聚乙烯醇-殼聚糖基抑菌指示膜的制備及在冷鮮肉中的應(yīng)用

吳楊林，孫 理，李亦欣，高 媛，李 昊，鄭 聰，李春偉

（東北林業(yè)大學(xué)工程技術(shù)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040）

智能包裝是指與其他包裝相比，可以對(duì)包裝周圍環(huán)境進(jìn)行檢測(cè)、感知、記錄、追蹤、交流等的新型包裝[1]?；钚园b是通過(guò)材料中的活性組分來(lái)改變食品的包裝環(huán)境以延長(zhǎng)貯存期、改善食品安全性和感官特性，同時(shí)保持食品品質(zhì)不變的一種包裝體系[2]。智能包裝與活性包裝的區(qū)別在于智能包裝在供應(yīng)鏈循環(huán)中主要用于監(jiān)測(cè)產(chǎn)品自身或所處環(huán)境的信息，而活性包裝會(huì)主動(dòng)采取措施（如釋放抗氧化劑）來(lái)保護(hù)產(chǎn)品[3]。冷鮮肉是人們?nèi)粘ｏ嬍持谐Ｒ?jiàn)的食物原料，但其在貯存期間新鮮度下降貨架期較短[4]，容易導(dǎo)致食品安全問(wèn)題和造成經(jīng)濟(jì)損失[5-6]。因此，制備一種既能檢測(cè)肉類食品新鮮度又能延長(zhǎng)食品貨架期的智能活性包裝具有現(xiàn)實(shí)意義。

聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，PVA）是一種環(huán)境友好型高分子聚合物，具有優(yōu)良的成膜性、可生物降解性、氣體阻隔性及機(jī)械強(qiáng)度，在食品包裝和醫(yī)藥等領(lǐng)域有著廣泛應(yīng)用[7]。殼聚糖（chitosan，CS）是一種天然高分子，具有良好的生物相容性、成膜性和抗菌性[8]。PVA與CS之間可以形成分子間氫鍵，CS的添加減少了PVA上羥基與水分子作用，使薄膜的耐水性提高[9]。CS/PVA復(fù)合膜相比純CS膜對(duì)氧氣和水蒸氣的阻隔能力增強(qiáng)、機(jī)械性能更優(yōu)異[10]。大量研究利用合成色素作為指示劑，張星暉等[11]利用溴麝香草酚藍(lán)（bromothymol blue，BTB）制作的指示標(biāo)簽?zāi)莒`敏地反映金槍魚的新鮮度。Sutthasupa等[12]以海藻酸鈉和甲基纖維素為原料制備水凝膠并加入BTB，檢測(cè)豬肉糜腐敗，腐敗過(guò)程中指示劑顏色從橙色變?yōu)辄S色。但研究發(fā)現(xiàn)單一指示劑變色范圍窄，復(fù)配指示劑具有更好的指示效果[13]，Chen Huizhi等[14]發(fā)現(xiàn)BTB與甲基紅（methyl red，MR）按質(zhì)量比3∶2混合制備指示劑其顏色變化與豬肉新鮮度具有強(qiáng)相關(guān)性。艾月等[15]利用MR和BTB為指示劑制備新鮮度指示水凝膠應(yīng)用于大米的新鮮度檢測(cè)，指示材料與新米、陳米、陳化米接觸時(shí)色圈顏色分別為米綠黃色、象牙色和硫磺色。研究表明，茶多酚（tea polyphenols，TP）可以有效抑制常見(jiàn)微生物的繁殖，具有優(yōu)異的抗氧化性及廣譜抑菌性。李柯欣[16]采用牛津杯法發(fā)現(xiàn)TP對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等具有明顯的抑菌性。Yang Yufan等[17]發(fā)現(xiàn)添加TP的復(fù)合膜具有良好的抗氧化和抗菌活性，而且隨著TP含量的增加豬肉貨架期最多延長(zhǎng)了3 d。蒙脫土（montmorillonite，MMT）成本低、穩(wěn)定性好，在聚合物基質(zhì)中分散性好，具有獨(dú)特的二維層狀納米結(jié)構(gòu)和陽(yáng)離子交換特性，經(jīng)酸化的MMT具有更強(qiáng)的吸附性和化學(xué)活性，是一種優(yōu)異的中孔載體材料。高靈娟[18]利用改性的MMT成功負(fù)載香芹酚和百里香酚，制備的復(fù)合材料表現(xiàn)出良好的抑菌性。甘文樂(lè)等[19]發(fā)現(xiàn)MMT負(fù)載TP不僅可以增強(qiáng)PVA薄膜的機(jī)械強(qiáng)度，還能夠提高薄膜的水蒸氣阻隔性、耐水性及抗氧化性能。

