宮偉 王亞娟 袁素平( 保定市第一醫(yī)院麻醉科,河北 保定 07000; 保定市婦幼保健院麻醉科; 中國人民解放軍5 醫(yī)院麻醉科)

2018年,肺癌有210 萬例新病例和180 萬例死亡病例,是最常診斷的癌癥(占總病例的11.6%)和癌癥死亡的主要原因(占癌癥總死亡人數(shù)的18.4%)〔1〕。肺癌患者5年生存率為4%～17%,取決于不同的階段和地區(qū)差異〔2〕,肺癌的治療仍面臨著巨大挑戰(zhàn)。阿片類藥物被廣泛用于緩解疼痛,包括晚期癌癥患者的慢性疼痛。在阿片類藥物中,嗎啡是臨床治療嚴重疼痛最有效的藥物之一。在過去的幾十年里,關(guān)于嗎啡等阿片類藥物對腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的可能影響一直存在爭議〔3〕。如嗎啡能刺激腎細胞癌786-O、RLC-310 細胞的增殖,促進細胞體外遷移、侵襲能力〔4〕,卻抑制人肝癌細胞的移動性、腫瘤干細胞的體外特性和體內(nèi)遷移能力〔5〕。因此,確定嗎啡是否會增加疼痛圍術(shù)期轉(zhuǎn)移的風(fēng)險具有重要意義。微小RNA(miRNA)調(diào)控許多生物學(xué)過程,包括細胞周期調(diào)控、細胞生長、增殖、分化、凋亡、代謝、轉(zhuǎn)移等,可作為肺癌等癌癥的潛在生物標(biāo)志物和治療靶點〔6,7〕。研究表明,miR-219-5p 在結(jié)直腸癌組織和細胞系中低表達,miR-219-5p 的上調(diào)發(fā)揮抑癌作用〔8,9〕。miR-219-5p 在非小細胞肺癌(NSCLC)中低表達,高表達miR-219-5p 抑制癌細胞的增殖和侵襲〔10〕。異丙酚通過上調(diào)候選腫瘤抑制因子miR-219-5p 的表達水平抑制肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲〔11〕。核因子(NF)-κB 信號通路參與肺癌細胞的遷移和侵襲〔12〕。目前,嗎啡是否通過miR-219-5p/NF-κB 信號通路來調(diào)控肺癌細胞增殖、遷移和侵襲等過程尚不清楚。本研究利用嗎啡處理體外培養(yǎng)的肺癌細胞A549,評估嗎啡對細胞增殖、遷移和侵襲的影響,并結(jié)合miR-219-5p 和NF-κB 信號通路,探索其作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 肺癌細胞A549 購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細胞資源中心,嗎啡購自東北制藥集團沈陽第一制藥有限公司,β 肌動蛋白(βactin)抗體、細胞周期蛋白(Cyclin)D1、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2、-9、NF-κB p65 購自美國Cellular Signaling Technology 公司,TRIzol、Lipofectamine 2000 購自美國Invitrogen 公司, 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號12594025)購自美國ThermoFisher 公司,miR-219-5p、anti-miR-219-5p 購自武漢淼靈生物科技有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng) A549 細胞在含有10%胎牛血清DMEM 培養(yǎng)基中,并置于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。根據(jù)不同實驗?zāi)康?在第3 代處于對數(shù)生長期的A549 細胞中加入5、10、25 μmol/L 嗎啡,并將正常培養(yǎng)的A549 細胞設(shè)為對照(NC)組。

1.3 噻唑藍(MTT)法檢測A549 細胞增殖 A549細胞以5×104個/ml 的濃度接種于96 孔板,培養(yǎng)24 h后,用5、10、25 μmol/L 濃度嗎啡處理48 h,進行細胞增殖檢測。每孔加入MTT 溶液(5 mg/ml)100 μl,孵育4 h,加入200 μl 二甲基亞砜(DMSO),震蕩孵育10 min 以溶解結(jié)晶,在490 nm 波長處利用酶標(biāo)儀測定吸光度(OD)值,計算細胞存活率。細胞存活率(%)= 實驗組OD 值/對照組OD 值×100%。

