劉香麗，馬素平，王欣欣，張麗慧，王嬌，楊曉青

(1.河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院 a.病理科；b.脾胃肝膽科；c.兒科醫(yī)院實驗室，河南 鄭州 450000；2.北京佑安醫(yī)院 病理科，北京 100167)

先天性非溶血性黃疸是指肝內(nèi)膽紅素、膽汁代謝相關基因改變導致代謝酶功能障礙，最終導致血清膽紅素升高的一組疾病，臨床表現(xiàn)為鞏膜、皮膚、黏膜等發(fā)生黃染，該類疾病臨床分為以間接膽紅素(indirect bilirubin，IBIL)升高為主型和直接膽紅素(direct bilirubin，DBIL)升高為主型[1]。先天性非溶血性黃疸由于臨床表現(xiàn)多樣且不典型致使臨床診斷有一定困難，而超聲引導經(jīng)皮肝穿刺活檢抽取少量肝組織進行組織病理學檢查仍是診斷和辨別其類型的有效手段，該方法具有損傷小、操作簡便等特點[2]。本文就河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院脾胃肝膽科和北京佑安醫(yī)院近6 a來收治的32例先天性非溶血性黃疸患者進行回顧性分析，初步統(tǒng)計其常見分型的占比，總結(jié)先天性非溶血性黃疸患者的主要病理特點、臨床特征及中醫(yī)證候，為先天性非溶血性黃疸患者的診治提供幫助。

1 對象與方法

1.1 研究對象收集2014年4月至2019年10月河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院以“黃疸待查”為診斷的29例患者和北京佑安醫(yī)院收治的3例Crigler-Najjar綜合征Ⅱ型(Crigler-Najjar syndrome Ⅱ，CNS-Ⅱ)患者。患者年齡 8～58歲，平均(36.16±14.14)歲，其中男11～58歲，女8～48歲。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，取得患者同意。

1.1.1納入標準 (1)實驗室檢查血清總膽紅素高于34 μmol·L-1，IBIL高于17.1 μmol·L-1或DBIL高于23.7 μmol·L-1；(2)轉(zhuǎn)氨酶正常；(3)身、目黃染；(4)紅細胞脆性正常。

1.1.2排除標準 (1)病毒性/藥物性肝炎患者；(2)自身免疫性肝病患者；(3)合并其他系統(tǒng)嚴重疾病患者，如惡性腫瘤；(4)膽道梗阻性患者；(5)慢性溶血性貧血患者。

1.1.3分組標準 依據(jù)膽紅素的性質(zhì)進行分組，IBIL高于17.1 μmol·L-1為IBIL升高組，DBIL高于23.7 μmol·L-1為DBIL升高組。

1.1.4中醫(yī)證候標準 參照中國中醫(yī)藥出版社全國高等中醫(yī)藥院校規(guī)劃教材(第2版)《中醫(yī)內(nèi)科學》[3]，主要癥狀為目黃、身黃、小便黃，尤目黃為要，可兼有發(fā)熱，胃脘腹痞悶，頭身困重，大便稀溏等表現(xiàn)，危重情況可有肌膚瘀斑、手足抽搐、神昏譫語等重癥表現(xiàn)。

1.2 方法

1.2.1實驗室檢測 患者于入院翌晨空腹抽取靜脈血送檢，檢測指標為：谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine transaminase，ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate transaminase，AST)、堿性磷酸酶(alkaline phospha-tase，ALP)、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(gamma glutamyltransferase，GGT)、DBIL、IBIL。

1.2.2肝穿刺活檢術(shù)及病理染色 肝臟超聲引導下穿刺肝組織1～2條，長度1～2 cm，體積分數(shù)為4%的甲醛水溶液固定后石蠟包埋，3 μm切片進行常規(guī)蘇木精-伊紅(HE)染色及特殊染色D-PAS、普魯士藍染色。

1.2.3外周靜脈血基因檢測 提取3例患者外周靜脈血基因組DNA，其中2例CNS患者采用聚合酶鏈反應(PCR)方法擴增尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶1A1(UGT1A1)基因、1例進行性家族性肝內(nèi)膽汁淤積癥2型(progressive familial intrahepatic cholestasis type 2，PFIC2)患者采用PCR方法擴增ABCB11基因。