因此，本實(shí)驗(yàn)以PVA和CS為成膜基材，MMT負(fù)載TP為抑菌劑，添加溴甲酚紫（bromocresol purple，BCP）和MR及其復(fù)配物（BCP與MR質(zhì)量比1∶1、1.5∶1、2∶1）作為指示劑制備抑菌指示膜，分別設(shè)立空白組，研究抑菌劑和指示劑對(duì)PVA-CS薄膜性能的影響，并應(yīng)用于冷鮮肉的保鮮指示，檢驗(yàn)其實(shí)際應(yīng)用效果。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

CS（脫乙酰度≥90%，分子質(zhì)量70～80 kDa）上海藍(lán)季生物有限公司；1797型PVA（醇解度96%～98%） 上海阿拉丁試劑有限公司；甘油 天津富宇精細(xì)化工有限公司；MTT（120 目，醫(yī)藥級(jí)） 山東化學(xué)化工科技有限公司；茶多酚（純度＞98%） 河南萬(wàn)邦實(shí)業(yè)有限公司；BCP、MR（分析純） 天津科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

90-4數(shù)顯控溫磁力攪拌器 上海振捷實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；SB-800D超聲波清洗機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；SDH-25055GT臺(tái)式鼓風(fēng)干燥箱 上海島純實(shí)業(yè)有限公司；LD-05電腦測(cè)控拉力試驗(yàn)機(jī) 長(zhǎng)春月明小型試驗(yàn)機(jī)有限責(zé)任公司；WGT-S透光率/霧度測(cè)定儀上海儀電物理光學(xué)儀器有限公司；SPX-250BIII生化培養(yǎng)箱 天津泰斯特儀器有限公司；X’ Pert3 Powedr X射線衍射儀 荷蘭帕納科公司；Nicolet 6700傅里葉變換紅外光譜儀 賽默飛世爾科技公司。

1.3 方法

1.3.1 抑菌指示膜的制備

PVA和CS溶液的制備：稱取3 g PVA溶于100 mL蒸餾水中，在95 ℃下水浴攪拌2 h后備用；稱取3 g CS溶于100 mL體積分?jǐn)?shù)為1%的乙酸溶液中攪拌至完全溶解。

MMT負(fù)載TP溶液的制備：參照周華鋒等[20]方法進(jìn)行MMT酸改性并作適當(dāng)修改，稱取1 g MMT于燒杯中，加入10 mL 1 mol/L HCl溶液攪拌30 min，室溫靜置24 h后過(guò)濾，用去離子水洗滌pH值至6～7，烘干得到酸化的MMT。然后稱取1 g酸化MMT和0.5 g TP，加入10 mL無(wú)水乙醇，攪拌30 min制得MMT負(fù)載TP溶液。

稱取BCP和MR及其復(fù)配物（BCP與MR質(zhì)量比1∶1、1.5∶1、2∶1）分別溶于無(wú)水乙醇，制備5 g/L指示劑溶液。將制備好的PVA溶液和CS溶液按體積比1∶1混合，加入MMT負(fù)載TP溶液（混合膜液總體積的5%），在40 ℃磁力攪拌器中高速攪拌2 h；再加入4 mL指示劑溶液和0.3 mL甘油，放入40 ℃水浴中攪拌1 h，調(diào)節(jié)pH值至4.5，超聲去泡30 min后得到成膜溶液。取120 mL成膜液倒至方形模具（長(zhǎng)25 cm）中，室溫下放置3 d，揭膜，于25 ℃、相對(duì)濕度75%的恒溫恒濕箱中密封貯存。

將添加BCP指示劑的薄膜記為X1，添加MR指示劑的薄膜記為X2，將添加BCP與MR質(zhì)量比1∶1、1.5∶1、2∶1指示劑的薄膜記分別記為X3、X4、X5；以相同方法制備未添加指示劑的PVA-CS/MMT-TP膜作為對(duì)照組（記為Y1），研究指示劑對(duì)薄膜性能的影響；以相同方法制備未添加抑菌劑的PVA-CS復(fù)合膜（BCP與MR質(zhì)量比1.5∶1）作為對(duì)照組（記為Y2），研究抑菌劑對(duì)薄膜性能影響。