1.4 Transwell 小室法檢測A549 細胞遷移和侵襲

基質(zhì)膠以1 ∶5的比例與無血清DMEM 培養(yǎng)基混勻,上室添加50 μl,用于侵襲測定。未補充Matrigel膠的上室用于遷移測定。將10、25 μmol/L 濃度嗎啡處理后的A549 細胞重懸于無血清DMEM 培養(yǎng)基,并置于上室。下室中加入含10% 胎牛血清(FBS)的DMEM 培養(yǎng)基用作引誘劑。培養(yǎng)24 h 后,用無菌棉簽去除未穿過膜的細胞,4%甲醛固定遷移的細胞,并用1%結(jié)晶紫染色。通過顯微鏡捕獲遷移或侵襲的細胞圖像,并計數(shù)A549 細胞遷移或侵襲。

1.5 Western 印跡 A549 細胞加入RIPA 裂解緩沖液,12 000 r/min 離心10 min,獲取上清。20 μg 蛋白樣品用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離,轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜,分別與一抗(4℃,過夜)、二抗(室溫,1.5 h)孵育,化學(xué)發(fā)光液使蛋白可視化,β-actin 為內(nèi)參,進行MMP-2、MMP-9、CyclinD1、NF-κB、p65 蛋白表達量化分析。

1.6 實時熒光定量PCR(qPCR) 通過使用TRIzol試劑提取A549 細胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄試劑盒用于合成cDNA,以cDNA 為模板,進行qPCR 實驗。miR-219-5p 正向5′-GGTGATTGTCCAAACGG-3′,反向5′-CAGTGCGTGTCGTGGA-3′。內(nèi)參U6 正向5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′,反向5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。miR-219-5p 的表達量以2-ΔΔCt法計算。

1.7 細胞轉(zhuǎn)染 在6 孔板中接種A549 細胞(密度為1×105個/ml),融合至70%時,利用Lipofectamine 2000 試劑,將miR-219-5p、anti-miR-219-5p 及相應(yīng)陰性對照轉(zhuǎn)染入A549 細胞。轉(zhuǎn)染anti-miR-219-5p、anti-miR-con 的細胞以25 μmol/L 嗎啡培養(yǎng)48 h。參考上述方法檢測轉(zhuǎn)染后的A549 細胞增殖、遷移和侵襲及相關(guān)蛋白表達。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS22.0 統(tǒng)計軟件進行t檢驗、單因素方差分析及組間多重SNK-q檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度嗎啡對肺癌細胞A549 增殖的影響與NC 組細胞存活率[(100.00±11.35)%]比較,5、10、25 μmol/L 嗎啡細胞存活率〔(92.41 ±9.24)%、(78.46±8.05)%、(51.36±5.14)%〕顯著減少(F=54.039,P=0.000)。

2.2 不同濃度嗎啡對肺癌細胞A549 遷移、侵襲及miR-219-5p 表示的影響 同NC 組相比,10、25 μmol/L嗎啡顯著減少遷移細胞數(shù)和侵襲細胞數(shù),顯著增加MiR-219-5p 表達量(P＜0.05)。10、25 μmol/L嗎啡組MMP-2、MMP-9 蛋白表達量較NC組明顯降低(P＜0.05)。與10 μmol/L 嗎啡組比較,25 μmol/L 嗎啡組以上各指標(biāo)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見表1、圖1。

圖1 不同濃度MORP 抑制肺癌細胞A549 遷移和侵襲(結(jié)晶紫染色,×200)及MMP-2、-9 表達

表1 不同濃度嗎啡抑制肺癌細胞A549 遷移和侵襲(±s,n=9)

表1 不同濃度嗎啡抑制肺癌細胞A549 遷移和侵襲(±s,n=9)

與NC 組比較:1)P＜0.05;與10 μmol/L 嗎啡組比較:2)P＜0.05

組別遷移細胞數(shù)(個)侵襲細胞數(shù)(個)miR-219-5pMMP-2MMP-9 NC 組468.04±46.81218.39±21.851.00±0.100.86±0.090.72±0.08 10 μmol/L 嗎啡組379.34±37.951)157.34±15.751)1.53±0.151)0.85±0.081)0.70±0.071)25 μmol/L 嗎啡組246.79±24.661)2)96.07±9.611)2)2.53±0.221)2)0.35±0.041)2)0.28±0.031)2)F/P 值78.960/0.000123.490/0.000131.373/0.0001 42.603/0.000136.623/0.000

