王曉英，羅 明，張匯征, 易利華

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌(MycobacteriumTuberculosis, MTB)感染引起的慢性傳染病，是由單一致病菌引起的死亡人數(shù)最多的疾病[1]。據(jù)世界衛(wèi)生組織(World Health Organization, WHO)估算，2019年耐多藥結(jié)核病(Multi-drug Resistant Tuberculosis, MDR-TB)及利福平耐藥結(jié)核病(Rifampicin Resistant Tuberculosis, RR-TB)患者數(shù)為46.5萬。2019年，我國約有6.5萬MDR/RR-TB患者，占全球MDR/RR-TB病例的14%，僅次于印度(27%)。然而，RR-/MDR-TB的治療非常困難，成功率僅為57%[2]。2019年，WHO在耐藥結(jié)核病治療整合指南中，將貝達(dá)喹啉和氯法齊明分別列為MDR-TB治療的A組及B組藥物[3]。2020年，WHO進(jìn)一步修改了廣泛耐藥結(jié)核病(Extensively drug-resistant tuberculosis, XDR-TB)的定義，即符合MDR/RR-TB的定義，同時對氟喹諾酮類以及至少一種其他的A組藥物耐藥[4]。雖然貝達(dá)喹啉和氯法齊明在我國尚未作為抗結(jié)核藥物進(jìn)行大規(guī)模的使用，但已存在對貝達(dá)喹啉和氯法齊明耐藥的MTB菌株。本文將系統(tǒng)闡述貝達(dá)喹啉和氯法齊明的作用機(jī)理以及耐藥相關(guān)基因突變等情況，為2種藥物耐藥快速檢測工具的開發(fā)提供依據(jù)。

1 貝達(dá)喹啉和氯法齊明的作用機(jī)理

1.1 貝達(dá)喹啉的作用機(jī)理 相比于其他抗結(jié)核藥物，貝達(dá)喹啉的作用機(jī)制獨特、抗MTB活性強(qiáng)、療效好，是近50年來第一個上市的抗結(jié)核新藥[5-6]。貝達(dá)喹啉是一種二芳基喹啉類化合物，通過與MTB的ATP合成酶低聚物亞基C相結(jié)合，影響ATP合成酶質(zhì)子泵的活性，導(dǎo)致ATP合成受阻。最終通過阻止MTB中的ATP能量供應(yīng)而發(fā)揮抑菌和殺菌的作用[7-8]。

1.2 氯法齊明的作用機(jī)理 目前，氯法齊明抗MTB的作用機(jī)制研究還不是很清楚，多數(shù)研究認(rèn)為其作用機(jī)理主要有以下3個方面：1)MTB呼吸過程中需要煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)產(chǎn)生的電子。氯法齊明通過與重組Ⅱ型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氫酶底物甲基萘醌競爭NADH貢獻(xiàn)的電子而變?yōu)檫€原型氯法齊明，隨后被氧化形成超氧化物，最終通過釋放活性氧而實現(xiàn)治療結(jié)核病的作用[9-12]；2)氯法齊明可能通過溶血磷脂介導(dǎo)的膜功能障礙而抑制K+的吸收，從而通過干擾MTB膜電位而導(dǎo)致ATP含量的下降，發(fā)揮抗MTB功效[9,11,13]；3)氯法齊明可通過改變MTB衍生因子的抑制作用而增強(qiáng)吞噬細(xì)胞的內(nèi)殺傷能力，即增強(qiáng)吞噬細(xì)胞對MTB的吞噬能力，而且氯法齊明的半衰期較長、藥代動力學(xué)較好[14-15]。