1.3.2 薄膜的結(jié)構(gòu)表征

1.3.2.1 傅里葉變換紅外光譜分析

采用全反射法對(duì)樣品進(jìn)行掃描光譜測(cè)定，掃描范圍4 000～500 cm-1。

1.3.2.2 X射線衍射分析

掃描范圍5°～90°，電壓40 kV，掃描速率5 °/min。

1.3.3 添加不同指示劑薄膜相關(guān)性能的測(cè)定

1.3.3.1 薄膜厚度及機(jī)械性能

使用精度為0.001 mm的厚度儀在薄膜上隨機(jī)取5個(gè)點(diǎn)測(cè)定其厚度。根據(jù)GB/T 1040.3—2006《塑料 拉伸性能的測(cè)定 第3部分：薄膜和薄片的試驗(yàn)條件》，將薄膜裁成150 mm×10 mm的長(zhǎng)條狀。參數(shù)設(shè)定：初始夾距40 mm，拉伸速率10 mm/min。分別按照式（1）、（2）計(jì)算拉伸強(qiáng)度和斷裂伸長(zhǎng)率。

式中：F為拉伸過(guò)程最大力/N；S為有效受力面積/mm2；L1為斷裂時(shí)膜長(zhǎng)度/mm；L0為初始膜長(zhǎng)度/mm。

1.3.3.2 光學(xué)性能

將薄膜裁成50 mm×50 mm，根據(jù)GB 2410—2008《透明塑料透光率和霧度的測(cè)定》，將樣品放入霧度測(cè)定儀接收器出射窗口處進(jìn)行測(cè)定。

1.3.3.3 NH3顯色靈敏性

分別配制NH3質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%、6%、10%、20%、25%的氨水，對(duì)照組為蒸餾水，將待測(cè)薄膜裁成1 cm×1 cm的正方形樣品，將其排列分布于聚氯乙烯薄膜。用聚氯乙烯薄膜將培養(yǎng)皿覆蓋完全（樣品置于聚氯乙烯薄膜中心位置）。利用氨水的揮發(fā)性，觀察薄膜的顏色變化并在標(biāo)準(zhǔn)光源下拍照。利用色差儀進(jìn)行顏色指標(biāo)采集。按照公式（3）計(jì)算色差值（ΔE）。

式中：L*、a*、b*和分別代表前后兩次測(cè)定的亮度、紅度和黃度。

1.3.4 添加抑菌劑薄膜相關(guān)性能的測(cè)定

1.3.4.1 含水率以及水蒸氣透過(guò)率

將55 mm×55 mm的指示膜用電子天平進(jìn)行稱質(zhì)量并記為m1/g，置于100 ℃鼓風(fēng)干燥箱中烘干至恒質(zhì)量后取出試樣，稱質(zhì)量記為m2/g。按照式（4）計(jì)算薄膜含水率。

取適量蒸餾水倒入50 mL燒杯中，杯口用薄膜包裹并用膠帶圈纏繞防止漏氣，放入22 ℃恒溫干燥箱中。每隔2 h稱質(zhì)量，稱量5 次。按照公式（5）計(jì)算水蒸氣透過(guò)率。每種薄膜作3 組平行，結(jié)果取平均值。

式中：x為膜厚度/mm；S為有效面積（18.08×10-4m2）；Δm為水分透過(guò)的質(zhì)量/g；t為間隔時(shí)間/s；ΔP為膜兩邊的壓強(qiáng)差（3 179 Pa（22 ℃））。

1.3.4.2 耐水性

溶脹率：將樣品裁剪成55 mm×55 mm的方形，放置于100 ℃鼓風(fēng)干燥機(jī)中干燥至質(zhì)量恒定，稱量后放入室溫蒸餾水中浸泡24 h。取出樣品迅速吸干表面水分稱質(zhì)量。每種薄膜作3 組平行，結(jié)果取平均值。按式（6）計(jì)算溶脹率。

式中：m為薄膜浸泡后的溶脹質(zhì)量/g；m0為薄膜烘干后的初始質(zhì)量/g。

溶解質(zhì)量損失率：將溶脹率測(cè)試中吸水溶脹的薄膜置于100 ℃鼓風(fēng)烘箱中干燥至質(zhì)量恒定，取出后迅速精確稱量薄膜質(zhì)量，每種薄膜3個(gè)平行。溶解質(zhì)量損失率按式（7）計(jì)算。

式中：m2為水溶性物質(zhì)去除前薄膜質(zhì)量/g；m1為水溶性物質(zhì)去除后薄膜質(zhì)量/g。

1.3.4.3 抗氧化性

參照陳晨偉等[21]的方法并稍作修改，將0.1 g樣品剪碎放入50 mL蒸餾水中，95 ℃磁力攪拌器攪拌1 h。取1 mL膜樣浸出液，加入3 mL 75 μmol/L 2,2-二苯基-1-苦基肼（2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH）溶液，避光處理30 min后利用紫外分光光度計(jì)于517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定混合溶液的吸光度。無(wú)水乙醇作為空白組，按公式（8）計(jì)算DPPH自由基清除率。