2.3 高表達miR-219-5p 對肺癌細胞A549 增殖、遷移和侵襲的影響 在A549 細胞中轉(zhuǎn)染miR-219-5p,發(fā)現(xiàn)miR-219-5p 表達量明顯高于miR-con 組(P＜0.05),說明成功構(gòu)建高表達miR-219-5p 的A549 細胞。與miR-con 比較,高表達miR-219-5p 明顯減少A549 細胞中CyclinD1、MMP-2、MMP-9 表達量(P＜0.05),且大幅降低細胞存活率、遷移細胞數(shù)和侵襲細胞數(shù)(P＜0.05)。見表2、圖2。

表2 高表達miR-219-5p 對肺癌細胞A549 增殖、遷移和侵襲的影響(±s,n=9)

表2 高表達miR-219-5p 對肺癌細胞A549 增殖、遷移和侵襲的影響(±s,n=9)

與miR-con 組比較:1)P＜0.05

組別miR-219-5pCyclinD1MMP-2MMP-9細胞存活率(%) 遷移細胞數(shù)(個) 侵襲細胞數(shù)(個).34±10.14470.01±47.04217.46±21.75 miR-con 組1.02±0.101.00±0.110.86±0.080.73±0.07100.48±10.05471.04±47.05216.83±21.69 miR-219-5p 組 2.05±0.211)0.45±0.051)0.38±0.041)0.30±0.031)58.13±5.821)269.86±26.991)106.76±10.681)F 值142.147/0.000 121.646/0.000 134.385/0.000 143.041/0.00069.317/0.00070.303/0.00010 NC 組1.00±0.121.05±0.100.88±0.090.75±0.08101 3.695/0.000

圖2 Western 印跡檢測高表達miR-219-5p 時CyclinD1、MMP-2、MMP-9 蛋白的表達

2.4 低表達miR-219-5p 可以部分逆轉(zhuǎn)嗎啡對肺癌細胞A549 增殖、遷移和侵襲的影響 與NC 組比較,嗎啡明顯影響A549 細胞中miR-219-5p、CyclinD1、MMP-2、MMP-9 表達、細胞存活率、遷移細胞數(shù)和侵襲細胞數(shù)(P＜0.05)。與嗎啡+anti-miR-con比較,嗎啡+anti-miR-219-5p 組顯著降低A549 細胞中miR-219-5p 表達量(P＜0.05),明顯提高CyclinD1、MMP-2、MMP-9 蛋白水平(P＜0.05),并顯著增加細胞存活率、遷移細胞數(shù)和侵襲細胞數(shù)(P＜0.05)。見表3、圖3。

圖3 Western 印跡檢測低表達miR-219-5p 時CyclinD1、MMP-2、MMP-9 蛋白的表達

表3 低表達miR-219-5p 可以部分逆轉(zhuǎn)嗎啡對肺癌細胞A549 增殖、遷移和侵襲的影響(±s,n=9)

表3 低表達miR-219-5p 可以部分逆轉(zhuǎn)嗎啡對肺癌細胞A549 增殖、遷移和侵襲的影響(±s,n=9)

與NC 組比較:1)P＜0.05;與嗎啡+anti-miR-con 組比較:2)P＜0.05;表4 同

組別miR-219-5pCyclinD1MMP-2MMP-9細胞存活率(%) 遷移細胞數(shù)(個) 侵襲細胞數(shù)(個).26±10.02465.89±46.55215.76±21.55嗎啡組2.21±0.221) 0.40±0.041) 0.35±0.041) 0.28±0.031)53.76±5.381)248.36±24.851)98.34±9.841)嗎啡+anti-miR-con 組2.25±0.240.45±0.050.36±0.040.30±0.0552.86±5.29246.37±24.6498.28±9.86嗎啡+anti-miR-219-5p 組 1.24±0.132) 0.86±0.092) 0.72±0.072) 0.64±0.062)88.89±8.892)418.43±41.852) 195.37±19.552)F 值113.923131.395147.463139.25489.75391.169135.048 P 值NC 組1.00±0.101.00±0.110.86±0.090.72±0.08100 0.0000.0000.0000.0000.0000.0000.000

2.5 低表達miR-219-5p 逆轉(zhuǎn)嗎啡對NF-κB 信號通路相關(guān)蛋白表達的影響 嗎啡組細胞中NF-κB、p65表達量明顯低于NC 組(P＜0.05),嗎啡+anti-miR-219-5p 組細胞中NF-κB、p65 蛋白水平顯著高于嗎啡+anti-miR-con 組(P＜0.05)。見圖4、表4。

圖4 Western 印跡檢測NF-κB、p65 蛋白表達

表4 Western 印跡檢測NF-κB、p65 蛋白表達(±s,n=9)