2 貝達(dá)喹啉和氯法齊明交叉耐藥的相關(guān)機(jī)制

貝達(dá)喹啉和氯法齊明交叉耐藥情況的出現(xiàn)主要和Rv0678(mmpR)基因和Rv2535c(pepQ)基因的突變有關(guān)。

2.1Rv0678基因(mmpR)Rv0678基因?qū)儆贛arR調(diào)控基因之一，其編碼產(chǎn)物為調(diào)控蛋白。Rv0678基因具有多種生物學(xué)效應(yīng)，如對抗菌藥物的耐藥性，毒力因子的調(diào)控以及對氧化應(yīng)激的敏感性等[16]。Rv0678基因編碼的調(diào)控蛋白被認(rèn)為是MmpS2/MmpL2，MmpS4/MmpL4和MmpS5/MmpL5轉(zhuǎn)運體系統(tǒng)的抑制因子[16]。MmpS/MmpL蛋白被認(rèn)為是MTB細(xì)胞壁脂類、毒性因子以及一些藥物的轉(zhuǎn)運體。MmpS5/MmpL5尤其參與了貝達(dá)喹啉、氯法齊明以及唑類藥物(如益康唑等)的外排[17]。Rv0678突變導(dǎo)致了MmpS5/MmpL5抑制因子的滅活，上調(diào)了外排泵系統(tǒng)MmpS5/MmpL5的表達(dá)，增加了貝達(dá)喹啉和氯法齊明的外排，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)藥物濃度下降，出現(xiàn)MTB對貝達(dá)喹啉和氯法齊明耐藥的現(xiàn)象[10,18]。

2.1.1Rv0678突變與貝達(dá)喹啉和氯法齊明交叉耐藥的相關(guān)性 Pang等[19]的研究顯示，在未使用過貝達(dá)喹啉和氯法齊明的Pre-XDR-TB和XDR-TB患者中，以最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)>1 μg/mL為氯法齊明耐藥的判斷標(biāo)準(zhǔn)，有5株XDR-TB對氯法齊明耐藥，其中4株發(fā)現(xiàn)了Rv0678突變(Ser53Pro(2株)，Ser53Leu(1株)，Tyr157Asp(1株))。同時，Rv0678突變(Ser53Pro(2株))也與貝達(dá)喹啉耐藥相關(guān)。此研究表明貝達(dá)喹啉和氯法齊明的交叉耐藥是由Rv0678基因第53位密碼子突變導(dǎo)致的(Ser53Pro)[19]。對于復(fù)治的Pre-XDR-TB和XDR-TB患者，以MIC≥1.2 μg/mL為氯法齊明耐藥的判斷標(biāo)準(zhǔn)，5株耐氯法齊明MTB菌株中有4株同時對貝達(dá)喹啉耐藥，而且均存在Rv0678突變,突變位點以及導(dǎo)致的氨基酸改變分別為：T437C(M146T)，G5T(S2I)，C158T (S53L)以及T350G (L117R)[20]。這種因Rv0678突變導(dǎo)致的貝達(dá)喹啉和氯法齊明原發(fā)性耐藥可能是使用了其他抗結(jié)核藥物進(jìn)行治療的結(jié)果。而且Villellas等的研究發(fā)現(xiàn)，相比于對抗結(jié)核藥物敏感的MTB患者，Rv0678的突變頻率在MDR-TB患者中更高[21]。He等對未使用貝達(dá)喹啉的TB患者菌株進(jìn)行研究，結(jié)果表明，在6株耐貝達(dá)喹啉的MTB菌株中有4株同時對氯法齊明耐藥。全基因組測試結(jié)果顯示，這4株交叉耐藥菌株均存在Rv0678突變(Ser63Arg，Ser68Gly以及在核苷酸192位置的G堿基插入突變)[22]。Zheng等的研究發(fā)現(xiàn)在339株MTB菌株中，有2株為貝達(dá)喹啉和氯法齊明交叉耐藥菌株，且該交叉耐藥是由Rv0678突變引起，由此導(dǎo)致的氨基酸改變?yōu)镚ln31Arg和Ser53Pr[23]。

另外，研究表明MTB對貝達(dá)喹啉和氯法齊明存在獲得性耐藥的情況。2014年，Somoskovi等報道了1例MDR-TB患者對貝達(dá)喹啉和氯法齊明產(chǎn)生了獲得性耐藥[24]。這例耐藥菌株(貝達(dá)喹啉：MIC=3.2 μg/mL；氯法齊明：MIC≥4 μg/mL)出現(xiàn)了Rv0678突變(GTG-GCG, 導(dǎo)致了M1A置換)[25]。隨后，Liu等研究也報道了MTB對貝達(dá)喹啉和氯法齊明產(chǎn)生獲得性耐藥的情況，在采用含貝達(dá)喹啉的治療方案后，1.8%(5/277)的MDR-TB患者出現(xiàn)了對2種藥物的交叉耐藥，且均為Rv0678突變[26]。在南非，貝達(dá)喹啉和氯法齊明已經(jīng)被普遍應(yīng)用在TB患者的治療中。Nimmo等研究發(fā)現(xiàn)，南非也存在對貝達(dá)喹啉和氯法齊明交叉耐藥的MTB菌株，而且主要是由Rv0678突變引起的，并導(dǎo)致了23個不同的氨基酸改變[27]。Rv0678突變將導(dǎo)致外排泵系統(tǒng)MmpS5/MmpL5表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞內(nèi)藥物濃度降低，導(dǎo)致貝達(dá)喹啉的MIC增加了2～8倍，同時也使氯法齊明的MIC增加了2～4倍[10,28]。