式中：A1為待測(cè)薄膜樣品膜液和自由基溶液的吸光度；A2為無(wú)水乙醇和自由基溶液的吸光度；A3為無(wú)水乙醇和待測(cè)薄膜樣品膜液的吸光度。

1.3.5 抑菌性

采用抑菌圈法對(duì)薄膜進(jìn)行抑菌性測(cè)試。參照汪志強(qiáng)[21]的方法并稍作修改，選用大腸桿菌和金黃色葡萄球菌作為實(shí)驗(yàn)用菌，先用打孔器制備直徑6 mm的薄膜圓片并紫外滅菌2 h，再取400 μL活化后濃度為1×105CFU/mL的大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌混合菌液均勻分布于固體培養(yǎng)基表面，然后再用滅菌后的鑷子將薄膜圓片置于培養(yǎng)皿中心位置，在37 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，測(cè)量抑菌圈直徑。

1.3.6 抑菌指示膜在冷鮮肉中的應(yīng)用實(shí)驗(yàn)

將冷鮮豬肉在無(wú)菌環(huán)境下切成若干份，?。?0±1） g豬肉放入錐形瓶中，瓶口用抑菌指示膜覆蓋，用保鮮膜加皮筋將四周封緊，于4 ℃冰箱貯存10 d，每2 d測(cè)定相關(guān)指標(biāo)。菌落總數(shù)：參照GB 4789.2—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》；總揮發(fā)性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量：參照GB 5009.228—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中揮發(fā)性鹽基氮的測(cè)定》；pH值：稱取5 g樣品切碎，加入45 mL蒸餾水，破碎勻漿2 min后靜置15 min，用pH計(jì)進(jìn)行測(cè)定。貯藏期間記錄抑菌指示膜的顏色變化。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

使用Origin 9.5軟件繪圖。采用SPSS軟件分析統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析以檢測(cè)數(shù)據(jù)的顯著性，采用Duncan多范圍測(cè)試比較參數(shù)之間的顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 指示劑對(duì)PVA-CS/MMT-TP薄膜結(jié)構(gòu)的影響

2.1.1 添加不同指示劑PVA-CS/MMT-TP薄膜的傅里葉變換紅外光譜

由圖1可知，薄膜均出現(xiàn)了相似的特征吸收峰，說(shuō)明指示劑添加后薄膜結(jié)構(gòu)組分之間未發(fā)生化學(xué)作用。MMT中含有Al2O3、MgO、SiO2，在1 041、701 cm-1處的振動(dòng)峰分別對(duì)應(yīng)Si—O、Mg—Fe—OH，這說(shuō)明薄膜中均存在MMT，這與趙菲[23]的結(jié)果類似。3 292 cm-1處為PVA分子—OH伸縮振動(dòng)的吸收峰[24]，峰形較寬是由于膜中PVA與CS濃度太大，發(fā)生締合作用，形成氫鍵，這也使得PVA-CS共混膜具有良好的成膜性能、力學(xué)性能和氧氣阻隔性能[25]。在1 555 cm-1處為C＝C雙鍵伸縮振動(dòng)，2 906 cm-1處為飽和碳原子上C—H弱吸收振動(dòng)峰，1 395 cm-1處為甲基基團(tuán)的對(duì)稱彎曲振動(dòng)特征峰，這可能是CS與TP通過(guò)接枝共聚形成了共價(jià)鍵，或各組分之間發(fā)生氫鍵等相互作用[26]。在1 200 cm-1附近沒(méi)有出現(xiàn)吸收峰，表明不存在酚類，可能是因?yàn)門P被很好地負(fù)載在MMT上。

圖1 添加不同指示劑薄膜的傅里葉變換紅外光譜Fig. 1 Infrared spectra of films with different indicators

2.1.2 添加不同指示劑的PVA-CS/MMT-TP薄膜的X射線衍射分析結(jié)果

由圖2可知，Y1在2θ20.3°處出現(xiàn)較弱衍射吸收峰，而研究表明PVA和CS的X射線衍射峰并不重合，這說(shuō)明PVA和CS之間發(fā)生了強(qiáng)烈的氫鍵結(jié)合，并且PVA與CS混合一定程度降低了PVA的結(jié)晶度[27]。若共混膜中的指示劑與其他組分分子間未發(fā)生或僅有微弱的相互作用，那么共混膜的衍射峰為各組分結(jié)晶峰的簡(jiǎn)單疊加，而本實(shí)驗(yàn)中加入指示劑的薄膜在2θ19.8°處出現(xiàn)了較強(qiáng)衍射峰，這表明指示劑與各組分發(fā)生了強(qiáng)烈的分子間相互作用（范德華力和氫鍵），形成了新的交聯(lián)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，從而增強(qiáng)了共混膜的結(jié)晶度[28]。2θ6.18°處出現(xiàn)衍射峰，這可能是酸化后MMT硅酸鹽層狀結(jié)構(gòu)的形態(tài)和層間距有所擴(kuò)張，TP嵌入到MMT黏層間[29-30]。