表4 Western 印跡檢測NF-κB、p65 蛋白表達(±s,n=9)

組別NF-κB p65 NC 組0.95±0.090.65±0.06嗎啡組0.42±0.041)0.25±0.031)嗎啡+anti-miR-con 組0.40±0.050.24±0.04嗎啡+anti-miR-219-5p 組0.82±0.082)0.55±0.062)F/P 值151.145/0.000162.155/0.000

3 討 論

嗎啡通常用于癌癥晚期和腫瘤圍術(shù)期,其對癌癥的額外鎮(zhèn)痛作用已被廣泛描述。嗎啡已被證明對腫瘤進展、細胞增殖、腫瘤侵襲、血管生成、免疫功能和轉(zhuǎn)移潛能產(chǎn)生影響,但結(jié)果卻存在矛盾,因而需要進一步的研究才能得出腫瘤患者最安全的方法和藥物〔13〕。在肺癌方面,田蜜等〔14〕研究表明,A549 細胞使用10、20、40 μg/ml 嗎啡處理后,細胞增殖受到抑制,細胞凋亡被明顯促進,均表現(xiàn)出劑量依賴性;另外,嗎啡以劑量依賴方式促進A549 細胞的遷移。也有研究得到不同的結(jié)果,童建華等〔15〕對0.3、3.0、30.0 μg/ml 濃度嗎啡影響A549 細胞增殖與凋亡進行分析,發(fā)現(xiàn)嗎啡明顯促進細胞增殖,且呈劑量依賴性;30 μg/ml 濃度嗎啡處理A549 細胞后,凋亡率由(6.4±0.6)%降至(3.8±0.5)%。李彬等〔16〕報道指出,0.1、1.0、10.0 μmol/L 嗎啡以劑量依賴方式提高A549 細胞的侵襲和遷移能力,10 μmol/L 嗎啡顯著增加MMP-2、MMP-9、Fascin 蛋白表達量。本研究結(jié)果與Tian 等〔17〕的報道一致。此外,本文10、25 μmol/L嗎啡明顯降低遷移細胞數(shù)、侵襲細胞數(shù)、MMP-2、MMP-9 蛋白水平,與文懷昌等〔18〕研究相符。李彬〔19〕研究表明,0.1、1.0 μmol/L 濃度的嗎啡增加A549 細胞侵襲數(shù)目和遷移速率,而當(dāng)嗎啡濃度達到10.0 μmol/L 時,細胞侵襲能力和遷移能力會減弱。由此可見,藥物濃度可能是影響嗎啡作用的重要因素之一。本研究提示,嗎啡在肺癌中的作用與miR-219-5p 密切相關(guān)。腫瘤的發(fā)展是一個復(fù)雜的進化過程,受致癌和抗腫瘤因子的調(diào)控〔20〕。研究發(fā)現(xiàn),miRNA 通過調(diào)控靶基因的表達,在腫瘤發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用。miR-219-5p 在胃癌組織和細胞系中明顯低于癌旁組織和正常胃上皮細胞;miR-219-5p 過表達顯著降低胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲;miR-219-5p 沉默則表現(xiàn)出完全相反的效果〔21〕。卵巢癌細胞中miR-219-5p 過表達可通過靶向高遷移率蛋白A2 抑制人卵巢癌細胞SKOV3 細胞增殖、遷移和侵襲〔22〕。結(jié)直腸癌組織中miR-219-5p 表達下調(diào);miR-219-5p 過表達可抑制細胞增殖,抑制磷脂酰肌醇3-激酶/Akt 信號通路的激活,下調(diào)CyclinD1、周期蛋白依賴性激酶4、6 的表達〔23〕。由此可見,miR-219-5p 作為抑癌因子影響胃癌、結(jié)直腸癌、卵巢癌等腫瘤進展。本實驗與前述研究相符。

嗎啡抑制NF-κB 信號通路相關(guān)蛋白NF-κB、p65 表達。NF-κB 信號通路在肺癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用〔24〕,miRNA-506 通過抑制NF-κB p65 表達抑制肺癌細胞活力〔25〕。本文結(jié)果提示,嗎啡發(fā)揮抗肺癌的功能是通過上調(diào)肺癌細胞中miR-219-5p,抑制NF-κB 信號通路來實現(xiàn)的。

綜上,嗎啡能夠抑制肺癌細胞A549 的增殖、遷移和侵襲能力,機制與調(diào)控miR-219-5p/NF-κB 信號通路有關(guān),其機制仍需深入探究。