郭家剛,楊 松,童光祥,伍玉菡,朱 倩,杜京京,潘九紅,江 艦,*
(1.安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,安徽 合肥 230031;2.安徽省食品微生物發(fā)酵與功能應(yīng)用工程實(shí)驗(yàn)室,安徽 合肥 230031;3.廣德驚石農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司,安徽 宣城 242200)
竹筍滋味鮮美、質(zhì)脆爽口,富含膳食纖維、蛋白質(zhì)與氨基酸、維生素和人體所必需的礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分,且膽固醇、脂肪含量低,享有“菜中珍品”美譽(yù),是深受廣大消費(fèi)者喜愛的純天然健康食品[1-3]。同時,竹筍含有酚類、多糖、類黃酮等多種活性物質(zhì),具有抗氧化[4]、抑菌[5]、調(diào)節(jié)血糖[6-7]、改善腸道環(huán)境[8]等生理功能,藥用價值較高[9]。我國竹筍資源豐富,可食品種繁多,主要分布于東部沿海地區(qū)、四川和廣西等地[10]。新鮮竹筍水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)90%,采后生理代謝旺盛,極易出現(xiàn)褐變、木質(zhì)化、營養(yǎng)物質(zhì)損失等問題,導(dǎo)致其食用品質(zhì)和商品性降低[11]。目前常用的竹筍貯藏加工方式有干制、腌漬和低溫貯藏等[12-13]。然而低溫冷藏易引起鮮竹筍失水,且只具備短時間保鮮效果;干制處理難以保持竹筍特有的形態(tài)、色澤和風(fēng)味,營養(yǎng)成分也會受到不同程度的影響;腌漬竹筍含鹽量高,通常還需脫鹽處理,難以滿足消費(fèi)者日益增長的低鹽、健康營養(yǎng)飲食需求[14]。因此,探究高品質(zhì)果蔬加工技術(shù)對果蔬產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要意義。
冷凍作為果蔬重要的貯藏加工方式,在80多年前已有應(yīng)用[15],可以顯著延長果蔬貯藏時間、減少損耗[16],能夠較好地保持食品的色澤、風(fēng)味和營養(yǎng)成分[17]。然而傳統(tǒng)冷凍方法的降溫速率比較低,冷凍過程中形成的粗大、不規(guī)則的冰晶體會對凍藏竹筍等果蔬產(chǎn)品品質(zhì)產(chǎn)生較大影響,導(dǎo)致產(chǎn)品質(zhì)構(gòu)損傷、解凍后蛋白質(zhì)等營養(yǎng)流失以及適口性不佳等問題,影響冷凍竹筍品質(zhì)和風(fēng)味[18-19]。微凍藏(-3 ℃)是介于冷藏和冷凍貯藏之間的一種低溫保鮮方式,能夠改善竹筍汁液流失情況,但貯藏期較短[20]。因此,控制冰晶尺寸及分布依然是當(dāng)前果蔬冷凍貯藏技術(shù)研究的熱點(diǎn)[21]。近年來,隨著食品冷凍技術(shù)研究的深入和物理場應(yīng)用技術(shù)的興起,靜電場作為一種新型非熱處理手段,具有成本低、效率高、操作簡單等優(yōu)點(diǎn),在食品貯藏與加工領(lǐng)域引起廣泛關(guān)注[22]。低壓靜電場輔助冷凍技術(shù)是通過外加低壓靜電場作用于物料凍結(jié)過程的一種新型技術(shù),根據(jù)物料凍結(jié)特性,選擇適當(dāng)場強(qiáng)的低壓靜電場輔助冷凍有助于提高肉品的凍結(jié)品質(zhì)[23-24]。然而,目前關(guān)于低壓靜電場輔助冷凍對果蔬凍結(jié)過程及其品質(zhì)影響的研究鮮有報(bào)道,且低壓靜電場輔助冷凍作用機(jī)理尚不明確,需進(jìn)一步探究。
