中應(yīng)用最為廣泛。

2 ISH 技術(shù)優(yōu)勢(shì)

2.1 定位效應(yīng) 由于miRNA 分子量小、長(zhǎng)度短且表達(dá)水平低、易降解,因此主要采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、微陣列雜交、基因克隆和ISH 等方法檢測(cè)miRNA 的表達(dá)情況。由于前幾種方法雖然能定量顯示miRNA 的表達(dá),但都無(wú)法檢測(cè)miRNA 在組織或細(xì)胞中的定位情況。而ISH 的優(yōu)勢(shì)在于其能監(jiān)測(cè)miRNA 在細(xì)胞和亞細(xì)胞的分布和組織學(xué)定位,并確定其空間表達(dá)譜。一般來(lái)說(shuō),miRNA 定位于細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)或是細(xì)胞外基質(zhì)十分重要。Eckstein等〔4〕使用免疫熒光雙重染色對(duì)前列腺癌細(xì)胞中的miRNA 進(jìn)行定位。研究表明,miR-375 主要定位于腫瘤細(xì)胞尤其是腔腺細(xì)胞的核仁中。而在模式4 組(GP4)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移標(biāo)本中,miR-145 在間質(zhì)細(xì)胞中僅在細(xì)胞核中表達(dá),而在腫瘤細(xì)胞中不表達(dá)。

此外,在小鼠腦組織中miRNA 的表達(dá)部位也各有特點(diǎn)。其中,miR-9 主要位于梨狀皮質(zhì)、海馬CA和DG 區(qū),而miR-100 主要在DG 的亞顆粒區(qū),在海馬CA1 和基底外側(cè)杏仁核中強(qiáng)烈表達(dá)。除了正常組織功能定位,腫瘤組織及癌旁組織中miRNA 的表達(dá)及定位的差異尤為重要〔5〕。通過(guò)ISH 對(duì)比同一區(qū)域非小細(xì)胞肺癌組織和正常肺組織的miRNA-148a 的表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)在癌組織中miRNA-148a 弱染色,而鄰近正常肺組織中呈現(xiàn)強(qiáng)染色,表明miRNA-148a 在肺癌組織中被下調(diào)〔6〕。

2.2 半定量分析 除了進(jìn)行組織定位,ISH 還可以聯(lián)合其他生物學(xué)方法進(jìn)行定量分析。在黑色素瘤細(xì)胞中,miR-21 和miR-125b 存在異常表達(dá)。數(shù)字圖像分析定量的ISH 進(jìn)一步顯示miR-21ISH 在黑色素瘤中表達(dá)增加,而miR-125b 的定量顯示在痣和黑色素瘤中表達(dá)一致〔7〕。Nizyaeva 等〔8〕通過(guò)石蠟切片和地高辛(DIG)ISH 檢測(cè)先兆子癇和晚期子癇前期孕婦胎盤(pán)絨毛中miRNA-146a 和miRNA-155 的表達(dá)。與足月妊娠相比,先兆子癇晚期孕婦絨毛細(xì)胞中miRNA-155 和miRNA-146a 的表達(dá)均減少〔8〕。另外,Wang 等〔9〕通過(guò)ISH 發(fā)現(xiàn),在正常的胃黏膜上皮細(xì)胞和胃癌細(xì)胞中均有miR-214 的表達(dá),且胃癌組織中的表達(dá)程度明顯降低。

3 在miRNA 檢測(cè)中ISH 方法進(jìn)展

經(jīng)典的ISH 過(guò)程是依賴(lài)于核酸探針與固定細(xì)胞或組織中特異性序列互補(bǔ),并通過(guò)顯色、熒光或電子顯微鏡等方法可視化雜交探針來(lái)進(jìn)行檢測(cè)。在miRNA 檢測(cè)中,影響ISH 技術(shù)效果的關(guān)鍵變量主要包括使用探針的類(lèi)型、標(biāo)記物和檢測(cè)系統(tǒng)。其中,多數(shù)新型ISH 技術(shù)可通過(guò)調(diào)整方法變量達(dá)到期望要求,以下將分別追蹤這3 個(gè)方面的進(jìn)展闡述ISH 的發(fā)展過(guò)程。

3.1 探針發(fā)展 探針設(shè)計(jì)是ISH 實(shí)驗(yàn)中關(guān)鍵步驟之一,常見(jiàn)的探針包括寡核苷酸探針、cDNA 探針和cRNA 探針〔10〕。通常用于甲醛溶液固定或石蠟切片的探針最佳大小為20～500 個(gè)堿基對(duì)。miRNA 檢測(cè)中常見(jiàn)的ISH 探針,見(jiàn)表1。但在miRNA 原位雜交實(shí)驗(yàn)中,由于miRNA 尺寸較短,傳統(tǒng)的DNA 或RNA 探針與靶序列結(jié)合的親和力較低。因此,許多學(xué)者通過(guò)修飾探針組件提高探針與靶標(biāo)的親和力和特異性用于改進(jìn)ISH 在miRNA 中的應(yīng)用。目前miRNA ISH 探針?lè)譃? 類(lèi):線(xiàn)性探針或“擴(kuò)增”探針。

