韓昌婧 徐 麗 段雪娟 艾 欣

糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)是糖尿病患者常見(jiàn)的微血管并發(fā)癥之一，它可能導(dǎo)致患者嚴(yán)重的視力障礙甚至失明[1]。近年來(lái)，隨著糖尿病的發(fā)病率逐漸增加，DR成了威脅中青年人群視力的常見(jiàn)因素[2]。DR的發(fā)病機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜，與視網(wǎng)膜炎癥、視網(wǎng)膜血管滲透性增加以及血-視網(wǎng)膜屏障破壞有關(guān)。這些過(guò)程會(huì)引起視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞無(wú)序地增殖和遷移以及毛細(xì)血管形成，最終導(dǎo)致視網(wǎng)膜新生血管形成[3-5]。KIF11是一種紡錘體驅(qū)動(dòng)蛋白，在紡錘體雙極性的形成和維持中發(fā)揮重要作用[6]。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，KIF11在多種腫瘤中過(guò)度表達(dá)，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[7-8]。下調(diào)KIF11可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移[9]。Shao等[10]分析GSE60436數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)，KIF11在增生型DR視網(wǎng)膜組織中表達(dá)上調(diào)，且可能與血管生成和視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖有關(guān)。但是KIF11在DR中的作用還未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究擬通過(guò)高糖誘導(dǎo)人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HRMECs)損傷建立DR模型，分析KIF11在DR中的作用和機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料HRMECs(中科院細(xì)胞庫(kù))，DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)，胎牛血清(美國(guó)Hyclone公司)，LiCl、總RNA提取試劑盒、通用逆轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒(M-MLV)和Real-time PCR試劑盒(北京索萊寶公司)，Lipofectamine 3000(美國(guó)Invitrogen公司)，CCK-8試劑盒(美國(guó)MedChemExpress公司)，Transwell小室(美國(guó)BD公司)，RIPA裂解液和BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(上海碧云天公司)，抗KIF11、缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)、β-catenin、cyclin D1和c-Myc兔單克隆抗體(美國(guó)Cell signaling technology公司)，抗VEGF小鼠單克隆抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)，抗GAPDH鼠單克隆抗體、HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG和山羊抗兔IgG二抗(北京康為試劑公司)。KIF11 siRNA序列(si-KIF11)、對(duì)照序列(si-NC)和Real-time PCR引物序列由上海生工生物工程股份有限公司合成，ABI 7500 Real-time PCR儀和NanoDrop 2000C超微量分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)，Tanon 4600 全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和分組將HRMECs培養(yǎng)在含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃，含體積分?jǐn)?shù)5% CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。正常培養(yǎng)24 h后，將細(xì)胞隨機(jī)分成4組：正常組、高糖組、高糖+si-NC組、高糖+si-KIF11組。正常組細(xì)胞在含5 mmol·L-1葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)；高糖組細(xì)胞在含30 mmol·L-1葡萄糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)；高糖+si-NC組和高糖+si-KIF11組先使用Lipofectamine 3000將100 nmol·L-1si-NC或100 nmol·L-1si-KIF11分別轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，6 h后更換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，然后再給予含30 mmol·L-1葡萄糖的培養(yǎng)基繼續(xù)孵育24 h。

另外，將正常培養(yǎng)的HRMECs隨機(jī)分成高糖組、高糖+si-KIF11組、高糖+si-KIF11+NC組和高糖+si-KIF11+LiCl組來(lái)驗(yàn)證KIF11是否通過(guò)Wnt/β-catenin通路發(fā)揮作用。高糖組和高糖+si-KIF11組細(xì)胞處理方法同前。高糖+si-KIF11+NC組和高糖+si-KIF11+LiCl組在轉(zhuǎn)染si-KIF11后分別加入20 mmol·L-1NaCl或20 mmol·L-1LiCl孵育2 h后給予含30 mmol·L-1葡萄糖的培養(yǎng)基繼續(xù)孵育24 h。

1.2.2 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力將HRMECs按照每孔1×103個(gè)接種到96孔板中，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，分組處理后，每孔中加入10 μL CCK-8溶液繼續(xù)孵育2 h，用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔在450 nm波長(zhǎng)處的吸光度。

