馬洪峰,任慶,鄭末,程萬民,廉梅
天津市第五中心醫(yī)院(北京大學(xué)濱海醫(yī)院)1.耳鼻咽喉科,2.病理科,天津 300450
耳道皮膚缺損常發(fā)生于顳骨及其軟骨組織的外科手術(shù)后,創(chuàng)面上皮自我修復(fù)緩慢,致使患耳溢液難以清除,需定期清理痂皮[1]。由于耳道結(jié)構(gòu)以及耳腔的空間有限,加上飲食等因素影響,耳道皮膚缺損可能給患者帶來不容忽視的聽力障礙,影響患者的術(shù)后生活質(zhì)量[2]。因此,國內(nèi)外學(xué)者致力于尋找適合外耳道皮膚重建、乳突腔修復(fù)的生物學(xué)材料,不斷加深對術(shù)腔上皮化機(jī)制的認(rèn)知[3]。組織工程技術(shù)的日新月異推動支持顳骨上皮皮膚結(jié)構(gòu)與功能恢復(fù)的生物材料的發(fā)展。來源廣泛、具有較強(qiáng)分化和增殖潛能的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)成為組織工程學(xué)、再生醫(yī)學(xué)學(xué)科中最具前景的種子細(xì)胞之一。研究表明ADSCs 分泌的蛋白因子直接促進(jìn)創(chuàng)面組織的再生和愈合;ADSCs 在異體組織移植中可降低異體宿主的免疫排斥反應(yīng),縮短治療時間[4~6]。細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)支架因其具有穩(wěn)定的機(jī)械張力,便于手術(shù)操作,降解過程的可控性,以及無毒性和免疫原性等優(yōu)點[7],成為組織工程支架中廣泛應(yīng)用的材料。研究顯示ECM 支架能夠促進(jìn)細(xì)胞分化、增殖,促進(jìn)血管新生及創(chuàng)面愈合[8]。已經(jīng)證實ECM 支架能模擬體內(nèi)微環(huán)境,抑制細(xì)菌滋生,調(diào)節(jié)、引導(dǎo)宿主細(xì)胞長入,推動創(chuàng)面組織重構(gòu),縮短組織再生及皮膚缺損修復(fù)的時間[9]。本文探討脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞聚合物(adipose-derived stem cell aggregates,ADSC aggregates)-細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)復(fù)合物補(bǔ)片(ADSC aggregates-ECM)在外耳道全層皮膚損傷修復(fù)中的應(yīng)用,期為臨床治療提供新的角度。
1.1.1 實驗動物 4~5 月齡SPF 級健康雄性新西蘭大白兔30 只,體重2.25~2.35 kg,來源于天津裕達(dá)實驗動物繁育有限公司[SCXK(津)2016-0001],飼養(yǎng)于天津國際生物醫(yī)藥聯(lián)合研究院[SYXK(津)2017-0003],標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料、自由飲水適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后用于實驗。實驗經(jīng)本院實驗動物管理倫理委員會批準(zhǔn)(IACUC-2020-028),操作均參照本院動物管理委員會有關(guān)規(guī)定進(jìn)行,在3R 原則的指導(dǎo)下給與動物人道的關(guān)懷。
1.1.2 主要試劑與儀器 ADSC aggregates-ECM(批號TJ-ARN004)、ECM 支架(批號TJ-TBF057)由天津再生醫(yī)學(xué)與疾病生物治療研究中心設(shè)計完成;免疫組化試劑盒(批號GTY-2018-UY763,美國Gibco 公司);兔抗大鼠GAPDH(批號VCS-2019-FA095,美國abcam 公司);HE 試劑盒(批號RX-2019-EV7D08,美國Sigma公司);Western blot 試劑盒(批號JS-2020-MR97,南京建成生物有限公司)。凝膠成像儀(UV-D6.0,島津公司,日本);組織切片機(jī)(PVT-6.8,SHELLAB 公司,美國);熒光顯微鏡(LIOOS600T,尼康公司,日本);高速低溫離心機(jī)(FUB-98A,北京六一儀器廠,中國)。