2.1.2Rv0678突變與氯法齊明耐藥的相關(guān)性Rv0678突變是導(dǎo)致MTB對氯法齊明耐藥的主要機(jī)制。2015年，Zhang等研究表明，97%(93/96)的耐氯法齊明MTB菌株存在Rv0678突變，其中2個突變熱點分別為G193(突變頻率為43.8%，42/96)和C466T(突變頻率為11.5%，11/96)[29]。Islam的研究也表明，在存在Rv0678突變的MTB菌株中，以G193和C466T突變最為常見[9]。Pang等研究表明，5.6%(5/90)的XDR-TB菌株對氯法齊明耐藥，且該耐藥均是由Rv0678突變導(dǎo)致的[19]。由此可見，Rv0678突變是導(dǎo)致MTB對氯法齊明耐藥的主要原因，同時也是導(dǎo)致MTB對貝達(dá)喹啉和氯法齊明交叉耐藥的重要機(jī)制。

2.2Rv2535c基因(pepQ)Rv2535c基因編碼的372位氨基酸蛋白有2個結(jié)構(gòu)域：即100-aa N-末端α/β結(jié)構(gòu)域和250-aa C-末端肽酶結(jié)構(gòu)域，其編碼產(chǎn)物可能為細(xì)胞質(zhì)肽酶，但目前其具體的作用機(jī)制還不是很清楚。Almeida等研究發(fā)現(xiàn)，Rv2535c突變導(dǎo)致貝達(dá)喹啉和氯法齊明的MIC增加了4倍，并伴隨著貝達(dá)喹啉和氯法齊明藥效的降低，但并沒有導(dǎo)致MTB對這2種藥物完全耐藥[30]。Rv2535c突變導(dǎo)致的貝達(dá)喹啉和氯法齊明交叉耐藥表現(xiàn)在：14位密碼子(Ala)中插入C 堿基導(dǎo)致的移碼突變以及催化結(jié)構(gòu)域271位密碼子(Arg)中C堿基刪除導(dǎo)致的移碼突變。同時該研究表明，因Rv2535c突變導(dǎo)致的貝達(dá)喹啉和氯法齊明低水平交叉耐藥并沒有涉及MmpS5/MmpL5表達(dá)的上調(diào)，可能與通過其他機(jī)制增加藥物的外排有關(guān)(如抑制MmpL5的降解等)[30]。而在Pang[19]以及Xu等[20]研究中，并未檢測到貝達(dá)喹啉和氯法齊明交叉耐藥菌株中存在Rv2535c突變。Zhang等的研究表明，在96株耐氯法齊明MTB菌株中，有1株(1%)存在Rv2535c突變，突變位點為G265T[29]。由此可見，因Rv2535c突變導(dǎo)致的氯法齊明耐藥較少見。因此，Rv2535c突變在耐氯法齊明MTB菌株中的作用以及突變頻率仍需進(jìn)一步的研究。

3 貝達(dá)喹啉耐藥的其它機(jī)制

除了因Rv0678和Rv2535c突變導(dǎo)致的貝達(dá)喹啉和氯法齊明低濃度交叉耐藥外，atpE突變(靶點突變)也是導(dǎo)致MTB對貝達(dá)喹啉耐藥的原因之一。atpE基因編碼ATP合成酶的跨膜蛋白，而此跨膜蛋白是貝達(dá)喹啉的作用靶點。atpE突變將導(dǎo)致貝達(dá)喹啉與亞基C的結(jié)合力減弱，從而維持了H+轉(zhuǎn)移和ATP的產(chǎn)生，導(dǎo)致MTB對貝達(dá)喹啉耐藥。2005年，Andries等第一次發(fā)現(xiàn)atpE突變(氨基酸改變?yōu)锳la63Pro)導(dǎo)致了MTB對貝達(dá)喹啉耐藥[31]。隨后，Petrella等在耐貝達(dá)喹啉MTB菌株中發(fā)現(xiàn)了atpE新的突變位點(I66M)[32]。atpE靶基因突變導(dǎo)致的貝達(dá)喹啉耐藥，可使貝達(dá)喹啉的MIC增加8～133倍[33-34]。2010年， Huitric等一項研究表明約有30%(15/53)的耐貝達(dá)喹啉MTB菌株存在atpE突變,5個點突變分別為A28V、A63P、I66M、A28P以及G61A[33]。而在Pang等[19]以及Xu等[20]研究中，未檢測到耐貝達(dá)喹啉MTB菌株中存在atpE突變，可能與測試菌株的數(shù)量和來源有關(guān)。因此，atpE突變在貝達(dá)喹啉耐藥中的作用仍需進(jìn)行更深入的研究。

