王麗梅

結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis, MTB)感染導(dǎo)致的結(jié)核病(tuberculosis, TB)仍是威脅全球人類健康的傳染病第一殺手。2020年WHO報(bào)道，全球新發(fā)TB患者約1 000萬，死亡患者約140萬。我國是TB高負(fù)擔(dān)國家，TB患者數(shù)位居世界第3[1]?？ń槊?bacillus Calmette-Guérin，BCG)是目前用于預(yù)防TB的唯一疫苗，但只能保護(hù)兒童的粟粒性結(jié)核和結(jié)核性腦膜炎，對成人TB沒有保護(hù)效果[2]。因此，研制更為有效的新型TB疫苗成為防控TB迫切需要解決的問題。

MTB是一種主要經(jīng)呼吸道傳播的病原體。近年來研究表明，呼吸道黏膜免疫是機(jī)體抵抗MTB感染的第一道防線[3]。傳統(tǒng)BCG主要經(jīng)皮內(nèi)或皮下免疫接種，以誘發(fā)全身系統(tǒng)性的免疫應(yīng)答為主，而對黏膜免疫系統(tǒng)尤其是呼吸道黏膜免疫系統(tǒng)的刺激作用較小[3]。因此，通過黏膜免疫誘導(dǎo)黏膜免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗MTB感染的特異性免疫，成為了當(dāng)前TB疫苗研究的新方向。由于黏膜免疫系統(tǒng)具有屏障結(jié)構(gòu)、多種酶物質(zhì)和免疫耐受，所以如何有效地將抗原遞送至黏膜免疫系統(tǒng)，并刺激產(chǎn)生高效特異的黏膜免疫反應(yīng)成為了黏膜疫苗研究的技術(shù)關(guān)鍵。本文根據(jù)近年來TB黏膜疫苗的研究報(bào)道，總結(jié)了不同類型抗原遞送載體的TB黏膜疫苗的特點(diǎn)、免疫學(xué)特性和保護(hù)效果，并分析了未來TB黏膜疫苗的發(fā)展趨勢，希望對研究更高效的新型TB黏膜疫苗有所啟示。

1 重組病毒載體疫苗

1.1 痘病毒載體疫苗 痘病毒載體的主要特點(diǎn)是可以容納較大的外源基因片段，但其表達(dá)外源抗原的水平較低。此類疫苗主要用于初免后的加強(qiáng)免疫[4]。White等[5]利用人工致弱毒株改良安卡拉痘苗病毒(modified vaccinia virus ankara，MVA)構(gòu)建了表達(dá)MTB Ag85A抗原的重組痘病毒MVA85A，并在恒河猴模型中比較了MVA85A經(jīng)皮內(nèi)注射和氣溶膠霧化后經(jīng)鼻黏膜免疫加強(qiáng)BCG初免的效果。研究結(jié)果表明，MVA85A經(jīng)鼻黏膜免疫能顯著提高BCG皮內(nèi)初免恒河猴的肺泡灌洗液中CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的數(shù)量，提供更好的抗MTB感染的免疫保護(hù)效果，且安全性也好。該研究也發(fā)現(xiàn)，MVA85A經(jīng)鼻黏膜免疫在恒河猴體內(nèi)不會誘生MVA載體的特異性抗體，這一點(diǎn)對于以MVA為載體的疫苗開發(fā)具有重要意義。目前經(jīng)黏膜免疫的MVA85A被作為ChAdOx185A初免的加強(qiáng)型疫苗，正在進(jìn)行Ⅰ期臨床試驗(yàn)研究[1]。