1.2.4統(tǒng)計學處理 采用IBM SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以中位數(shù)和四分位數(shù)[M(P25，P75)]表示，兩樣本間比較采用獨立樣本非參數(shù)檢驗(Wilcoxon檢驗)；計數(shù)資料以率或構(gòu)成比(%)表示，采用χ2檢驗或Fisher精確概率法。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 先天性非溶血性黃疸的構(gòu)成比本研究納入的32例患者中IBIL升高組27例(84.38%)，包括Gilbert綜合征(Gilber syndrome，GS)20例(62.5%)和CNS-Ⅱ 7例(21.88%)；DBIL升高組5例(15.62%)，包括Dubin-Johnson綜合征3例(9.38%)、Rotor綜合征1例(3.12%)、PFIC2患者1例(3.12%)。

2.2 先天性非溶血性黃疸的性別比較GS、Dubin-Johnson綜合征、CNS主要以男性為主，兩組性別比較差異無統(tǒng)計學意義(P=0.637)(圖1)。

圖1 不同先天性非溶血性黃疸的性別比例

2.3 癥狀、體征及中醫(yī)證型根據(jù)兩組患者入院時及住院期間的癥狀及體征統(tǒng)計所得：身、目、尿黃(32例，100%)、間斷右脅不適(11例，34.38%)是先天性黃疸患者最常見的臨床表現(xiàn)，少數(shù)患者乏力(2例，6.25%)、脾大(3例，9.38%)、皮膚瘙癢(2例，6.25%)、發(fā)育遲緩(1例，3.12%)、上腹痛(1例，3.12%)。

中醫(yī)證型，IBIL升高組和DBIL升高組陰黃占比多于陽黃，陽黃組中的各證型在IBIL升高組和DBIL升高組之間差異無統(tǒng)計學意義(P=0.341)，陰黃組中的各證型在IBIL升高組和DBIL升高組之間差異無統(tǒng)計學意義(P=0.612)(表1)。

表1 兩組患者中醫(yī)證候[n(%)]

2.4 肝功能IBIL升高組和DBIL升高組中 ALT、AST、ALP、GGT數(shù)值在正常范圍內(nèi)，且二者比較差異無統(tǒng)計學意義(P分別為0.336、0.792、0.676、0.583)；IBIL升高組中，CNS-Ⅱ患者IBIL(P<0.001)和DBIL(P=0.003)的升高程度都高于GS患者，見表2；DBIL升高組中，Dubin-Johnson綜合征、Rotor綜合征和PFIC2患者的DBIL值分別為33.1(中位數(shù))、72.10、277.60 μmol·L-1。

表2 IBIL升高組的肝功能[M(P25，P75)]

2.5 組織學表現(xiàn)IBIL升高組中GS(圖2A)和DBIL升高組中Rotor綜合征肝小葉結(jié)構(gòu)大致正常，無特異性組織學表現(xiàn)(圖2E、F)。DBIL升高組中Dubin-Johnson綜合征主要表現(xiàn)為肝中央靜脈和毛細膽管周圍肝細胞質(zhì)內(nèi)見較多棕黑色色素顆粒沉積(圖2B)；PFIC2主要表現(xiàn)為小葉內(nèi)肝多核巨細胞的形成，形狀似假腺泡樣(圖2G、H)。具體組織學改變見圖2、表3。

A為GS，肝小葉大致正常，中央靜脈周圍肝細胞質(zhì)內(nèi)脂褐素顆粒沉著(HE，400×)；B為Dubin-Johnson綜合征，中央靜脈周圍肝細胞毛細膽管側(cè)有大小不等的棕黑色顆粒(HE，252×)；C、D為CNS-Ⅱ型，左圖為匯管區(qū)纖維性擴大，與鄰近匯管區(qū)相連形成橋接纖維隔，少量混合性炎細胞浸潤(HE，252×)，右圖為匯管區(qū)纖維化，匯管區(qū)周圍肝細胞內(nèi)鐵顆粒沉積(普魯士藍染色，252×)；E、F為Rotor綜合征，左圖為肝小葉大致正常(HE，252×)，右圖為匯管區(qū)未見明顯炎細胞浸潤(HE，252×)；G、H為PFIC2，左圖為匯管區(qū)輕度混合性炎細胞浸潤，纖維組織輕度增生，小葉間膽管可見(D-PAS，400×)，右圖為肝細胞腫大、淡染，胞漿內(nèi)見膽色素顆粒，散見毛細膽管膽栓，Kupffer細胞腫大含膽栓，少量多核巨細胞(D-PAS，400×)。