1.2.3 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移將分組處理后的HRMECs用胰蛋白酶消化后，無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋成濃度為105個(gè)·mL-1的細(xì)胞懸液。取200 μL細(xì)胞懸液加入到Transwell上室，下室加入含不同濃度的葡萄糖及體積分?jǐn)?shù)20%胎牛血清的培養(yǎng)基。在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24 h后，用棉簽輕輕地將上層未遷移的細(xì)胞擦掉，下層PBS清洗后，40 g·L-1多聚甲醛固定30 min，結(jié)晶紫染色20 min，然后于顯微鏡下觀察拍照并對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 Real-time PCR檢測(cè)細(xì)胞分組處理后，棄培養(yǎng)基，冰冷的PBS清洗細(xì)胞3次，用總RNA提取試劑盒提取細(xì)胞的總RNA，將總RNA沉淀溶解到無(wú)RNA酶的水中。然后根據(jù)試劑盒說(shuō)明書配制20 μL的反應(yīng)體系，將1 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。取1 μL cDNA根據(jù)Real-time PCR試劑盒說(shuō)明書操作，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。KIF11、VEGF和HIF-1α mRNA水平根據(jù)公式2-△△Ct計(jì)算，以GAPDH為內(nèi)參，引物序列見(jiàn)表1。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 Western blot檢測(cè)細(xì)胞分組處理后，加入100 μL RIPA裂解液裂解30 min，4 ℃條件下15 000 r·min-1離心10 min，吸取含總蛋白的上清液，用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度后，每個(gè)樣品取30 μg進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳。將分離的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上后，用50 g·L-1脫脂奶粉對(duì)膜進(jìn)行封閉，之后加入提前稀釋好的一抗KIF11(11000)、HIF-1α(11000)、β-catenin(11000)、cyclin D1(1800)、c-Myc(1800)、VEGF(1600)和GAPDH (12000)在4 ℃過(guò)夜孵育。用TBST充分洗膜3次，加入二抗(15000)室溫孵育1 h。用ECL發(fā)光液對(duì)蛋白條帶進(jìn)行顯色，并用ImageJ軟件分析各個(gè)蛋白條帶的吸光度。以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白的表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。多組間數(shù)據(jù)的比較采用單因素方差分析，并用LSD-t方法進(jìn)行兩兩比較。檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 KIF11在高糖誘導(dǎo)的HRMECs中表達(dá)增加Real-time PCR和Western blot檢測(cè)KIF11 mRNA和蛋白表達(dá)，結(jié)果見(jiàn)圖1。高糖組HRMECs的KIF11 mRNA和蛋白表達(dá)均較正常組顯著升高(均為P<0.05)，高糖+si-KIF11組HRMECs的KIF11 mRNA和蛋白表達(dá)均低于高糖組(均為P<0.05)，而高糖+si-NC組與高糖組HRMECs的KIF11 mRNA和蛋白表達(dá)相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)。

圖1 各組HRMECs的KIF11 mRNA和蛋白表達(dá) A：Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果；B：Western blot檢測(cè)結(jié)果；C：KIF11蛋白相對(duì)表達(dá)量。1：正常組；2：高糖組；3：高糖+si-NC組；4：高糖+si-KIF11組。與正常組相比，*P<0.05；與高糖組相比，#P<0.05。

2.2 降低KIF11表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)的HRMECs增殖的影響CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示，正常組、高糖組、高糖+si-NC組和高糖+si-KIF11組HMRECs細(xì)胞活力分別為100.0%±4.0%、149.3%±6.5%、148.4%±8.5%、110.0%±5.6%。兩兩比較結(jié)果顯示，高糖組HRMECs細(xì)胞活力較正常組增加(P<0.05)，高糖+si-KIF11組HRMECs細(xì)胞活力低于高糖組(P<0.05)，而高糖+si-NC組與高糖組HRMECs細(xì)胞活力相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3 降低KIF11表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)的HRMECs遷移的影響Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，正常組、高糖組、高糖+si-NC組和高糖+si-KIF11組遷移細(xì)胞數(shù)分別為(48.3±4.7)個(gè)、(103.4±8.1)個(gè)、(100.3±9.1)個(gè)、(60.0±6.2)個(gè)。兩兩比較結(jié)果顯示，高糖組HRMECs遷移細(xì)胞數(shù)較正常組增多(P<0.05)，高糖+si-KIF11組HRMECs遷移細(xì)胞數(shù)低于高糖組(P<0.05)，而高糖+si-NC組與高糖組HRMECs遷移細(xì)胞數(shù)相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖2)。

圖2 各組HRMECs遷移情況 A：正常組；B：高糖組；C：高糖+si-NC組；D：高糖+si-KIF11組。

2.4 降低KIF11表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)的HRMECs血管生成相關(guān)因子表達(dá)的影響Real-time PCR和Western blot檢測(cè)血管生成相關(guān)因子VEGF和HIF-1α mRNA和蛋白表達(dá),結(jié)果見(jiàn)圖3。與正常組相比，高糖組HRMECs的VEGF、HIF-1α mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著升高(均為P<0.05)；高糖+si-KIF11組HRMECs的VEGF、HIF-1α mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量均低于高糖組(均為P<0.05)，而高糖+si-NC組與高糖組相比，HRMECs的VEGF、HIF-1α mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)。