1.2 腺病毒載體疫苗 復(fù)制缺陷的腺病毒載體疫苗是目前研究最為廣泛和深入的一類病毒載體疫苗。腺病毒載體具有很強(qiáng)的免疫原性，既可以激活固有免疫，也可以激活適應(yīng)性免疫，能誘導(dǎo)機(jī)體對其遞送的抗原產(chǎn)生特異性的細(xì)胞免疫。重組腺病毒載體疫苗不僅適用于對新生兒進(jìn)行初免，也適用于在BCG免疫過的人群中進(jìn)行加強(qiáng)免疫，且在HIV感染等免疫缺陷者體內(nèi)也是一種相對安全的疫苗形式[6]。加拿大Xing Z研究組較早開展了基于腺病毒載體的TB黏膜疫苗研究，他們構(gòu)建了表達(dá)MTB Ag85A抗原的人腺病毒5型復(fù)制缺陷的重組載體AdAg85A，并在多種動物模型中評價了AdAg85A的免疫學(xué)特性和免疫保護(hù)效果[7-11]。研究發(fā)現(xiàn)，AdAg85A經(jīng)肌肉注射免疫小鼠后，在小鼠脾肺組織中能夠誘生抗原特異性的T細(xì)胞免疫應(yīng)答，但不能在小鼠的呼吸道中誘生抗原特異性T細(xì)胞，不能保護(hù)小鼠抵抗經(jīng)呼吸道感染的MTB[6]。然而，將AdAg85A經(jīng)黏膜滴鼻免疫小鼠[7]、豚鼠[8]、牛[9]、羊[10]和恒河猴[11]等多種動物模型后，雖然與經(jīng)肌肉注射相比，誘生全身系統(tǒng)性免疫的抗原特異性T細(xì)胞強(qiáng)度較低，但卻能在這些動物的氣道腔、肺組織中顯著誘生抗原特異性的CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞。AdAg85A經(jīng)黏膜免疫主要以誘生CD8+T細(xì)胞為主，且這些CD8+T細(xì)胞是一類持久的效應(yīng)記憶性T細(xì)胞，能夠明顯降低脾、肺組織的MTB荷菌數(shù)，保護(hù)小鼠抵抗經(jīng)呼吸道感染的MTB，加強(qiáng)BCG皮下初免的效果。另外，在恒河猴模型中的研究還發(fā)現(xiàn)，AdAg85A黏膜免疫加強(qiáng)BCG皮內(nèi)初免，可顯著緩解恒河猴MTB感染的臨床癥狀和肺組織損傷，改善存活狀況[11]。目前經(jīng)黏膜免疫的AdAg85A正在進(jìn)行Ⅰ期臨床試驗(yàn)研究[1]。

為進(jìn)一步提高疫苗的免疫原性，Xing Z課題組還構(gòu)建了表達(dá)MTB 10.4和Ag85A兩種抗原的復(fù)制缺陷的人腺病毒5型重組載體疫苗，即Ad-10.4-Ag85A[12]。研究發(fā)現(xiàn)，Ad-10.4-Ag85A一次鼻內(nèi)黏膜免疫就能在小鼠氣道腔和肺組織中誘生MTB 10.4和Ag85A 2種抗原特異性的細(xì)胞免疫應(yīng)答，誘生的保護(hù)性免疫應(yīng)答優(yōu)于表達(dá)單一抗原的AdAg85A，具有潛在優(yōu)勢[12]。

由于人體中普遍存在腺病毒5型載體抗體，一定程度上限制了基于該載體的疫苗應(yīng)用。因此，為了研究更適合人類應(yīng)用的腺病毒載體疫苗，Xing Z課題組又以黑猩猩腺病毒68型(AdCh68)為載體，構(gòu)建了表達(dá)Ag85A的重組腺病毒AdCh68Ag85A，對比了AdCh68Ag85A與AdAg85A的免疫保護(hù)效果。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AdCh68Ag85A滴鼻黏膜免疫小鼠不僅具有良好的安全性，而且在誘生T細(xì)胞免疫應(yīng)答方面也優(yōu)于AdAg85A。當(dāng)小鼠肺組織預(yù)先存在AdHu5載體抗體時，AdCh68Ag85A比AdAg85A能更好地降低小鼠肺組織的MTB荷菌數(shù)，保護(hù)小鼠抵抗MTB感染[13]。

1.3 其他類型的病毒載體疫苗 目前還有一些其他類型的病毒載體也被用于TB黏膜疫苗的研究。Roediger等[14]構(gòu)建了表達(dá)Ag85A的重組水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus，VSV)載體疫苗VSVAg85A。研究發(fā)現(xiàn)，VSVAg85A經(jīng)滴鼻初免小鼠，雖然誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的抗MTB感染的保護(hù)性免疫不持久，但當(dāng)VSVAg85A用于加強(qiáng)AdAg85A初免時，卻可顯著增加小鼠氣道腔和全身系統(tǒng)性的Ag85A抗原特異性的CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的數(shù)量，明顯減少小鼠脾肺組織的MTB荷菌數(shù)，保護(hù)效果優(yōu)于VSVAg85A、AdAg85A和BCG等疫苗的單獨(dú)免疫效果。