1.2.1 外耳道內(nèi)壁全層皮膚缺損模型構(gòu)建[10]新西蘭大白兔耳腹側(cè)耳根處備皮,碘伏消毒,切開外耳道皮膚、肌肉以及彈性軟骨,暴露外耳道內(nèi)壁皮膚,Miltex活檢打孔器鉆開直徑為2 cm 的創(chuàng)面缺損,每只動物構(gòu)建1 個創(chuàng)面。
1.2.2 分組處理 將兔隨機(jī)分為3 組,空白組、對照組、實驗組,每組10 只,進(jìn)行處理前,先在實驗動物的創(chuàng)面正下方的外耳道墊以無菌明膠海綿,保持明膠海綿的邊緣與創(chuàng)面邊緣相平,對照組動物通過內(nèi)植法將ECM 支架鋪于明膠海綿與創(chuàng)面邊緣之間,實驗組則將ADSC aggregates-ECM 支架鋪于明膠海綿與創(chuàng)面邊緣之間,確保支架完全覆蓋創(chuàng)面??瞻捉M不做處理。以自由飲水,標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料單籠飼養(yǎng)各組實驗動物。
1.2.3 創(chuàng)面愈合觀察 術(shù)后14 d 使用數(shù)碼相機(jī)拍照,裸眼觀察各組創(chuàng)面組織的愈合情況:創(chuàng)面顏色、有無滲出、新生上皮覆蓋等。圖像分析軟件HVviewing8.0統(tǒng)計各組的創(chuàng)面愈合率。創(chuàng)面愈合率[11]=[(造模創(chuàng)面面積-未愈合創(chuàng)面面積)/造模創(chuàng)面面積]×100%。
1.2.4 創(chuàng)面組織形態(tài)學(xué)改變 14 d 后從各組實驗動物的創(chuàng)面組織中心取創(chuàng)面范圍內(nèi)的表層皮膚,常規(guī)方法采集創(chuàng)面組織,迅速轉(zhuǎn)至-80℃深冷冰箱中獨立保存待測。將創(chuàng)面組織用5%甲醛固定,常規(guī)制片,HE、Masson 染色,二甲苯處理,切片透明后,使用顯微鏡觀察創(chuàng)面組織的形態(tài)學(xué)變化:膠原蛋白及上皮組織再生、炎癥細(xì)胞浸潤等情況。
1.2.5 創(chuàng)面組織細(xì)菌菌落陽性比例比較 取創(chuàng)面組織,解剖剪剪成微小顆粒,攪拌勻漿后,稀釋至1 000倍,取1 mg 稀釋液接種于Mueller-Hinton agar 培養(yǎng)基,37 ℃,5% CO2生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h,室溫靜置24 h,顯微鏡下觀察,統(tǒng)計培養(yǎng)基上的菌落數(shù),并換算成每克樣品中細(xì)菌菌落數(shù)(colony forming units/gram,cfu/g),cfu/g≥105為陽性結(jié)果,cfu/g<105為陰性結(jié)果[12]。
1.2.6 免疫組化檢測創(chuàng)面組織中細(xì)胞核增殖抗原(proliferating cell nuclear antigen,Ki67)表達(dá) 創(chuàng)面組織用10%聚甲醛固定2 h,脫水,透明,浸蠟后切片,以枸櫞酸鈉緩沖液進(jìn)行高溫抗原修復(fù)后,雙氧水封閉,PBS 沖洗后,加入一抗(1:500),4℃孵育過夜,次日加入二抗(1:2 000),二氨基聯(lián)苯胺(DAB)染色,蘇木素染核,清洗、脫水,二甲苯透明,中性樹脂封片,顯微鏡下觀察,目的蛋白在胞質(zhì)中呈棕褐色[13]。
1.2.7 免疫印跡實驗(Western blot)檢測創(chuàng)面組織中炎性因子白細(xì)胞介素1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)表達(dá) 取創(chuàng)面組織,常規(guī)裂解、勻漿、離心后,測定蛋白濃度,電泳分離,轉(zhuǎn)模、封閉,滴加一抗(均為1:500),4℃孵育過夜,次日清洗后加入二抗(均為1:1 000),顯色,凝膠成像儀下讀取各條帶灰度值,以GAPDH 為內(nèi)參,計算目的蛋白相對表達(dá)水平。
本研究數(shù)據(jù)分析采用SPSS 16.0,作圖工具采用Graphpad 5.01,以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示符合正態(tài)分布的計量資料,多組間比較采用單因素分析,兩兩比較采用t檢驗;計數(shù)資料以百分比(%)表示,組間比較采用χ2檢驗,P<0.05 表示具有統(tǒng)計學(xué)意義。