4 氯法齊明耐藥的其它機(jī)制

2018年，Ismail等研究表明，耐貝達(dá)喹啉的MTB菌株很可能全部對氯法齊明耐藥，然而耐氯法齊明MTB菌株中僅1/3表現(xiàn)出對貝達(dá)喹啉的交叉耐藥[35]，此研究表明，MTB對氯法齊明的耐藥還存在著其他的耐藥機(jī)制，如Rv1979c突變。

Rv1979c基因可能編碼參與氨基酸轉(zhuǎn)運的通透酶。Rv1979c突變導(dǎo)致氯法齊明耐藥的機(jī)制目前還不是很清楚。2015年，Zhang等第一次在耐氯法齊明MTB菌株中發(fā)現(xiàn)了Rv1979c突變，并推測其可能與氨基酸轉(zhuǎn)運有關(guān)。Rv1979c基因有可能通過直接或間接的方式影響氯法齊明的轉(zhuǎn)運和吸收，從而改變MTB的生理功能，進(jìn)而導(dǎo)致MTB對氯法齊明的敏感性降低[29]。該研究發(fā)現(xiàn)，在耐氯法齊明的MTB菌株(96株)中，有3株存在Rv1979c突變：其中一株僅有Rv1979c突變(突變位點：T1052C；氨基酸改變：V351A)；其余2株同時存在Rv0678c和Rv1979c突變。與僅有Rv1979c突變的MTB菌株相比，同時存在Rv0678c和Rv1979c突變的MTB菌株氯法齊明的MIC升高(1 mg/L)，因此在存在其他基因突變的基礎(chǔ)上附加的Rv1979c突變可能導(dǎo)致高水平氯法齊明耐藥[29]。在Xu等研究中，以MIC≥1.2μg/mL為氯法齊明耐藥的判斷標(biāo)準(zhǔn)，在1株氯法齊明耐藥菌株(1/5,20%)中檢測到了Rv1979c突變，突變位點為A155C，導(dǎo)致的氨基酸改變?yōu)閂52G[20]。而在Ismail等研究中，并未檢測到耐氯法齊明MTB菌株中存在Rv1979c突變[36]。Phelan等研究還表明，Rv1979c基因突變與異煙肼耐藥相關(guān)[37]。因此，Rv1979c突變在耐氯法齊明MTB菌株中的作用還需進(jìn)行更深入的研究。

5 展 望

綜上所述，目前已知的導(dǎo)致貝達(dá)喹啉和氯法齊明交叉耐藥的基因突變均為非靶點基因突變，包括Rv0678(mmpR)基因和Rv2535c(pepQ)基因，其中Rv0678(mmpR)突變頻率較高，是導(dǎo)致MTB對貝達(dá)喹啉和氯法齊明交叉耐藥以及MTB對氯法齊明耐藥的重要原因。雖然貝達(dá)喹啉和氯法齊明存在低濃度交叉耐藥的情況，但已有研究表明，增加貝達(dá)喹啉用量同時聯(lián)合氯法齊明具有更好的抗結(jié)核效果[26]。目前貝達(dá)喹啉和氯法齊明耐藥性及其耐藥機(jī)制仍有許多未闡明之處，還需進(jìn)行更深入的研究，為今后兩種藥物的合理應(yīng)用提供參考。

利益沖突：無

引用本文格式：王曉英，羅明，張匯征，等. 結(jié)核分枝桿菌貝達(dá)喹啉和氯法齊明耐藥及其交叉耐藥機(jī)制研究進(jìn)展[J]. 中國人獸共患病學(xué)報，2022，38(2)：165-169. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2021.00.031