本實(shí)驗(yàn)以竹筍為研究對象,將低壓靜電場應(yīng)用于竹筍冷凍過程,以非施加低壓靜電場的冷凍竹筍作為對照,探究低壓靜電場輔助冷凍對竹筍凍結(jié)效率、冰晶分布、微觀形態(tài)及汁液流失等凍結(jié)特性的影響,為低壓靜電場輔助冷凍果蔬加工技術(shù)提供理論依據(jù)和參考。
實(shí)驗(yàn)所用竹筍為當(dāng)季新鮮冬筍,采收于安徽省廣德驚石農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司基地。
無水乙醇、二甲苯、中性樹膠、乙酸異戊酯 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;番紅固綠(植物)染液、FAA固定液(甲醛-冰醋酸-乙醇-水溶液,體積比為5∶5∶45∶45)、電子顯微鏡固定液(含質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.5%戊二醛的磷酸緩沖液,pH 7.0~7.5)、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS,0.1 mol/L、pH 7.4)武漢賽維爾生物科技有限公司。
ME204電子顯示天平 梅特勒-托利多(上海)儀器有限公司;TA.XT Plus型質(zhì)構(gòu)分析儀 英國Stable Micro Systems公司;JK-8U多路溫度測試儀 常州金艾聯(lián)電子科技有限公司;DW-40低溫試驗(yàn)冰箱(-35 ℃,90 L)滄州科成儀器設(shè)備有限公司;NMI20-015V-I低場核磁共振(low-field nuclear magnetic resonance,LF-NMR)成像分析儀 上海紐邁電子科技有限公司;JB-P5包埋機(jī)武漢俊杰電子有限公司;RM2016切片機(jī) 上海徠卡儀器有限公司;ECLIPSE E100正置光學(xué)顯微鏡日本Nikon公司;K850臨界點(diǎn)干燥儀 英國Quorum公司;MC1000離子濺射儀、SU8100掃描電子顯微鏡日本Hitachi公司;DENBA+鮮度保持電場裝置(173 mm×247 mm×100 mm) 日本AGUA商事株式會社;低壓靜電場裝置為實(shí)驗(yàn)室自制,由靜電場發(fā)生裝置(交流電壓220V,50/60 Hz)和放電板(430 mm×230 mm)組成,靜電場發(fā)生裝置輸出電壓為2 500 V,電流為0.2 mA,放電板在低溫試驗(yàn)冰箱內(nèi)產(chǎn)生低壓靜電場,形成負(fù)離子環(huán)境,如圖1所示。
圖1 低壓靜電場冷凍實(shí)驗(yàn)裝置Fig. 1 Schematic diagram of the LVEF-assisted freezing apparatus
1.3.1 樣品處理及分組
鮮筍采收后挑選無破損、無病蟲害、色澤較好、筍齡和質(zhì)量相近的新鮮竹筍置于4 ℃冷庫中冷藏備用,實(shí)驗(yàn)時從冷庫隨機(jī)取出竹筍,清洗表面泥沙,放入沸水中燙漂30 min,常溫流水冷卻,剝?nèi)スS殼,切除底部老蔸,剩余部分切成筍塊(2 cm×5 cm×5 cm),得到鮮竹筍樣品。選取50 塊鮮竹筍樣品隨機(jī)分為5 組,每組10 塊竹筍。以非靜電場下冷凍(-35 ℃)的竹筍作為對照組(標(biāo)記為CK),具體操作為直接將竹筍放入DW-40低溫試驗(yàn)冰箱(-35 ℃,90 L)中進(jìn)行凍結(jié)。以低壓靜電場環(huán)境下冷凍(-35 ℃)的竹筍作為處理組。設(shè)置竹筍與低壓靜電場發(fā)生板之間的距離分別為10、20、30、40 cm,所得樣品分別標(biāo)記為LVEF-10、LVEF-20、LVEF-30、LVEF-40。