圖2 不同指示劑薄膜的X射線衍射圖Fig. 2 X-ray diffraction spectra of different indicator films

2.2 指示劑對(duì)PVA-CS/MMT-TP薄膜理化性能的影響

2.2.1 添加不同指示劑PVA-CS/MMT-TP薄膜的厚度及機(jī)械性能

由表1可知，與Y1相比，加入指示劑后薄膜的厚度、拉伸強(qiáng)度和斷裂伸長(zhǎng)率均顯著增大（P＜0.05）。膜厚度與成膜物質(zhì)密切相關(guān)，會(huì)直接影響薄膜的機(jī)械性能[31]。拉伸強(qiáng)度的增大可能是指示劑的加入使薄膜組分間相容性更好，促進(jìn)分子間作用力形成更加緊密的氫鍵網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。其中X4的拉伸強(qiáng)度（（56.91±2.16）MPa）最大，相較于Y1提升了13.55%。斷裂伸長(zhǎng)率反映了材料的柔軟性[32]，指示劑的加入降低了薄膜的斷裂伸長(zhǎng)率，X5的斷裂伸長(zhǎng)率相較于Y1降低了33.29%，這可能是指示劑與膜基質(zhì)溶液充分溶合，分子間結(jié)構(gòu)更緊密，使薄膜脆性增加、柔性下降。不同指示劑薄膜中X4斷裂伸長(zhǎng)率（（36.4±1.23）%）最大。

表1 添加不同指示劑薄膜的厚度和機(jī)械性能Table 1 Effect of addition of different indicators on the thickness and mechanical properties of the film

2.2.2 添加不同指示劑PVA-CS/MMT-TP薄膜的光學(xué)性能

透光率可用于反映復(fù)合膜體系內(nèi)各成分的相容性，透光率越小、霧度越高，光阻隔性能越強(qiáng)，良好的光阻隔性能可一定程度保護(hù)食品免受光照干擾[33]。由圖3可知，空白組Y1的透光率最高，為81.84%，X1的透光率最低，為53.74%，且隨著B(niǎo)CP、MR復(fù)配指示劑中BCP添加量的增加，透光率逐漸降低，霧度相應(yīng)逐漸增加?？瞻捉M薄膜霧度為13.48%，X1霧度最高，為36.52%，相比空白組增加了23.04%。這是由于BCP、MR指示劑本身具有較深的色澤，且BCP較MR顏色更深，因此隨著復(fù)配指示劑中BCP含量的增加，透光率明顯下降，提升了對(duì)光的阻隔性能[34]。這與馮永莉等[35]的研究結(jié)果一致，指示劑的添加明顯改變了指示膜的透光性，顯著提高了指示膜對(duì)紫外光的阻隔性能。

圖3 添加不同指示劑薄膜的透光率和霧度Fig. 3 Transmittance and haze of films with different indicators

2.2.3 添加不同指示劑PVA-CS/MMT-TP薄膜的NH3響應(yīng)性

由圖4可知，隨著NH3質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，空白組薄膜顏色幾乎未發(fā)生變化；而薄膜X1顏色變化表現(xiàn)為深紫-紫-紫紅；X2表現(xiàn)為黃-淡黃，變化不明顯；X3表現(xiàn)為深紫-紫藍(lán)；X4表現(xiàn)為深紫-紫藍(lán)-淡紫；X5表現(xiàn)為深紫-紫-紫紅。以上結(jié)果可以表明，指示膜對(duì)不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)NH3具有響應(yīng)性。李寧[36]也有類似研究，以麥?zhǔn)纤峄罨倪秽推咸哑せㄇ嗨刈鳛槿忸愋迈r度指示劑，制備的復(fù)合膜對(duì)NH3具有響應(yīng)性，并可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)豬肉的新鮮度。

圖4 指示劑薄膜對(duì)不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)NH3的響應(yīng)性Fig. 4 Responsiveness of indicator films to different concentrations of NH3

