基于激光光譜分析的一種水中硝酸鹽氮同位素比值測(cè)定新方法

袁紅朝，賀 珍，張麗萍，耿梅梅，陳 聞，許麗衛(wèi)，李春勇，彭 燦，王久榮

(中國(guó)科學(xué)院 亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)過程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410125)

氮是植物生長(zhǎng)不可缺少的營(yíng)養(yǎng)元素，同時(shí)也是溫室氣體N2O排放和水體富營(yíng)養(yǎng)化(N素)的來(lái)源[1-4]。我國(guó)部分地區(qū)已經(jīng)出現(xiàn)土壤氮飽和現(xiàn)象并超過了農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)的臨界負(fù)荷，而農(nóng)田土壤硝酸鹽的淋失被認(rèn)為是造成湖泊、河流以及地下水硝酸鹽污染的主要原因之一[5-6]。水體中硝酸鹽污染導(dǎo)致了嚴(yán)重的水生生態(tài)和人類健康問題，包括水體富營(yíng)養(yǎng)化、藻類瘋長(zhǎng)、魚蝦類缺氧死亡、含氮的溫室氣體排入環(huán)境、飲用水水質(zhì)惡化等環(huán)境問題，已經(jīng)被人們普遍關(guān)注。元素循環(huán)過程中同位素組成變化記錄了元素轉(zhuǎn)化過程與生物環(huán)境影響因子的綜合作用[7-8]，氮的同位素在特定的污染源中具有特定的組成，能夠相對(duì)準(zhǔn)確地反映污染物的遷移轉(zhuǎn)化機(jī)制[9-14]。因此，測(cè)定硝酸鹽的氮穩(wěn)定同位素組成可有效識(shí)別其主要來(lái)源，可作為水體環(huán)境硝酸鹽氮污染源的判定依據(jù)。

質(zhì)譜法是穩(wěn)定同位素分析中最通用、最精確的方法。水中硝酸鹽氮穩(wěn)定同位素比值測(cè)定一般包括以下兩個(gè)步驟：通過反硝化細(xì)菌法[15]或者化學(xué)方法[16-17]將水中微量硝酸鹽轉(zhuǎn)化為N2O氣體，然后用帶自動(dòng)預(yù)濃縮裝置的同位素比值質(zhì)譜儀測(cè)定N2O中的氮穩(wěn)定同位素比值。其中，細(xì)菌反硝化法存在一定的缺陷，實(shí)驗(yàn)所需的反硝化細(xì)菌需要專門培養(yǎng)，培養(yǎng)條件較高，整個(gè)反硝化過程中N2O氣體的收集與儲(chǔ)存對(duì)實(shí)驗(yàn)儀器和實(shí)驗(yàn)技能要求較高，因此，國(guó)內(nèi)應(yīng)用此方法的很少；相對(duì)于反硝化細(xì)菌法，化學(xué)轉(zhuǎn)化法對(duì)實(shí)驗(yàn)儀器和實(shí)驗(yàn)技能要求較低，應(yīng)用較為廣泛[17-19]，但仍存在多點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)曲線難于建立、轉(zhuǎn)化產(chǎn)生N2O氣體的質(zhì)量不便于在操作過程中監(jiān)控，需完成所有前處理步驟，上機(jī)測(cè)試后才能確定等問題。近幾年，隨著光腔衰蕩光譜(CRDS)[11-12]、離軸積分腔輸出光譜(OA-ICOS)[13]和傅里葉變換紅外光譜(FTIR)[14]等檢測(cè)技術(shù)的迅速發(fā)展，同位素光譜儀在土壤學(xué)、生態(tài)學(xué)、大氣科學(xué)等領(lǐng)域開始更廣泛的應(yīng)用。氧化亞氮同位素光譜分析儀是應(yīng)用激光吸收光譜技術(shù)的氮同位素分析儀，其測(cè)定過程不受目標(biāo)氣體中同分子量的CO2的影響，能同時(shí)測(cè)量δ15N、δ17O和δ18O，具有分析成本低，分析速度快等優(yōu)點(diǎn)。在土壤學(xué)或生態(tài)學(xué)研究中，應(yīng)用該分析系統(tǒng)通過同步分析N2O穩(wěn)定同位素(δ15N和δ18O)及N2O濃度和異構(gòu)體N2O的同位素組成，從而實(shí)現(xiàn)快速、直觀的反映生態(tài)系統(tǒng)中土壤N2O排放特征[20-22]。本文通過化學(xué)轉(zhuǎn)化法對(duì)不同來(lái)源的水中硝酸鹽進(jìn)行前處理，產(chǎn)生的N2O氣體導(dǎo)入氧化亞氮同位素光譜分析儀測(cè)定氮穩(wěn)定同位素比值，檢驗(yàn)了光譜法在線分析精密度。新建立的方法可為湖泊、河流以及地下水等水體中硝酸鹽氮穩(wěn)定同位素比值高效準(zhǔn)確測(cè)量提供方法參考，對(duì)促進(jìn)流域環(huán)境水體硝酸鹽污染源追蹤溯源、控制及修復(fù)治理方面意義重大。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與裝置