1.3.2 凍結(jié)曲線的測定
采用JK-8U多路溫度測試儀測定竹筍樣品凍結(jié)過程中的溫度變化,將溫度傳感器探頭插入竹筍樣品中心,每隔3 s記錄一次溫度,繪制凍結(jié)曲線。待竹筍樣品中心溫度降至-18 ℃時停止測定,冷凍過程結(jié)束。然后將凍結(jié)樣品轉(zhuǎn)移到4 ℃冰箱進(jìn)行解凍,待竹筍樣品解凍后進(jìn)行指標(biāo)測定。
1.3.3 冰晶形態(tài)觀察
取不同冷凍處理組竹筍樣品及冷凍處理前的鮮竹筍樣品置于FAA固定液中固定24 h以上,取出后用手術(shù)刀將目的部位組織修平,放入脫水盒內(nèi),然后放進(jìn)脫水機(jī)依次進(jìn)行梯度乙醇溶液脫水,浸蠟、包埋后于-20 ℃凍臺冷卻,再將冷卻的蠟塊置于切片機(jī)切片,切片厚度4 μm。將石蠟切片脫蠟至水化,經(jīng)番紅固綠染色,中性樹膠封片后,采用正置光學(xué)顯微鏡觀察分析。
1.3.4 水分損失率的測定
取不同冷凍處理組竹筍樣品,稱質(zhì)量后立即放入4 ℃冰箱中解凍24 h,然后用吸水紙拭去竹筍表面汁液,并稱質(zhì)量,按下式計(jì)算竹筍樣品解凍后的水分損失率[25]。
式中:m1為竹筍樣品解凍前質(zhì)量/g;m2為竹筍樣品解凍后質(zhì)量/g。
1.3.5 硬度測定
采用TA.XT Plus質(zhì)構(gòu)儀測定鮮竹筍和不同冷凍處理組解凍后竹筍樣品的硬度。探頭型號P/2,壓縮量30%;測前速率3.00 mm/s,測試速率1.00 mm/s,測后速率5.00 mm/s,觸發(fā)力5 g。每個樣品重復(fù)測定6 次。
1.3.6 水分分布的測定
取鮮竹筍和不同冷凍處理組竹筍樣品,切片(0.8 cm×0.8 cm×1.5 cm)并稱樣品質(zhì)量,然后置于直徑為1.2 cm的核磁共振管底部,采用NMI20-015V-I磁體探頭,采用CPMG(Carr-Purcell-Meiboom-Gill)序列測定樣品橫向弛豫時間T2,每個處理組樣品重復(fù)測定3 次。主要參數(shù)設(shè)置:采樣頻率100 kHz,90°脈寬15 μs,180°脈寬29 μs,射頻延時0.08 ms,重復(fù)采樣等待時間3 500 ms,累加采樣次數(shù)為4,回波時間3 ms,回波個數(shù)為2 000。主要成像參數(shù)為:重復(fù)時間500 ms,回波時間20 ms,平均次數(shù)為3,F(xiàn)OV Read為80 mm,F(xiàn)OV Phase為80 mm,竹筍樣品成像厚度為2 mm,同一樣品進(jìn)行4 層成像。成像方式為縱切片,圖像文件保存為fid格式然后采用V1. 0軟件進(jìn)行偽彩處理。
1.3.7 竹筍纖維微觀結(jié)構(gòu)觀察
取不同冷凍處理組竹筍樣品及冷凍處理前的鮮竹筍樣品浸入電子顯微鏡固定液中室溫固定2 h,然后轉(zhuǎn)移至4 ℃保存。固定好的樣品經(jīng)PBS漂洗3 次,每次15 min。用PBS配制1%鋨酸溶液室溫避光固定1~2 h。然后用PBS漂洗3 次,每次15 min。把組織樣品依次浸入不同體積分?jǐn)?shù)(30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%、100%)的乙醇和乙酸異戊酯進(jìn)行脫水處理,脫水后的樣品放入臨界點(diǎn)干燥儀內(nèi)干燥。將樣本緊貼于導(dǎo)電碳膜雙面膠上,然后放入離子濺射儀樣品臺上噴金30 s左右,在掃描電子顯微鏡下觀察并拍照。