由圖5可知，NH3質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%時(shí)，X4的ΔE最大，為11.653 0，隨NH3質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，X4的ΔE整體呈上升趨勢(shì)，在NH3質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%時(shí)ΔE為27.946 0，顏色變化明顯。X1和X5的ΔE整體均呈先上升后下降趨勢(shì)，兩種薄膜的ΔE均在NH3質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%時(shí)達(dá)到最大，分別為27.183 9和23.122 3；X2和X3均在NH3質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%時(shí)，ΔE明顯增大，但隨NH3質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，薄膜顏色變化不明顯，這也解釋了這兩種指示薄膜只有兩種顯色的原因。無(wú)指示劑的Y1 ΔE幾乎無(wú)變化，這與顏色變化結(jié)果一致。以上結(jié)果表明，指示膜的顏色變化對(duì)揮發(fā)出的堿性氣體具有積極響應(yīng)，指示膜用于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)食品新鮮度具有潛在可行性。杜月紅等[37]以甲基纖維素和聚乙二醇-6000為基材，添加溴甲酚紫、溴百里酚藍(lán)等酸堿指示劑制備指示標(biāo)簽，隨著NH3質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，6種標(biāo)簽顏色均發(fā)生顯著變化，具有NH3響應(yīng)性，可用于冷鮮肉的新鮮度指示。

圖5 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)NH3環(huán)境中指示薄膜ΔE的變化Fig. 5 Changes in ΔE of indicator films in response to different concentrations of NH3

2.3 MMT-TP對(duì)PVA-CS基智能膜理化性能的影響

2.3.1 添加MMT-TP PVA-CS基智能膜的含水率及水蒸氣阻隔性能

由圖6可知，未添加MMT負(fù)載TP的指示膜Y2含水率高達(dá)10.28%，而其他薄膜為6%～9%。這是由于PVA中存在大量羥基，MMT負(fù)載TP作用于PVA后形成了氫鍵，使水分子不易進(jìn)入分子內(nèi)部，提高了薄膜的疏水性[38]。X3的水蒸氣透過(guò)率最?。?.201 0×10-11g/（m·s·Pa）），相較于空白組（5.939 6×10-11g/（m·s·Pa））降低了62.92%。這說(shuō)明MMT負(fù)載TP的加入提高了薄膜的水蒸氣阻隔性，這是因?yàn)镸MT負(fù)載TP均勻分散在薄膜中，與各組分的分子間作用力增強(qiáng)，限制了基體分子的運(yùn)動(dòng)，從而使水蒸氣的通過(guò)受到更大阻礙，減少了水蒸氣透過(guò)量[39]。

圖6 薄膜的含水率與水蒸氣透過(guò)率Fig. 6 Film moisture contents and water vapor transmission coefficients

2.3.2 添加MMT-TP PVA-CS基智能膜的耐水性

由圖7可知，空白組薄膜的溶脹率和溶解質(zhì)量損失率均最高，分別為458.68%和85.71%。而5種抑菌指示膜的溶脹率和溶解質(zhì)量損失率均較?。贿@可能是因?yàn)镸MT負(fù)載TP的添加使薄膜分子間結(jié)合得更加緊密，減少了膜內(nèi)游離羥基的數(shù)量，這與甘文樂(lè)等[19]的研究結(jié)果一致，其研究發(fā)現(xiàn)納米MMT負(fù)載的TP有效地改善了PVA薄膜的耐水性。TP中含有疏水性苯環(huán)基團(tuán)，增強(qiáng)了薄膜的疏水性，在混合過(guò)程中TP與PVA分子間形成氫鍵，減少了膜內(nèi)游離分子，限制了水分子與PVA分子中羥基的結(jié)合[40]。Wang Yining等[41]采用超聲輔助法制備具有良好阻濕性和抗氧化性能的活性PVA-半纖維素/TP薄膜，TP的大量疏水苯環(huán)結(jié)構(gòu)為膜材料提供了屏障，PVA-半纖維素/TP薄膜具有較低的水蒸氣透過(guò)率。

圖7 薄膜的溶脹率和溶解質(zhì)量損失率Fig. 7 Swelling rates and dissolution loss rates of films

2.3.3 添加MMT-TP PVA-CS基智能膜的抗氧化活性

由圖8可知，空白組Y2薄膜的DPPH自由基清除率為21.13%。成膜基液中的天然CS具有良好的抗氧化作用。與Y2相比，添加MMT負(fù)載TP的5種薄膜的DPPH自由基清除率明顯上升，其中X4最高，為54.31%。這是由于水分子進(jìn)入薄膜后，TP被釋放并發(fā)揮DPPH自由基清除作用，提高了薄膜的抗氧化活性[42]。Zhang Die等[43]用靜電紡絲法制備多功能淀粉/TP納米纖維膜，研究發(fā)現(xiàn)TP賦予薄膜抗氧化活性。Lan Xingzi等[44]采用同軸靜電紡絲技術(shù)制備芯層負(fù)載抗氧化TP和殼層負(fù)載抗菌ε-聚賴氨酸的同軸納米纖維膜，發(fā)現(xiàn)薄膜抗氧化活性隨著TP含量的增加和在DPPH-乙醇溶液中孵育時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)。