表1 常見(jiàn)的ISH 探針

3.1.1 線(xiàn)性探針 LNA 是最廣泛用于miRNA ISH探針之一,也被視為是miRNA 特異性診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。其結(jié)構(gòu)主要是通過(guò)2′-O、4′-C 構(gòu)成亞甲基橋,將核酸鎖在C3′內(nèi)構(gòu)象中。與傳統(tǒng)寡核苷酸探針相比,使用具有LNA 合成的探針能適應(yīng)更高的雜交溫度,且穩(wěn)定所得的雙鏈體達(dá)到更高的特異性。Chu等〔18〕使用雙地高辛標(biāo)記的LNA 探針檢測(cè)結(jié)果顯示44%原發(fā)甲狀腺癌患者miR-21 呈現(xiàn)出強(qiáng)表達(dá)。雖然其優(yōu)勢(shì)明顯,但其價(jià)格昂貴也相對(duì)限制其使用范圍。因此,在LNA 探針基礎(chǔ)上進(jìn)行修飾是目前較為主流的探針選擇。早期發(fā)現(xiàn)在LNA 探針3、6、15、20 位的堿基處添加2′-氟修飾的RNA 殘基(2′-F RNA) 后miR-146b 和miR-375 穩(wěn)定性增強(qiáng)〔19〕。2019年,Azevedo 等〔20〕發(fā)現(xiàn)2′-O-Me 修飾的探針能克服熒光原位雜交分析(DNA-FISH)低細(xì)胞通透性、低親和力和低核酸敏感性等缺點(diǎn)?？梢?jiàn)LNA 和2′-O-Me 結(jié)合探針比其他探針具有更高的設(shè)計(jì)靈活性。2020年Minogue 等〔21〕提出可利用核糖使LNA探針在2′-O 與4′-C 之間形成橋連結(jié)構(gòu),修飾的探針有利于增加反應(yīng)的特異性并允許較低的信噪比。而基于此的ISH 技術(shù)能使miRNA 如miR-35-3p 在雌雄同體的性腺中以單細(xì)胞分辨率重復(fù)顯示〔21〕。

3.1.2 “擴(kuò)增”探針 為增加低頻度miRNA 分子信號(hào)強(qiáng)度,與序列擴(kuò)增技術(shù)結(jié)合的探針開(kāi)始應(yīng)用于ISH 中?！皵U(kuò)增”探針相比于線(xiàn)性探針,其不僅可以成功檢測(cè)miRNA,而且還可以進(jìn)一步檢測(cè)序列。比如環(huán)形探針一般是通過(guò)DNA 連接酶使線(xiàn)性DNA 探針退到兩端特定序列后進(jìn)行環(huán)化。形成的圓環(huán)結(jié)構(gòu)能通過(guò)滾輪效應(yīng)進(jìn)一步放大信號(hào)甚至延長(zhǎng)序列。起初,Ge 等〔22〕通過(guò)在體外將探針與DNA 鏈接酶結(jié)合,然后形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)最后與靶序列雜交,檢測(cè)人肝癌SMMC-7721 細(xì)胞和正常肝臟LO2 細(xì)胞中miR-222 表達(dá)水平。此外,還有一種滾環(huán)擴(kuò)增法使用的探針,利用這種探針進(jìn)行的ISH 過(guò)程能在生理溫度下高特異性鑒定miRNA,并在3 小時(shí)內(nèi)于單個(gè)細(xì)胞中原位觀察標(biāo)記的miRNA〔23〕。

3.2 標(biāo)志物發(fā)展 在大多數(shù)miRNA 原位雜交實(shí)驗(yàn)中,寡核苷酸探針首選的標(biāo)志物是DIG。DIG 是從洋地黃類(lèi)植物(毛地黃和毛花毛地黃)中提取的類(lèi)固醇物質(zhì),在敏感性和質(zhì)量控制上明顯優(yōu)于其他的生物標(biāo)志物。2018年,Memi 等〔24〕通過(guò)使用DIG 標(biāo)的LNA 探針在小鼠心臟組織切片中檢測(cè)到miRNA-182 的表達(dá),進(jìn)一步免疫染色顯示,心肌肌鈣蛋白(cTn)T 能和miRNA-182 共同定位在心肌細(xì)胞。也有報(bào)道稱(chēng),miR-138 可作為功能性腫瘤抑制因子,其與口腔鱗狀細(xì)胞轉(zhuǎn)移程度呈負(fù)相關(guān)。可通過(guò)DIG標(biāo)記的miRNA 探針原位測(cè)量證實(shí)〔25〕。