每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS Statistics 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析,采用最小顯著性差異(least significance difference,LSD)法進(jìn)行顯著性分析,P<0.05表示差異顯著,采用Origin 2017軟件和GraphPad Prism 6軟件作圖。
在冷凍過程中,凍結(jié)速率對冷凍果蔬品質(zhì)起著至關(guān)重要的作用[26-27]。如圖2所示,對照組與處理組樣品的凍結(jié)曲線變化趨勢大體相同,可分為:預(yù)冷階段(I),即竹筍溫度從初始溫度迅速降至冰點(diǎn)溫度;相變階段(II),即竹筍中的水轉(zhuǎn)變成冰晶的過程,該階段竹筍樣品中的水大部分凍結(jié)成冰,并釋放出相變熱量,因此溫度下降比較緩慢;深度凍結(jié)階段(III),該階段竹筍溫度快速下降到冷凍終點(diǎn)溫度[28]。整個凍結(jié)過程,樣品中心溫度從5 ℃開始下降,達(dá)到-18 ℃結(jié)束,低壓靜電場處理組LVEF-10、LVEF-20、LVEF-30、LVEF-40所需凍結(jié)時間分別為214.6、208.3、205.9、212.9 min,均明顯短于非施加低壓靜電場對照組所需凍結(jié)時間(225.8 min),不同靜電場處理組凍結(jié)時間差異不明顯。由此可見,在低壓靜電場輔助下,各處理組竹筍通過最大冰晶生成帶的時間有不同程度的縮短,樣品凍結(jié)速率得到提高,其中處理組LVEF-30的凍結(jié)速率最快,相較對照組凍結(jié)時間縮短近20 min。研究發(fā)現(xiàn),靜電場對水分子的極化作用能降低水分子成核自由能,進(jìn)而促進(jìn)冰核的產(chǎn)生,提高凍結(jié)效率[29],但該結(jié)論仍待進(jìn)一步驗(yàn)證。
圖2 低壓靜電場輔助冷凍對竹筍凍結(jié)曲線的影響Fig. 2 Freezing curves of bamboo shoot samples treated by different freezing methods
果蔬在冷凍過程中會形成針狀等不規(guī)則的冰晶,對組織造成機(jī)械損傷、導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)破裂[30]。如圖3所示,新鮮竹筍組織結(jié)構(gòu)分布均勻、相對致密,細(xì)胞之間縫隙較小。竹筍在冷凍過程中,組織細(xì)胞間隙中的水不斷形成冰晶,體積逐漸增大,冰晶的生長導(dǎo)致竹筍組織及周圍細(xì)胞結(jié)構(gòu)永久性破壞,在竹筍組織中產(chǎn)生不規(guī)則孔洞。對照組竹筍組織中形成的冰晶體積較大,分布無序,細(xì)胞破損比較嚴(yán)重。而低壓靜電場冷凍處理組竹筍組織形成的冰晶體積相對較小、分布較為均勻,細(xì)胞破壞程度較輕,竹筍組織結(jié)構(gòu)保持較好,各處理組均顯著優(yōu)于對照組,與新鮮竹筍組織形態(tài)相近;這可能是由于在低壓靜電場作用下,竹筍樣品凍結(jié)速率提高,促進(jìn)了冰核的形成,并抑制了冰晶的過快生長,使得形成的冰晶體積小、分布均勻,與對照組竹筍相比,產(chǎn)生了較小的水位移和更少的組織損傷。
圖3 低壓靜電場輔助冷凍對竹筍冰晶形態(tài)的影響(35×)Fig. 3 Effects of different freezing treatments on ice crystal morphology in bamboo shoot samples (35 ×)