表3 不同先天性非溶血性黃疸發(fā)生各種病理學改變的構(gòu)成比[n(%)]

2.6 相關基因檢測分別對2例CNS-Ⅱ患者和1例PFIC2患者進行了基因檢測，CNS-Ⅱ患者UGT1A1基因檢測結(jié)果：1例檢測到3個突變點分別為第1外顯子發(fā)現(xiàn)1個錯義突變c.211G>A、c.G211A(p.Gly71Arg)、第3外顯子發(fā)現(xiàn)堿基缺失c.1009_1015delTACACTG(p.Tyr337Glu)、第5外顯子1個錯義突變c.1456 T>G、(p.Tyr486Asp)；另1例檢測到UGT1A1基因第5外顯子上發(fā)現(xiàn)1個錯義突變c.1471 G>A(p.Val491Met)，為純合子。PFIC2患者基因檢測結(jié)果：ABCB11基因突變，在ABCB11基因上發(fā)現(xiàn)1個錯義突變c.499 G>A(p.Ala167Thr)，為雜合子；在ABCB11基因上還發(fā)現(xiàn)1個錯義突變c.172 G>A(p.Asp58Asn)，為雜合子。

3 討論

通過回顧性分析32例先天性非溶血性黃疸患者發(fā)現(xiàn)Gilbert綜合征所占比率最高，其次為CNS-Ⅱ和Dubin-Johnson綜合征；Rotor綜合征和 PFIC2所占比率最低。

本研究所涉及兩組類型疾病(5種具體疾病)，這些疾病的臨床癥狀和體征具有一定的重疊性，如身、目、尿黃和右脅不適等，隨著疾病的進展會出現(xiàn)更嚴重的臨床體征，如脾大、發(fā)育遲緩等[4]。

同一種疾病的不同患者會表現(xiàn)不同中醫(yī)證型[5]，本研究發(fā)現(xiàn)陰黃患者所占比率較高，可能此類患者先天稟賦不足，脾陽素虛，或濕從內(nèi)生，阻于肝膽，或濕從寒化，寒濕阻遏，致膽汁不循常道，隨血泛溢，浸淫肌膚，發(fā)為陰黃[6]。部分患者后天或嗜食厚味，或攝生不當，致濕從熱化或重感濕熱，熏蒸于脾胃，累及肝膽，發(fā)為陽黃。中醫(yī)證型對臨床中醫(yī)治療具有指導意義[7]，中醫(yī)證型與直接/間接膽紅素升高之間無明確相關性，該研究樣本少，有待以后深入探討。

IBIL升高組GS和CNS-Ⅱ均屬于UGT1A1基因病，UGT1A1基因啟動子區(qū)和編碼區(qū)氨基酸突變使UGT酶蛋白活性分別下降至正常人的30%和10%，進而導致IBIL不同程度升高，有文獻顯示血清總膽紅素水平為85 μmol·L-1是兩者的分界點[8]，也有研究規(guī)定為102.6 μmol·L-1；本研究以血清總膽紅素水平超過85 μmol·L-1界定為CNS-Ⅱ，研究顯示兩者臨床癥狀并無明顯差別。20例GS患者多為中青年男性，病理表現(xiàn)偶見點灶狀壞死，無匯管區(qū)纖維化，預后良好，無需特殊治療；而7例CNS-Ⅱ患者中2例出現(xiàn)了纖維化，并且1例出現(xiàn)了橋接纖維化，CNS-Ⅱ纖維化若不及時治療，有可能發(fā)展為肝硬化且預后不良[9]，該發(fā)現(xiàn)與國外研究[10-12]報道一致。文獻報道，CNS-Ⅱ患者的肝活檢比GS患者更易發(fā)生鐵沉積[13]。