除了DIG,新型的生物標(biāo)志物也不斷涌現(xiàn),包括羧基熒光素(6-FAM),溴脫氧尿苷(BRDU)和生物素等。2016年,Zhmurov 等〔26〕通過(guò)6-FAM 標(biāo)記定位了miR-126-3p 和miR-126-5p,證實(shí)它們與動(dòng)脈斑塊硬化內(nèi)新生血管相關(guān)能促進(jìn)疾病發(fā)展。最近,Kaur等〔27〕在視網(wǎng)膜細(xì)胞中利用BRDU 標(biāo)記進(jìn)行熒光共定位檢測(cè)Shh 信號(hào)傳導(dǎo)通路對(duì)視網(wǎng)膜再生的作用,結(jié)果發(fā)現(xiàn)Shh 信號(hào)通路受let-7 miRNA 的調(diào)節(jié)。BRDU 標(biāo)記檢測(cè)的miRNA 穩(wěn)定性更強(qiáng),效果更佳。在ISH 技術(shù)發(fā)展中,生物素也是近幾年的研究熱點(diǎn)。與DIG 不同,如果使用生物素作為半抗原標(biāo)志物,則需要同時(shí)選擇合適的生物素阻斷劑來(lái)阻止生物素與內(nèi)源生物素的結(jié)合,生物素易同內(nèi)源生物素存在潛在的交叉反應(yīng)〔28〕。

3.3 檢測(cè)系統(tǒng)發(fā)展 在探索新型ISH 技術(shù)過(guò)程中,除了考慮傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)變量,更多的技術(shù)革新點(diǎn)主要集中在檢測(cè)系統(tǒng)上。間接染色法是最初在ISH 檢測(cè)中最常用的染色方法。但是由于miRNA 分子量小,表達(dá)量有限,早期染色方法明顯觀察不清miRNA 的表達(dá),因此逐漸研發(fā)出基于放大信號(hào)的檢測(cè)系統(tǒng)構(gòu)成二代ISH 檢測(cè)方法。LAB/LSAB 是利用高親和力的抗生素-生物素/鏈霉素標(biāo)價(jià)法構(gòu)成的敏感性ICH檢測(cè)方法,Diamandis 等〔29〕發(fā)現(xiàn)使用這種方法的親和力是抗原-抗體相互作用的103～106 倍。同時(shí),該種檢測(cè)方法還能避免洗滌液、PH 變化對(duì)組織切片的影響,靈敏度更高。Shi 等〔30〕使用另外一種放大信號(hào)檢測(cè)miRNA 的方法,名為抗生素蛋白-生物素復(fù)合法(ABC),但在實(shí)際應(yīng)用中因?yàn)槠涿舾卸缺萀SAB 法低5～10 倍,晶體尺寸過(guò)大限制其滲透到細(xì)胞中,使其應(yīng)用受到局限。

相比上面的檢測(cè)系統(tǒng),酶標(biāo)記的熒光信號(hào)放大法(ELF)在目前應(yīng)用較為成熟。其主要通過(guò)磷酸酶進(jìn)行發(fā)光底物裂解,沉淀出黃綠色熒光產(chǎn)物進(jìn)行miRNA 分析。2016年,Lv 等〔31〕在食管癌患者標(biāo)本中通過(guò)使用ELF 檢測(cè)發(fā)現(xiàn),同比癌旁組織,在哈薩克族和維吾爾族食管癌患者中miR-21 明顯上調(diào),miR-375 表達(dá)水平降低。隨著納米技術(shù)不斷發(fā)展,近年來(lái)將納米材料用于miRNA ISH 領(lǐng)域也成為一種新的檢測(cè)miRNA 的手段,同時(shí)也是目前發(fā)展最快的領(lǐng)域之一。Ge 等〔22〕發(fā)現(xiàn)納米殼層的使用能克服有機(jī)熒光團(tuán)特有的困難,增加光穩(wěn)定性和強(qiáng)度,同時(shí)使納米殼層更好地穿透細(xì)胞膜,對(duì)miRNA 靶標(biāo)具有高度特異性。

綜上,miRNA ISH 已經(jīng)廣泛用于臨床診斷。盡管ISH 是唯一能夠定位miRNA 的方法,但其仍然具有局限性。一方面,ISH 的定量效應(yīng)是不完全的,只能結(jié)合其他檢測(cè)方法進(jìn)行實(shí)際量化。同時(shí),雖然能原位捕獲miRNA 但仍然沒(méi)有辦法區(qū)分其功能狀態(tài)。另一個(gè)不能忽視的方面是ISH 的單分子檢測(cè)效率低,固定要求高。因此,如何克服ISH 技術(shù)在miRNA 檢測(cè)上的局限性?xún)?yōu)化是目前需要解決的問(wèn)題。