竹筍樣品冷凍過程中,水分結(jié)晶后體積增大會導(dǎo)致組織損傷及細(xì)胞破裂,解凍后易出現(xiàn)營養(yǎng)物質(zhì)流失等現(xiàn)象。水分損失率反映了竹筍解凍后汁液流失的情況,其受到冰晶的形成、細(xì)胞含水率及組織持水性等多種因素的影響[31]。如圖4所示,與對照組相比,低壓靜電場處理組LVEF-10、LVEF-20、LVEF-30、LVEF-40的竹筍解凍水分流失率分別為14.16%、12.58%、9.73%、10.44%,顯著低于對照組(21.01%)(P<0.05)。低壓靜電場輔助凍結(jié)顯著降低了竹筍在解凍后的水分損失率,有效改善了竹筍的保水性及營養(yǎng)流失情況,其中LVEF-30組竹筍汁液流失最少。這可能是因?yàn)榈蛪红o電場輔助冷凍減小了冰晶的形成和大小,導(dǎo)致冰晶對竹筍微觀組織結(jié)構(gòu)的損傷程度有所降低,所以解凍后竹筍水分損失率有不同程度的降低,該結(jié)果與凍結(jié)速率分析結(jié)果相一致。
圖4 低壓靜電場輔助冷凍對竹筍樣品水分損失率的影響Fig. 4 Effects of different freezing treatments on drip loss of bamboo shoot samples
質(zhì)構(gòu)性質(zhì)是評價果蔬質(zhì)地的重要參數(shù),直接決定了果蔬產(chǎn)品的商業(yè)價值[32]。通過測定解凍后竹筍樣品的硬度評價低壓靜電場輔助冷凍對竹筍品質(zhì)的影響。如圖5所示,新鮮未凍結(jié)竹筍硬度為633.22 g,經(jīng)低壓靜電場輔助冷凍處理后,各組竹筍硬度均不同程度下降。與對照組相比,施加低壓靜電場處理的LVEF-10、LVEF-20、LVEF-30和LVEF-40竹筍硬度分別為461.19、507.48、496.65、455.31 g,均顯著大于對照組(350.70 g)(P<0.05),其原因與冷凍過程中冰晶的形成有關(guān)。冰晶使竹筍組織結(jié)構(gòu)受到破壞,從而導(dǎo)致竹筍硬度降低,而低壓靜電場輔助冷凍使竹筍凍結(jié)過程中形成的冰晶較小且分布均勻,減少了冰晶對竹筍組織結(jié)構(gòu)造成的損傷,因此低壓靜電場輔助冷凍顯著改善了竹筍質(zhì)構(gòu)品質(zhì),與未凍結(jié)鮮竹筍樣品硬度更接近。
圖5 低壓靜電場輔助冷凍對竹筍樣品硬度的影響Fig. 5 Effects of different freezing treatments on hardness of bamboo shoot samples
LF-NMR能夠快速、無損檢測食品中水分的狀態(tài)信息,利用低場核磁多脈沖回波序列測得的橫向弛豫時間T2可以反映水分在食品內(nèi)部的存在狀態(tài)及分布[33]。T2越小,表示水分與組織結(jié)合越緊密,水分流動性越小,反之T2值越大表明水分與組織結(jié)合越疏松,水分的流動性越大;用弛豫時間對應(yīng)的峰面積反映水分含量[34]。如圖6所示,各組T2反演譜曲線上均有2個波峰,即T21(4~25 ms)表示竹筍細(xì)胞中不易流動水,以及T22(100~750 ms)表示自由水(如液泡中的水),其流動性較大[35]。如表1所示,與對照組竹筍相比,經(jīng)低壓靜電場輔助冷凍處理的竹筍橫向弛豫時間T21無顯著性差異(P>0.05),而T22變化顯著(P<0.05),其原因可能是普通冷凍凍結(jié)速率慢,形成的冰晶粗大,對竹筍細(xì)胞的破壞程度大,導(dǎo)致大分子物質(zhì)與水的結(jié)合發(fā)生變化,從而使其持水性下降。與對照組相比,低壓靜電場處理組的水分含量均發(fā)生顯著性變化(P<0.05),低壓靜電場輔助冷凍處理組的峰面積均大于對照組峰面積,這可能是因?yàn)閮鼋Y(jié)過程中冰晶的形成對竹筍組織結(jié)構(gòu)造成了一定的機(jī)械損傷,從而使得一部分水分從竹筍組織中滲出,產(chǎn)生了水分損失,而低壓靜電場輔助冷凍竹筍組織機(jī)械損傷相對較小,汁液流失少,因此水分含量相對較高[36]。