圖8 薄膜的DPPH自由基清除率Fig. 8 DPPH radical scavenging effect of films

2.3.4 添加MMT-TP PVA-CS基智能膜的抑菌性

由圖9可知，空白組Y2抑菌圈微小，直徑約為8 mm。這是因?yàn)槌赡せ褐刑砑恿薈S，CS對(duì)細(xì)菌和霉菌均具有抑菌性。郭浩麒等[45]制備的含CS的綠色抗菌膜對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均具有抑菌性，且隨CS添加量的增加，抑菌性增強(qiáng)。添加MMT負(fù)載TP的薄膜抑菌圈直徑為12～14 mm，與Y2相比，抑菌性更強(qiáng)。這可能是由于MMT負(fù)載TP改變了培養(yǎng)基的pH值，破壞了菌種生長(zhǎng)繁殖的適宜環(huán)境[46]；也可能是因?yàn)镸MT負(fù)載的TP與細(xì)菌細(xì)胞膜結(jié)合，影響了細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成，破壞了細(xì)胞膜，從而抑制細(xì)菌繁殖[47]。Pan Ziqiang等[48]研究發(fā)現(xiàn)TP處理可以抑制魚片中細(xì)菌增長(zhǎng)，降低魚片的TVB-N含量，將魚片貨架期延長(zhǎng)6 d。Y2薄膜略有卷曲，這是因?yàn)镻VA富含大量游離羥基的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)易造成薄膜耐水性能較差，當(dāng)薄膜與固體培養(yǎng)基表面的菌液貼合時(shí)，水分子進(jìn)入薄膜并與PVA中的羥基結(jié)合，從而出現(xiàn)卷曲現(xiàn)象。此外，Y2還表現(xiàn)出潤(rùn)漲的現(xiàn)象，這是因?yàn)镻VA分子鏈中的羥基與水分子接觸時(shí)會(huì)吸水膨脹。但X1～X5薄膜未出現(xiàn)明顯的卷曲和潤(rùn)脹現(xiàn)象，這是因?yàn)镸MT負(fù)載TP減少膜內(nèi)游離分子，限制了水分子與PVA分子中羥基的結(jié)合，使薄膜的耐水性增強(qiáng)，這與2.3.2節(jié)結(jié)果一致。

圖9 薄膜的抑菌圈Fig. 9 Zones of inhibition against bacterial strains

2.4 抑菌指示膜在冷鮮肉中的應(yīng)用

如圖10A所示，貯藏初始冷鮮肉的菌落總數(shù)為3.34（lg（CFU/g）），且隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)；貯藏10 d時(shí)Y2組菌落總數(shù)為6.27（lg（CFU/g）），超出可食用標(biāo)準(zhǔn)（≤6（lg（CFU/g））），表明此時(shí)冷鮮肉已變質(zhì)。與Y2組相比，X1～X5組的菌落總數(shù)上升較緩慢，貯藏10 d時(shí)僅X5組菌落總數(shù)超出可食用標(biāo)準(zhǔn)，為6.013（lg（CFU/g））。如圖10B所示，冷鮮肉的初始TVB-N含量為（6.22±0.67）mg/100 g，貯藏8 d時(shí)Y2組的TVB-N含量為（20.22±0.68）mg/100 g，這表明冷鮮肉已腐?。ā?0 mg/100 g），而X1～X5組在貯藏10 d時(shí)僅X2組的TVB-N含量（（20.22±0.68）mg/100 g）超出限值。如圖10C所示，冷鮮肉在貯藏期間pH值均呈上升趨勢(shì)，初始pH值為5.96，貯藏8 d時(shí)Y2組pH值為6.65，此時(shí)豬肉臨近腐?。╬H＞6.7），在貯藏10 d時(shí)Y2組pH值為6.81，已完全不能食用，而X1～X5組均低于Y2組，主要原因可能是TP破壞了菌株生長(zhǎng)繁殖的適宜環(huán)境，影響了細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成，從而延緩了冷鮮肉的腐敗。綜上，抑菌指示膜對(duì)冷鮮肉具有保鮮作用，相較于未添加抑菌劑的空白對(duì)照組，可以延長(zhǎng)冷鮮肉貨架期1～2 d。

圖10 冷鮮肉4 ℃貯藏期間的鮮度指標(biāo)變化Fig. 10 Changes in freshness index of chilled pork during4 ℃ storage

圖11 抑菌指示膜在冷鮮肉貯藏期間的指示效果Fig. 11 Results of antibacterial indicator films for chilled pork at different storage times