Picarro G5131-i(高精度氮氧同位素及氣體濃度分析儀)：美國(guó)Picarro公司。該儀器使用中紅外的光腔衰蕩光譜(CRDS)技術(shù)，具有時(shí)間測(cè)量的超高穩(wěn)定性和超過8 km光程等特性，可實(shí)現(xiàn)較高精度N2O氣體濃度和δ15N的檢測(cè)分析。儀器檢測(cè)濃度范圍為300～1 500 nmol/mol，N2O濃度精度<0.05 nmol/mol(1-σ，10 min均值)，δ15N精度<0.7‰(1-σ，300 s均值)。

氣體采集及進(jìn)樣裝置(作為前端，匹配Picarro G5131-i使用[23])主要由多個(gè)PLC控制模塊、多個(gè)獨(dú)立電磁閥、多個(gè)二通采氣閥組等組成。通過自動(dòng)控制軟件控制各種閥的啟動(dòng)及切換，實(shí)現(xiàn)多樣品在線采集和獨(dú)立分析測(cè)試，全過程均為自動(dòng)控制。

N2O發(fā)生前處理反應(yīng)瓶容積500 mL(蜀牛)，氣密性瓶蓋配備密封氣墊(Labco，用于注射器等)和采樣通道(用于電磁閥控制進(jìn)樣口)及平衡氣袋(Tedlar，用于平衡反應(yīng)瓶?jī)?nèi)部氣壓)，具體構(gòu)造見圖1。

1.2 主要材料與試劑

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)品 硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品：IAEA-硝酸鉀標(biāo)準(zhǔn)品(δ15NAirN2=4.7‰)，購(gòu)于IAEA國(guó)際原子能機(jī)構(gòu)；實(shí)驗(yàn)室硝酸鉀標(biāo)準(zhǔn)品(δ15NAirN2=-2.8‰)，購(gòu)于Sigma-Aldrich，純度≥99.9%，中國(guó)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所穩(wěn)定同位素實(shí)驗(yàn)室標(biāo)定。

圖1 N2O發(fā)生前處理反應(yīng)瓶構(gòu)造Fig.1 Structure of the N2O production bottom

硝酸鉀參比溶液：將兩種標(biāo)準(zhǔn)樣品均配制成10 μmol/mL的參比溶液。

N2O標(biāo)準(zhǔn)氣：購(gòu)于法國(guó)液空公司，貨號(hào)X03NI79C33AC005，濃度1 500 nmol/mol，δ15NAirN2=(2.2±0.3)‰。

N2O工作標(biāo)準(zhǔn)氣：委托國(guó)家計(jì)量科學(xué)研究院配制，濃度1 500 nmol/mol，中國(guó)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所穩(wěn)定同位素實(shí)驗(yàn)室標(biāo)定，δ15NAirN2=(-2.3±0.4)‰。

1.2.2前處理試劑 氨基磺酸溶液[c(NH2SO2H)=0.2 mol/L]；醋酸-醋酸鈉緩沖液[c(CH3COOH-NaC2H2O2)=1 mol/L]，pH=4.7。鎘粒還原劑：鍍銅鎘粒，北京鵬利馳科技有限公司。以上試劑和藥品為優(yōu)級(jí)純，除特別說明外，均購(gòu)置于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2.3待檢測(cè)水樣 JJ1～JJ3分別來(lái)自中國(guó)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所長(zhǎng)沙農(nóng)業(yè)環(huán)境監(jiān)測(cè)研究站湘江支流水量及氮磷含量長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)定位點(diǎn)的地表徑流水[24]，樣品采集時(shí)間為2020年8月16日，水樣采集后密封保存于500 mL聚四氟乙烯瓶中并于4 ℃條件下運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室。水樣中硝態(tài)氮含量用AA3流動(dòng)注射儀測(cè)定(SEAL AA3,Norderstedt,德國(guó))，具體采樣點(diǎn)信息見表1。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