圖6 低壓靜電場輔助冷凍對竹筍中水分橫向弛豫時間T2的影響Fig. 6 Effects of different freezing treatments on transverse relaxation time (T2) of bamboo shoot samples
表1 低壓靜電場輔助冷凍對竹筍水分分布的影響Table 1 Effects of different freezing treatments on water distribution of bamboo shoots
通過樣品反射的LF-NMR信號強(qiáng)度獲得高分辨率氫質(zhì)子密度圖像,檢測竹筍樣品中的水分分布情況,紅色越深表示水分含量越高,藍(lán)色越深表示水分含量越低[37]。如圖7所示,新鮮竹筍水分含量較高,樣品圖像呈黃紅色,色澤分布比較均勻。凍融后的竹筍樣品呈現(xiàn)不同程度的藍(lán)綠色,表明凍融后樣品水分含量有所降低,對照組竹筍樣品圖像僅呈現(xiàn)較深的藍(lán)色,表明對照組水分流失較多,與對照組相比,LVEF-10、LVEF-20、LVEF-30、LVEF-40組圖像多呈紅色和黃色,說明低壓靜電場輔助冷凍處理的竹筍水分含量高于對照組,其中LVEF-30圖像黃綠色區(qū)域最少,且分布均勻,與新鮮竹筍樣品圖像基本接近,表明LVEF-30處理可以較好地保持竹筍水分。
圖7 不同處理?xiàng)l件竹筍組織氫質(zhì)子密度加權(quán)偽彩圖Fig. 7 Weighted pseudo color images of hydrogen proton density of bamboo shoots under different treatment conditions
對新鮮竹筍及低壓靜電場輔助冷凍竹筍組織的橫截面進(jìn)行掃描電子顯微鏡觀察,分析竹筍微觀結(jié)構(gòu)的完整性及損傷情況。如圖8所示,新鮮竹筍纖維呈現(xiàn)疏松多孔的蜂窩狀結(jié)構(gòu),細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整,排列緊密、細(xì)胞間隙小[10],而對照組竹筍組織結(jié)構(gòu)損傷程度較大,細(xì)胞嚴(yán)重變形、破損。與對照組相比,低壓靜電場輔助冷凍處理組的竹筍微觀結(jié)構(gòu)保持較好,細(xì)胞排列較為緊密且間隙較小、細(xì)胞壁受到損傷的程度也較輕。結(jié)果表明,低壓靜電場輔助冷凍改善了竹筍組織微觀結(jié)構(gòu)的損傷程度,與竹筍水分損失率低和硬度維持較好的結(jié)果相互印證。
圖8 不同處理后竹筍的微觀結(jié)構(gòu)(200×)Fig. 8 Microstructure of bamboo shoots subjected to different freezing treatments (200 ×)
本研究將低壓靜電場輔助冷凍技術(shù)應(yīng)用于竹筍冷凍加工,探究了低壓靜電場輔助冷凍對竹筍凍結(jié)特性及品質(zhì)的影響。在竹筍樣品與靜電板10~40 cm間距條件下,低壓靜電場輔助冷凍縮短了凍結(jié)時間,改善了竹筍凍融后的硬度及汁液流失情況,其潛在機(jī)理可能是由于靜電場降低了水分子成核自由能,改變了晶體生長模式,從而縮短了竹筍凍結(jié)時間,提高了冷凍速率,有效抑制了冰晶生長,形成的冰晶小且分布均勻,減輕了冰晶生長對竹筍組織微觀結(jié)構(gòu)的機(jī)械損傷程度,較好地保持了竹筍的硬度,解凍后竹筍樣品的持水性得到改善,水分損失率降低。綜上所述,低壓靜電場輔助冷凍技術(shù)可以提高竹筍冷凍速率,改善冷凍后的竹筍品質(zhì)。