根據(jù)豬肉的鮮度標(biāo)準(zhǔn)[49]，將菌落總數(shù)、TVB-N含量和pH值這3個(gè)化學(xué)指標(biāo)結(jié)合，可更全面準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)豬肉新鮮度。將X1～X5組冷鮮肉劃分為3個(gè)等級(jí)：0～4 d，新鮮肉；6～8 d，次鮮肉；10 d，腐敗肉。Y2組冷鮮肉劃分為3個(gè)等級(jí)：0～2 d，新鮮肉；4～6 d，次鮮肉；8～10 d，腐敗肉。如圖11所示，抑菌指示膜在冷鮮肉貯藏期間的薄膜顏色均發(fā)生了變化。Y2在0～2 d為紫紅色，4～6 d 為紫藍(lán)色，8～10 d為紫黑色。X4在冷鮮肉貯藏期間顏色有明顯變化，0～4 d為紫紅色，6～8 d為紫藍(lán)色，10 d為紫黑色。Y2和X4的指示劑添加為同一配比（BCP與MR質(zhì)量比1.5∶1），Y2在4 d變?yōu)樽纤{(lán)色，8 d變?yōu)樽虾谏鳻4則是6 d變?yōu)樽纤{(lán)色，10 d時(shí)變?yōu)樽虾谏＿@是由于X4組的抑菌指示膜延長(zhǎng)了冷鮮肉貨架期1～2 d。其他薄膜不能提供冷鮮肉鮮度等級(jí)的可靠信息，如X1、X5在4～6 d顏色變化不明顯，而此時(shí)實(shí)驗(yàn)組冷鮮肉的品質(zhì)已從新鮮肉變?yōu)榇熙r肉；X2只有兩個(gè)色度變化，且6～10 d顏色無(wú)明顯變化，無(wú)法指示豬肉新鮮度；X3在8～10 d顏色變化不明顯，而此時(shí)實(shí)驗(yàn)組冷鮮肉已從次鮮肉變?yōu)楦瘮∪?。綜上可以發(fā)現(xiàn)，抑菌指示膜不僅可以延長(zhǎng)冷鮮肉貨架期1～2 d，而且可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)冷鮮肉的新鮮度。X4的顏色變化與冷鮮肉在相應(yīng)時(shí)間內(nèi)的新鮮度一致，能較好地指示冷鮮肉的新鮮程度，因此，可將添加BCP與MR質(zhì)量比1.5∶1的抑菌指示膜在冷鮮肉貯存過(guò)程中的顏色變化與新鮮度等級(jí)相關(guān)聯(lián)，即紫紅色為新鮮肉、紫藍(lán)色為次鮮肉、紫黑色為腐敗肉。

3 結(jié) 論

以PVA和CS為成膜基材，MMT負(fù)載TP為抑菌劑，BCP和MR及其復(fù)配為指示劑，制備抑菌指示膜。結(jié)構(gòu)表征表明，各組分之間只是簡(jiǎn)單的物理結(jié)合，通過(guò)氫鍵作用力形成致密的薄膜網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)；指示劑的添加增強(qiáng)了共混膜的結(jié)晶度，改善了薄膜的物理性能和光學(xué)性能；指示膜均能對(duì)氨氣響應(yīng)。其中BCP與MR質(zhì)量比1.5∶1薄膜具有最大的拉伸強(qiáng)度（（56.91±2.16）MPa）、斷裂伸長(zhǎng)率（（36.4±1.23）%），并且具有靈敏的氨氣響應(yīng)性（紫紅-紫藍(lán)-淡紫）；BCP薄膜透光率最低（53.74%）、霧度最高（36.52%）。將未添加抑菌劑的PVA/CS復(fù)合膜（BCP與MR質(zhì)量比1.5∶1）作為對(duì)照組用于研究抑菌劑對(duì)于薄膜相關(guān)性能影響，發(fā)現(xiàn)添加抑菌劑能夠改善薄膜的耐水性、抗氧化性，且具有良好的抑菌性能。將抑菌指示膜應(yīng)用于冷鮮肉的保鮮及新鮮度指示，結(jié)果表明，抑菌指示膜相較于空白組可延長(zhǎng)冷鮮肉貨架期1～2 d；而且BCP與MR質(zhì)量比1.5∶1薄膜的顏色變化與冷鮮肉新鮮度等級(jí)相一致，即紫紅色為新鮮肉、紫藍(lán)色為次鮮肉、紫黑為變質(zhì)肉。制備的抑菌指示膜不僅具有抑菌保鮮的功能，還可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)冷鮮肉新鮮度，具有應(yīng)用潛力。今后研究可從薄膜的安全性展開(kāi)，驗(yàn)證其應(yīng)用的可行性。