如圖1 所示,術(shù)后14 d 實驗動物創(chuàng)面均有不同程度的愈合,但實驗組創(chuàng)面愈合的程度明顯好于對照組、空白組。與空白組相比,實驗組、對照組動物的創(chuàng)面愈合率明顯升高(P<0.05),與對照組相比,實驗組動物的創(chuàng)面愈合率明顯升高(P<0.05)。
圖1 兔外耳道內(nèi)壁皮膚創(chuàng)面大體觀察以及創(chuàng)面愈合率比較A:空白組B:對照組C:實驗組* P<0.05,與空白組相比 #P<0.05,與對照組相比Fig.1 General observation of wounds in each group and the comparison of wound healing rate of external auditory canal in rabittsA: Blank group; B: Control group; C: Experimental groupCompared with the blank group,*P<0.05;Compared with the control group,#P<0.05
HE 染色結(jié)果顯示,空白組創(chuàng)面的皮膚組織層次較為單一,雖有大量的血管新生,炎性細(xì)胞填充較多,但未見明顯的復(fù)層結(jié)構(gòu);對照組創(chuàng)面新生血管的數(shù)量明顯增多,皮膚的復(fù)層結(jié)構(gòu)已開始出現(xiàn),創(chuàng)面與正常組織間的交界分明,皮膚細(xì)胞的層數(shù)較少;實驗組的創(chuàng)面組織與正常組織的交界模糊,兩者相互延續(xù),基底細(xì)胞的數(shù)量和形態(tài)比較正常,炎性細(xì)胞浸潤程度明顯好轉(zhuǎn),并可見較為明顯的類似真皮層的結(jié)構(gòu),見圖2。
圖2 創(chuàng)面皮膚HE 染色結(jié)果A:空白組 創(chuàng)面皮膚層次單一,炎性浸潤豐富B:對照組 創(chuàng)面新生血管數(shù)量增多,皮膚出現(xiàn)復(fù)層結(jié)構(gòu)C:實驗組 創(chuàng)面炎性浸潤明顯減少,皮膚分層趨于正常Fig.2 Result of wounds HE stainingA: Blank group,the wounds had a single skin layer and abundant inflammatory infiltration; B: Control group,the number of new blood vessels on the wounds increased,and the skin appeared multi-layered structure; C: Experimental group the inflammatory infiltrations of the wounds were significantly reduced,and the skin layering tended to be normal
Masson 染色結(jié)果顯示,空白組創(chuàng)面組織膠原沉積較少,膠原纖維排列松散;對照組創(chuàng)面組織膠原沉積明顯增多,但膠原纖維存在較為明顯的斷裂,排列較為稀疏;實驗組創(chuàng)面組織膠原沉積的量明顯較前兩組增多,且膠原纖維排列較為整齊,成簇狀的膠原纖維質(zhì)地較為緊密,部分創(chuàng)面已與正常組織交聯(lián)融匯一起,見圖3。
圖3 創(chuàng)面皮膚Masson 染色結(jié)果A:空白組創(chuàng)面組織膠原纖維排列松散B:對照組創(chuàng)面組織膠原纖維斷裂明顯,排列較稀疏C:實驗組創(chuàng)面組織膠原沉積的量明顯較前兩組增多,膠原纖維排列較整齊Fig.3 Result of wounds Masson stainingA: Blank group,the collagen fibers in the wound tissue were arranged loosely; B: Control group,the collagen fibers in the wound tissue were broken and arranged relatively sparsely; C: Experimental group,the amount of collagen deposition in the wound tissue was significantly higher than that of the first two groups,and the collagen fibers were arranged more neatly