圖3 各組HRMECs的VEGF、HIF-1α mRNA和蛋白表達(dá) A：VEGF mRNA相對(duì)表達(dá)量；B：HIF-1α mRNA相對(duì)表達(dá)量；C：Western blot檢測(cè)結(jié)果；D：VEGF蛋白相對(duì)表達(dá)量；E：HIF-1α蛋白相對(duì)表達(dá)量。1：正常組；2：高糖組；3：高糖+si-NC組；4：高糖+si-KIF11組。與正常組相比，*P<0.05；與高糖組相比，#P<0.05。

2.5 降低KIF11表達(dá)對(duì)Wnt/β-catenin通路的影響Western blot檢測(cè)Wnt/β-catenin通路的活化情況，結(jié)果見(jiàn)圖4。與正常組相比，高糖組HRMECs的β-catenin及下游分子cyclin D1和c-Myc蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著升高(均為P<0.05)；高糖+si-KIF11組HRMECs的β-catenin、cyclin D1和c-Myc蛋白相對(duì)表達(dá)量均低于高糖組(均為P<0.05)，而高糖+si-NC組與高糖組相比，HRMECs的β-catenin、cyclin D1和c-Myc 蛋白相對(duì)表達(dá)量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)。

圖4 各組HRMECs的β-catenin、cyclin D1和c-Myc蛋白表達(dá) A：Western blot檢測(cè)結(jié)果；B：β-catenin蛋白相對(duì)表達(dá)量；C：cyclin D1蛋白相對(duì)表達(dá)量；D：c-Myc蛋白相對(duì)表達(dá)量。1:正常組；2：高糖組；3：高糖+si-NC組；4：高糖+si-KIF11組。與正常組相比，*P<0.05；與高糖組相比，#P<0.05。

2.6 Wnt/β-catenin通路激活劑可逆轉(zhuǎn)KIF11下調(diào)對(duì)高糖誘導(dǎo)的HRMECs損傷的影響CCK-8檢測(cè)和Transwell檢測(cè)結(jié)果顯示，高糖組、高糖+si-KIF11組、高糖+si-KIF11+NC組和高糖+si-KIF11+LiCl組HRMECs細(xì)胞活力分別為100.0%±5.3%、65.1%±5.6%、66.7%±6.4%、90.3%±5.7%，遷移細(xì)胞數(shù)分別為(106.0±7.5)個(gè)、(59.7±4.6)個(gè)、(57.7±7.0)個(gè)、(94.6±8.4)個(gè)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，高糖+si-KIF11+LiCl組細(xì)胞活力和遷移細(xì)胞數(shù)均較高糖+si-KIF11組增加(均為P<0.05)。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與高糖+si-KIF11組相比，高糖+si-KIF11+LiCl組HRMECs的VEGF和HIF-1α蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著升高(均為P<0.05)。高糖+si-KIF11+NC組與高糖+si-KIF11組相比，HRMECs的細(xì)胞活力、遷移細(xì)胞數(shù)、VEGF和HIF-1α蛋白相對(duì)表達(dá)量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)(圖5)。

圖5 LiCl對(duì)各組HRMECs的遷移及VEGF、HIF-1α蛋白表達(dá)的影響 A：Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移；B：Western blot檢測(cè)結(jié)果；C：VEGF蛋白相對(duì)表達(dá)量；D：HIF-1α蛋白相對(duì)表達(dá)量。2：高糖組；4：高糖+si-KIF11組;5：高糖+si-KIF11+NC組;6：高糖+si-KIF11+LiCl組。與高糖組相比，*P<0.05；與高糖+si-KIF11組相比，#P<0.05。

3 討論

DR是與糖尿病相關(guān)的慢性、嚴(yán)重的眼部并發(fā)癥，并且DR患者出現(xiàn)糖尿病相關(guān)的其他微血管和大血管并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)增加[11]。高血糖與DR的病理變化密切相關(guān)，可誘導(dǎo)血管新生、炎癥、氧化應(yīng)激和細(xì)胞增殖[11]。VEGF是DR血管病理變化中一個(gè)重要的血管生成因子[12]。VEGF在多種視網(wǎng)膜細(xì)胞中表達(dá)，如視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞、視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞、Müller細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞[13]。在DR發(fā)病過(guò)程中，視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞在血管形成中反應(yīng)最為迅速[14]。過(guò)表達(dá)VEGF是引起血管新生和血管滲漏的主要因素。VEGF可通過(guò)自分泌信號(hào)促進(jìn)人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成，在視網(wǎng)膜中也可通過(guò)旁分泌信號(hào)調(diào)節(jié)血管生成過(guò)程中與其他細(xì)胞的合作[15]。HIF-1α是調(diào)控VEGF表達(dá)的一個(gè)重要轉(zhuǎn)錄因子，在視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞中可被高糖誘導(dǎo)表達(dá)[16]。因此，本研究通過(guò)體外高糖誘導(dǎo)HRMECs損傷來(lái)探究DR的分子機(jī)制。本研究中，經(jīng)高糖處理后HRMECs的增殖、遷移能力增加，且血管生成相關(guān)因子VEGF和HIF-1α表達(dá)上調(diào)，這表明體外模型建立成功。