UGT1A1基因檢測方面，1例CNS患者檢測到2個堿基突變點c.211G>A、c.1456 T>G，1處堿基缺失c.1009_1015delTACACTG，前2個突變點是已報道中最常見的突變點[14]，且c.1456 T>G堿基突變會嚴重影響UGT酶蛋白活性[15]；相關文獻報道UGT1A1基因檢測到c.1456T >G、c.625C>T突變患者，可傾向CNS-Ⅱ型的診斷[16]。另1例CNS患者檢測到第 5外顯子1個錯義突變c.1471 G>A(p.Val491Met)，屬純合突變，患者的父母為該突變的雜合子，該突變點在HGMD數(shù)據(jù)庫未見文獻報道，生物信息學軟件分析認為其致病可能性較高。大多數(shù)CNS-Ⅱ患者具有純合錯義突變或復合雜合突變，可將UGT酶活性降低至正常值的10%以下[17]。目前，已報道的UGT1A1基因突變點有160多個，但每個突變點的致病程度尚未完全清楚[18]，需積累更多的臨床資料[19]。在實際工作中，血清總膽紅素在某些條件下會發(fā)生波動，當血清總膽紅素在臨界值發(fā)生波動時，GS與CNS-Ⅱ很難截然區(qū)分[7]，需結(jié)合患者的臨床癥狀、基因突變位點、對苯巴比妥治療的反應程度綜合分析[20]。文獻對于總膽紅素高于100 μmol·L-1且以IBIL升高為主的患者及時行肝穿刺活檢可明確纖維化程度，對臨床后續(xù)治療有指導意義[21]。

DBIL升高組中Dubin-Johnson綜合征和Rotor綜合征臨床癥狀和肝功能指標均相似，二者可以通過肝穿刺病理檢查進行鑒別[22]。Dubin-Johnson綜合征肉眼呈黑褐色；鏡下具有特征性病理表現(xiàn)：中央靜脈和毛細膽管周圍肝細胞胞質(zhì)內(nèi)見較多棕黑色色素顆粒(脂褐素-黑色素復合物)沉積[23]。而Rotor綜合征肉眼正常；鏡下表現(xiàn)肝小葉大致正常，無色素顆粒沉積?；驒z測SLCO1B1、SLCO1B3可證實診斷[24]。PFIC2臨床癥狀為皮膚瘙癢、發(fā)育遲緩；鏡下肝細胞腫脹、淤膽明顯，局灶見少量多核巨細胞，匯管區(qū)纖維化明顯伴橋接纖維化形成[25]。其病理改變明顯重于Dubin-Johnson綜合征和Rotor綜合征，纖維化的出現(xiàn)提示PFIC2預后不良[26]。有關文獻指出，PFIC2最重要的病理特征是小葉內(nèi)肝多核巨細胞的形成，形狀似假腺泡樣，肝多核巨細胞的數(shù)量不同病例之間會有差別[27]。最近研究報道歐洲 D482G突變型多核巨細胞的數(shù)量明顯少于其他突變型[28]，另外血清GGT偏低或正常是 PFIC2重要的血清學特點[29]。

本研究對32例非溶血性黃疸進行了回顧性分析，Dubin-Johnson綜合征可依據(jù)其特異的組織學表現(xiàn)明確診斷，但一些黃疸患者組織學表現(xiàn)并不特異，需結(jié)合臨床資料、血清膽紅素水平及基因突變位點綜合診斷。另外，纖維化的出現(xiàn)及纖維化的程度可以指導臨床治療及提示預后。總之，肝穿刺活組織病理在臨床先天性非溶血性黃疸的診斷與鑒別診斷中起著重要的作用。中醫(yī)證型對臨床中醫(yī)治療具有指導意義。由于Rotor綜合征和PFIC2病例屬于罕見病例，在本文中未能提供較多的數(shù)據(jù)支撐，在以后的工作中，有待于積累更多的臨床資料揭示基因突變與組織學之間的關系，分析中醫(yī)證候特點，以便更好地服務于臨床。