與空白組相比,對照組、實驗組創(chuàng)面的細(xì)菌菌落計數(shù)≥105cfu/g,檢出率明顯降低(P<0.05),與對照組相比,實驗組創(chuàng)面的細(xì)菌菌落計數(shù)≥105cfu/g,檢出率明顯降低(P<0.05),見圖4。
圖4 各組創(chuàng)面組織細(xì)菌菌落陽性比例比較A:空白組 B:對照組 C:實驗組 *P<0.05,與空白組相比 #P<0.05,與對照組相比Fig.4 Comparison of the positive ratio of bacterial colonies in wound tissuesA: Blank group; B: Control group; C: Experimental groupCompared with the blank group,*P<0.05;Compared with the control group,#P<0.05
免疫組化結(jié)果顯示,與空白組相比,對照組、實驗組創(chuàng)面的Ki67 陽性細(xì)胞比例明顯升高(P<0.05),與對照組相比,實驗組Ki67 陽性細(xì)胞比例明顯升高(P<0.05),見圖5。
圖5 創(chuàng)面皮膚免疫組化染色結(jié)果及統(tǒng)計圖A:空白組B:對照組Ki67 陽性細(xì)胞比例明顯高于空白組C:實驗組Ki67 陽性細(xì)胞比例明顯高于對照組*P<0.05,與空白組相比 #P<0.05,與對照組相比Fig.5 Result of wounds immunohistochemical staining and statistical diagram A: Blank group; B: Control group,the proportion of Ki67-positive cells in the wounds was significantly higher than that of the blank group; C: Experimental group,the proportion of Ki67-positive cells in the was significantly higher than that of the control group Compared with the blank group *P<0.05.Compared with the control group,#P<0.05.
Western blot 結(jié)果顯示,與空白組相比,對照組、實驗組創(chuàng)面組織中IL-1β、TNF-α 的表達(dá)明顯下降(P<0.05);與對照組相比,實驗組創(chuàng)面組織中IL-1β、TNFα 的表達(dá)明顯下降(P<0.05),見圖6。
圖6 各組創(chuàng)面組織中IL-1β、TNF-α 表達(dá)條帶以及含量分析A:空白組B:對照組C:實驗組*P<0.05,與空白組相比 #P<0.05,與對照組相比Fig.6 Expression band and content analysis of IL-1β and TNF-α in wound tissues of each group A: Blank group; B: Control group; C: Experimental groupCompared with the blank group,*P<0.05;Compared with the control group,#P<0.05