仙臺病毒(Sendai virus, SeV)不感染人類，人體內(nèi)預(yù)先存在的SeV病毒抗體滴度也較低[15]。Hu等[16]以SeV為載體，構(gòu)建了表達(dá)Ag85A和Ag85B抗原的重組病毒載體疫苗SeV85AB，并將其滴鼻黏膜免疫小鼠。研究發(fā)現(xiàn)，SeV85AB一次免疫接種就可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生同BCG免疫相當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)效果。當(dāng)SeV85AB黏膜免疫用于加強(qiáng)BCG皮下初免時，SeV85AB能顯著降低小鼠脾肺組織的MTB荷菌數(shù)，減輕臟器病理損傷，增強(qiáng)BCG皮下初免的保護(hù)效果。該研究表明，SeV85AB的免疫保護(hù)效果可能與其在小鼠肺組織中誘生的組織記憶性CD8+T細(xì)胞相關(guān)。

人副流感病毒2型(human parainfluenza type 2 virus，hPIV2)病毒載體刺激機(jī)體產(chǎn)生的重組抗原特異性的免疫反應(yīng)要強(qiáng)于自身病毒載體的[17]。因此，Watanabe 等[18]利用非復(fù)制的hPIV2為載體，構(gòu)建了表達(dá)Ag85B的重組載體疫苗rhPIV2-Ag85B。研究發(fā)現(xiàn)，rhPIV2-Ag85B滴鼻免疫小鼠，能夠在小鼠脾、肺泡灌洗液和肺部淋巴結(jié)中顯著誘生抗原特異性的CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞，減少脾肺組織的MTB荷菌數(shù)，減輕肺組織肉芽腫病變和炎癥反應(yīng)，具有作為新型TB疫苗的研究前景。

流感病毒(influenza virus，F(xiàn)LU)載體能夠刺激機(jī)體黏膜免疫系統(tǒng)和全身系統(tǒng)性免疫產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，目前也被廣泛用于各類疫苗的研究[19]。哈薩克斯坦和俄羅斯聯(lián)合構(gòu)建了以復(fù)制缺陷的甲型流感病毒為載體、表達(dá)MTB Ag85A和ESAT-6抗原的重組疫苗TB/FLU-04L。研究發(fā)現(xiàn)，該疫苗滴鼻加強(qiáng)BCG初免，一次接種就可以顯著增強(qiáng)BCG初免的保護(hù)效果。目前TB/FLU-04L正在進(jìn)行Ⅱa 期臨床試驗(yàn)研究[20]。

2 亞單位疫苗

當(dāng)前亞單位疫苗用于TB黏膜疫苗的研究還比較少。在亞單位疫苗研究中，佐劑的選擇以及佐劑和抗原的配伍非常重要，其影響著疫苗誘生的免疫應(yīng)答的類型和強(qiáng)度。Blazevic等[21]用佐劑CpG輔佐MTB Ag85B抗原滴鼻黏膜免疫小鼠，觀察其初免和加強(qiáng)BCG初免的效果。研究發(fā)現(xiàn)，Ag85B/CpG經(jīng)滴鼻免疫比肌肉注射能更多地進(jìn)入到小鼠肺組織和黏膜皮下組織，但誘生的免疫反應(yīng)強(qiáng)度還不夠保護(hù)小鼠抵抗MTB感染。當(dāng)用Ag85B/CpG滴鼻加強(qiáng)BCG經(jīng)滴鼻初免的免疫效果時，雖然免疫小鼠肺組織中的抗原特異性CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的數(shù)量有所增加，但小鼠肺泡灌洗液中的CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的數(shù)量沒有改變，不能增強(qiáng)BCG經(jīng)滴鼻初免的免疫效果。

α-GalCer是一種合成的糖脂，是恒定型自然殺傷性T細(xì)胞(iNKT)的激活劑。iNKT細(xì)胞能夠激活DCs，從而促進(jìn)抗原的高效遞呈，增強(qiáng)適應(yīng)性免疫應(yīng)答[22]。Khan等[23]利用α-GalCer作為佐劑配伍MTB Ag85B和ESAT-6抗原，并以舌下含服的方式免疫小鼠，觀察其免疫保護(hù)效果。研究表明，α-GalCer/Ag85B/ ESAT-6經(jīng)舌下含服方式免疫小鼠后，能夠在小鼠的脾、頸部淋巴結(jié)和肺組織中誘生強(qiáng)烈持久的多功能性CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞，分泌IFN-γ和IL-2等多種細(xì)胞因子，降低MTB感染小鼠的脾肺組織MTB荷菌數(shù)，保護(hù)效果優(yōu)于BCG皮下免疫的效果。