KIF11基因位于10q24.1，其結(jié)構(gòu)在多個(gè)物種間具有保守性，主要由運(yùn)動(dòng)結(jié)構(gòu)域、內(nèi)部莖結(jié)構(gòu)域和尾部結(jié)構(gòu)域組成。研究證實(shí)，KIF11是調(diào)控細(xì)胞有絲分裂的一個(gè)重要分子[7]。近年來(lái)的研究顯示，KIF11在多種腫瘤細(xì)胞中表達(dá)增加，參與了腫瘤的發(fā)展進(jìn)程[7-8]。KIF11與腫瘤發(fā)展中血管生成也存在一定聯(lián)系，如Luo等[17]等研究顯示，KIF11在腎母細(xì)胞瘤中表達(dá)升高；KIF11過(guò)表達(dá)不僅與瘤細(xì)胞的增殖有關(guān)，還與VEGF表達(dá)和瘤內(nèi)微血管密度有關(guān)[17]。Exertier等[18]研究發(fā)現(xiàn)，KIF11抑制劑可減弱腫瘤細(xì)胞增殖，損傷內(nèi)皮細(xì)胞血管生成能力。KIF11在增生型DR組織中表達(dá)上調(diào)，且其表達(dá)量與血管生成和視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖相關(guān)基因表達(dá)有關(guān)[10]。因此，本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)探究了KIF11在DR中的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，KIF11在高糖誘導(dǎo)的HRMECs中表達(dá)上調(diào)，這與其在增生型DR組織中的表達(dá)趨勢(shì)一致[10]。下調(diào)KIF11表達(dá)顯著降低了高糖誘導(dǎo)的HRMECs的增殖、遷移以及VEGF和HIF-1α表達(dá)，這表明下調(diào)KIF11可抑制高糖誘導(dǎo)的HRMECs損傷，這主要與其血管生成被抑制有關(guān)。

本研究進(jìn)一步探究了KIF11可能的作用機(jī)制。經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路在胚胎生成和成體組織穩(wěn)態(tài)中是一個(gè)進(jìn)化保守的調(diào)節(jié)通路[19-20]。它對(duì)于包括眼在內(nèi)的多種器官的血管形態(tài)形成至關(guān)重要。Wang等[21]研究發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin信號(hào)通路異常能引起多種眼科疾病。Wnt/β-catenin通路的過(guò)度活化與DR中的視網(wǎng)膜炎癥和血管生成有關(guān)[22]。Pei等[23]研究表明，KIF11可通過(guò)激活Wnt/β-catenin通路增加乳腺癌細(xì)胞的自我更新。因此，本研究進(jìn)一步探究了KIF11是否通過(guò)Wnt/β-catenin通路在高糖誘導(dǎo)的HRMECs損傷中發(fā)揮作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，下調(diào)KIF11顯著降低了高糖誘導(dǎo)的β-catenin及下游分子cyclin D1和c-Myc蛋白水平。LiCl通過(guò)抑制GSK-3β穩(wěn)定游離的細(xì)胞質(zhì)β-catenin蛋白，從而激活經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路[22]。本研究使用LiCl進(jìn)一步驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，與高糖+si-KIF11組相比，高糖+si-KIF11+LiCl組HRMECs細(xì)胞活力和遷移細(xì)胞數(shù)均顯著增加，且VEGF和HIF-1α蛋白表達(dá)水平均顯著上調(diào)。這表明KIF11在高糖誘導(dǎo)的HRMECs中是通過(guò)活化Wnt/β-catenin通路發(fā)揮作用的。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)，KIF11在高糖誘導(dǎo)的HRMECs中表達(dá)增加，降低KIF11表達(dá)可通過(guò)阻止Wnt/β-catenin通路活化，抑制高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖、遷移和血管生成。本研究進(jìn)一步闡明了DR的發(fā)病機(jī)制，并為DR的治療提供新的理論基礎(chǔ)。抑制KIF11可能是未來(lái)治療DR的新策略。