通常耳部手術(shù)觸及顳骨或其軟骨組織,容易導(dǎo)致外耳道、乳突等骨面暴露,形成顳骨上皮缺損,患者該部位創(chuàng)面的自行愈合程度取決于顳骨裸露創(chuàng)面的上皮化水平,研究顯示耳道上皮的增殖及分化進(jìn)程較慢,加之術(shù)腔氣流量以及空氣中細(xì)菌感染的影響,此類患者往往需要進(jìn)行術(shù)腔重建,以加快創(chuàng)面愈合[14]。自體游離皮膚、生物陶瓷顆粒、自體骨質(zhì)碎屑以及局部帶蒂皮瓣等材料均被耳科學(xué)家用于臨床術(shù)腔上皮修復(fù)和乳突腔重建;盡管使部分患者獲得較好的恢復(fù),但由于感染、排斥反應(yīng)以及殘渣堆積,或者創(chuàng)面未能獲取足夠的血供等,不適宜在臨床推廣應(yīng)用[15]。組織工程是將工程學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生命科學(xué)、材料學(xué)的原理與技術(shù)相結(jié)合,建立具有生物活性的細(xì)胞-生物-材料的三維復(fù)合體,在盡量降低免疫原性的條件下將此復(fù)合體用于修復(fù)或促進(jìn)人體器官或組織損傷后功能和結(jié)構(gòu)生物替代物的綜合學(xué)科[16]。近年來組織工程技術(shù)被視為皮膚修復(fù)或再生的最有希望的途徑。李劍等[17]研究證實較為成熟的組織工程皮膚表皮膜片用于治療穩(wěn)定期的白癜風(fēng),療效顯著,安全性較好,值得臨床推廣。關(guān)于外耳道皮膚修復(fù)的組織工程尚在實驗室研究階段[18]。鑒于耳道以及人體顳骨上皮的結(jié)構(gòu)和功能的特殊性,組織工程學(xué)家曾將角質(zhì)細(xì)胞膜片、口腔粘膜非角化細(xì)胞膜片以及脫細(xì)胞真皮基質(zhì)等上皮細(xì)胞引入術(shù)腔上皮重建中,均顯示了明顯縮短上皮化時間,抗感染、干耳快、術(shù)后復(fù)發(fā)率低等優(yōu)點,取得良好的臨床療效[19]。但由于上皮細(xì)胞來源有限、培養(yǎng)難度較高,且上皮膜片質(zhì)地脆性偏高,致使轉(zhuǎn)移操作困難,創(chuàng)面成功率難以控制,迫使該技術(shù)尋找理化性能穩(wěn)定、促進(jìn)顳骨上皮皮膚結(jié)構(gòu)與功能恢復(fù)、便于細(xì)胞定植的上皮修復(fù)生物復(fù)合材料[20]。
選擇合適的種子細(xì)胞以及生物支架是耳部皮膚組織工程亟待解決的問題[21]。脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(ADSCs)可被誘導(dǎo)產(chǎn)生多向分化潛能,其來源豐富、體外擴(kuò)增技術(shù)成熟、免疫原性低,還具有促進(jìn)膠原蛋白分泌,促進(jìn)表皮細(xì)胞再生,促進(jìn)愈合等功能,使ADSCs 成為皮膚組織工程中最為優(yōu)秀的種子細(xì)胞[22]。Li 等[23]研究表明ADSCs 在促進(jìn)口腔皮膚創(chuàng)面愈合以及再生方面具有良好的療效和安全性。作為細(xì)胞支架,細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)能夠以細(xì)胞自身為內(nèi)源性支架,在保留細(xì)胞與細(xì)胞間連接的同時,將細(xì)胞均勻分散于細(xì)胞三維空間,細(xì)胞穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)免受機(jī)械損傷,更能保留細(xì)胞的生物學(xué)功能。同時作為天然、可降解的生物學(xué)材料,ECM 較強(qiáng)的可塑性,能夠保障將創(chuàng)面完全覆蓋,抑制炎性因子表達(dá)等多種優(yōu)勢。ECM 支架已在燒傷、器官重建以及整形美容中廣泛應(yīng)用[24]。但未見有將ADSCs 和ECM 用于耳部皮膚修復(fù)的研究報道。
本研究構(gòu)建兔外耳道內(nèi)壁全層皮膚缺損模型,實驗組以ADSC aggregates-ECM 平鋪創(chuàng)面進(jìn)行修復(fù),14 d 后,與空白組相比,實驗組的創(chuàng)面愈合率明顯較高,創(chuàng)面抗菌效果良好,創(chuàng)面組織病理良好,膠原蛋白成簇狀分布;免疫組化結(jié)果顯示實驗組創(chuàng)面組織中Ki67 的表達(dá)明顯增強(qiáng),上皮細(xì)胞的增殖能力明顯增強(qiáng)。Western blot 結(jié)果顯示實驗組創(chuàng)面組織中炎性因子的表達(dá)明顯下調(diào)。
綜上所述,脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞聚合物-細(xì)胞外基質(zhì)復(fù)合物補(bǔ)片能明顯促進(jìn)兔外耳道內(nèi)壁全層皮膚缺損的修復(fù),但如何將這種組織工程技術(shù)應(yīng)用于臨床,尚需深入研究其治療的穩(wěn)定性、療效的重復(fù)性。