3 納米顆粒疫苗

納米顆粒疫苗是近年來備受青睞的一種疫苗形式，其不僅能較好地刺激黏膜免疫系統(tǒng)，還能刺激全身系統(tǒng)性免疫系統(tǒng)，顯示出良好的疫苗應(yīng)用前景。Ballester等[24]利用聚丙烯硫化物制成納米顆粒，然后將MTB Ag85B抗原偶聯(lián)在納米顆粒表面，形成納米顆粒疫苗NP-Ag85B。研究發(fā)現(xiàn)，將NP-Ag85B與CpG佐劑一起肺內(nèi)注射免疫小鼠，與非納米顆粒遞送的Ag85B/CpG相比，NP-Ag85B/CpG能誘生小鼠肺和肺組織引流淋巴結(jié)中產(chǎn)生更多的抗原特異性多功能Th1型細(xì)胞，并能在小鼠脾肺組織中誘生Th17細(xì)胞免疫反應(yīng)，顯著降低MTB感染小鼠的脾肺組織MTB荷菌數(shù)。

Hart等[25]利用黃色巴西棕櫚蠟制成納米顆粒，并將MTB Acr、Ag85B和HBHA 3種抗原構(gòu)成的融合蛋白吸附在納米顆粒表面，形成納米顆粒疫苗Nano-FP1。研究發(fā)現(xiàn)，Nano-FP1通過滴鼻免疫加強(qiáng)BCG初免，能顯著提高BCG初免小鼠抗MTB感染的保護(hù)效果，減少感染小鼠脾、肺組織的MTB荷菌數(shù)。

殼聚糖是近年來被認(rèn)為非常有應(yīng)用前景的一類納米材質(zhì)，其生物相容性好，安全無毒，還具有佐劑特性[26]。Ahmed等[27]將殼聚糖納米顆粒與不同的Th1型細(xì)胞免疫佐劑如單磷酰脂質(zhì)A(MPLA)、多聚凝膠可德蘭多糖、聚肌胞苷酸(poly I:C)、瑞喹莫德(R848)、寡聚脫氧核苷酸鏈(CpG)和肽聚糖(PGN)等進(jìn)行配伍，然后滴鼻免疫小鼠。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)殼聚糖納米顆粒與MPL配伍后，能夠激活DCs中的TLR與炎癥小體信號通路，介導(dǎo)Th17和Th1型的黏膜免疫反應(yīng)，保護(hù)小鼠抵抗MTB感染。

Ag85B-ESAT-6-Rv2660融合蛋白(H56)與佐劑IC31組成的亞單位疫苗目前正在進(jìn)行經(jīng)肌內(nèi)注射免疫接種的Ⅱa期臨床試驗(yàn)研究[28]。Thakur等[29]為了評價H56用作TB黏膜疫苗的免疫效果，將H56與陽離子脂質(zhì)體佐劑CAF01制成了納米顆粒疫苗。研究發(fā)現(xiàn)，H56/CAF01經(jīng)肺內(nèi)注射免疫小鼠，能夠均勻地分布在小鼠的肺組織中，并具有較好的安全性。此外，H56/CAF01通過肌肉初免-肺內(nèi)加強(qiáng)免疫，不僅能誘導(dǎo)小鼠肺組織黏膜和全身系統(tǒng)性的IgA的產(chǎn)生，還能誘導(dǎo)產(chǎn)生多功能的Th1型和Th17型細(xì)胞免疫反應(yīng)，具有良好的研究前景。

另外，Andersen等[30]利用CTA1-DD/ISCOMs復(fù)合脂質(zhì)體佐劑與Ag85B-ESAT-6融合蛋白制備成納米顆粒疫苗，并將其滴鼻免疫加強(qiáng)BCG皮下初免。研究發(fā)現(xiàn)，該免疫方案可在小鼠肺組織中誘導(dǎo)Th1型細(xì)胞免疫應(yīng)答，促進(jìn)抗原特異性T細(xì)胞高效遷移至MTB感染部位，減少感染小鼠肺組織的MTB荷菌數(shù)，增強(qiáng)BCG皮下初免的保護(hù)效果。

4 其他遞送載體的TB黏膜疫苗

目前還有一些其他類型載體的TB黏膜疫苗研究，這些疫苗也都展示出各自的優(yōu)點(diǎn)。如Copland等[31]在枯草芽孢桿菌的芽孢表面包被了MTB Ag85B、Acr和HBHA抗原的融合蛋白FP1，制備成Spore-FP1疫苗。研究發(fā)現(xiàn)，將Spore-FP1滴鼻免疫加強(qiáng)BCG皮下初免，能夠誘生小鼠產(chǎn)生多種特異性的黏膜免疫反應(yīng)和全身系統(tǒng)性的免疫反應(yīng)，降低MTB感染小鼠肺組織的MTB荷菌數(shù)。另外，Mustafa等[32]利用乳酸桿菌構(gòu)建了表達(dá)MTB Ag85B、CFP-10、ESAT-6、Rv0475和Rv2031c等5種抗原的融合蛋白ACERL，又將ACERL與細(xì)胞因子IL-12在乳酸桿菌中重組表達(dá)，形成LpACERL/IL-12疫苗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LpACERL/IL-12經(jīng)口服黏膜免疫小鼠后，能夠顯著誘生小鼠脾、肺和腸道的Th1型細(xì)胞免疫反應(yīng)，顯示出較好的研究應(yīng)用前景。

5 展 望

不同于全身系統(tǒng)性免疫，黏膜免疫系統(tǒng)具有特殊的結(jié)構(gòu)和功能，因此怎樣能高效激活黏膜免疫系統(tǒng)是黏膜疫苗研究的關(guān)鍵。靶抗原、佐劑和遞送系統(tǒng)是黏膜疫苗設(shè)計(jì)的3個重要因素[33]。靶抗原的選擇決定了疫苗的特異性，目前TB黏膜疫苗選擇的靶抗原大多是通過全身系統(tǒng)性免疫系統(tǒng)而篩選的，但這些抗原是否仍是黏膜免疫系統(tǒng)的優(yōu)勢保護(hù)性抗原目前還不清楚，所以尋找更佳的適于黏膜免疫的MTB保護(hù)性抗原有助于TB黏膜疫苗的深入研究[33]。佐劑是黏膜疫苗的重要組成部分，其不僅能增強(qiáng)疫苗的免疫原性，而且還影響著疫苗誘生免疫應(yīng)答的類型[34]。因此準(zhǔn)確選擇佐劑，并誘導(dǎo)特定類型的免疫應(yīng)答，有助于提高TB黏膜疫苗的免疫保護(hù)效果。遞送系統(tǒng)是將疫苗靶抗原和佐劑遞送到黏膜免疫系統(tǒng)，并誘導(dǎo)黏膜免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗原特異性黏膜免疫反應(yīng)的關(guān)鍵因素[35]。雖然當(dāng)前在研的TB黏膜疫苗能夠誘導(dǎo)黏膜免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗原特異性的免疫反應(yīng)，但這些疫苗均缺乏黏膜靶向性，如果能提高TB黏膜疫苗對黏膜免疫系統(tǒng)的靶向性，尤其是對呼吸道黏膜免疫系統(tǒng)的靶向性，則對提高黏膜疫苗的免疫效果具有重大的意義。此外，黏膜疫苗免疫接種的部位、途徑和免疫順序(如初免和加強(qiáng)性免疫)等也都影響著疫苗誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)的強(qiáng)度和疫苗的免疫保護(hù)效果[36]。所以，未來如果能在MTB靶抗原的選擇、使用的免疫佐劑、免疫遞送載體及其靶向性、免疫順序等方面進(jìn)一步地優(yōu)化，調(diào)節(jié)或改變機(jī)體的全身系統(tǒng)性免疫與黏膜免疫的免疫應(yīng)答的類型和強(qiáng)度，將有助于更高效地TB黏膜疫苗的成功研制。

利益沖突：無

引用本文格式：王麗梅. 結(jié)核病黏膜疫苗的研究進(jìn)展[J]. 中國人獸共患病學(xué)報(bào)，2022，38(2)：170-174，181. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.020