硝酸鹽還原前，預(yù)先用氨基磺酸破壞和除去土壤提取液中原有的亞硝酸鹽，而銨和其他形態(tài)氮均不影響硝酸鹽的還原反應(yīng)。

表1 三種待測(cè)水樣的信息Table 1 Information of the three types of water samples

1.3.2標(biāo)準(zhǔn)參比溶液及水樣中硝態(tài)氮-N2O轉(zhuǎn)化 吸取一定量的參比溶液于冷凍干燥機(jī)中凍干(24 h)，干粉轉(zhuǎn)移至前處理反應(yīng)瓶，再分別加入1.0 mL氨基磺酸溶液和50 mg鍍銅鎘粒于反應(yīng)瓶，密封反應(yīng)瓶，用真空泵抽真空后，用注射器加入3.0 mL醋酸-醋酸鈉緩沖液后注入高純空氣(保證反應(yīng)瓶中壓力為常壓)，將反應(yīng)瓶放入恒溫?fù)u床中(25 ℃)，以120 r·min-1振蕩16 h，反應(yīng)生成N2O氣體。上述反應(yīng)體系中氮含量分別為0.2、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、10 μmol，同時(shí)做試劑空白，每組重復(fù)6次。

取5～10 mL的待檢水樣于冷凍干燥機(jī)中凍干(24 h)，干粉轉(zhuǎn)移至前處理反應(yīng)瓶中，加入1.0 mL的氨基磺酸溶液和50 mg鍍銅鎘粒還原劑后振蕩5 min去除水樣中含有的亞硝酸鹽，加蓋密封抽真空，加入3.0 mL醋酸-醋酸鈉緩沖液，并注入高純空氣。將反應(yīng)瓶置于恒溫?fù)u床中(25 ℃)，以120 r·min-1振蕩16 h，反應(yīng)生成N2O氣體。每個(gè)樣品做3次重復(fù)。

1.3.3N2O氣體濃度及氮穩(wěn)定同位素比值測(cè)定 將Picarro G5131-i分析儀的進(jìn)樣口(流速20 mL/min)與氣體采集及進(jìn)樣裝置(前端)連接，同時(shí)設(shè)置前端的樣品采集參數(shù)，包括采樣和旁路閥切換模式，其中樣品采集時(shí)間為5 min；旁路(空氣)3 min，依次順序進(jìn)樣，測(cè)定完成后自動(dòng)切換至旁路待機(jī)。

待儀器穩(wěn)定后，將反應(yīng)瓶的采樣通道與儀器進(jìn)樣前端連接，打開采樣通道的三通閥，反應(yīng)瓶中的N2O通過前端化學(xué)阱除去大部分的水汽及雜質(zhì)，進(jìn)入Picarro G5131-i分析儀內(nèi)，檢測(cè)N2O氣體中的氮氧穩(wěn)定同位素比值。檢測(cè)器測(cè)量間隔為10 s，選取進(jìn)樣后3 min內(nèi)測(cè)定值的平均值作為樣品的檢測(cè)結(jié)果，每5個(gè)樣品進(jìn)行1次標(biāo)準(zhǔn)氣校準(zhǔn)(N2O工作標(biāo)準(zhǔn)氣)。

1.4 數(shù)據(jù)處理與繪圖

使用Excel 2013和SPSS 19.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，使用OriginPro 8軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)硝酸鉀參比溶液的測(cè)試

標(biāo)準(zhǔn)硝酸鉀參比溶液經(jīng)過前處理轉(zhuǎn)化生成N2O氣體，再結(jié)合自動(dòng)進(jìn)樣前端-Picarro G5131-i分析儀聯(lián)用系統(tǒng)測(cè)定N2O氣體濃度及其氮穩(wěn)定同位素比值，測(cè)定的結(jié)果示于圖2～圖3。

圖2 不同氮含量下2種標(biāo)準(zhǔn)硝酸鉀參比溶液轉(zhuǎn)化產(chǎn)生N2O氣體濃度及其產(chǎn)率(柱條代表N2O氣體濃度，符號(hào)(圓圈和三角)代表產(chǎn)率，數(shù)據(jù)為平均值，誤差棒為SD值，n=6)Fig.2 Concentration and yields of N2O production of two types of KNO3 standard solution relative to the content of N (Bars represent the concentration of N2O, the symbols (circle, triangle) represent N2O yieldData are mean ± standard deviation (n=6))

本研究參考水體中硝酸鹽含量，采用0.2～10 μmol共7個(gè)濃度梯度的硝酸鉀標(biāo)準(zhǔn)品參比溶液進(jìn)行了前處理，產(chǎn)生的N2O濃度在100～7 000 nmol/mol之間(見圖2)，其中1.0～2.5 μmol濃度范圍內(nèi)的實(shí)驗(yàn)樣品產(chǎn)生的N2O濃度在儀器的最佳檢測(cè)量程范圍(300～1 500 nmol/mol)，而10 μmol參比溶液樣品產(chǎn)生的N2O氣體濃度超出最高限近4倍。該套前處理反應(yīng)體系的N2O產(chǎn)率為50%～75%，且隨著反應(yīng)體系氮含量的增加，N2O的產(chǎn)率增加，與曹亞澄等[17]的研究結(jié)果基本一致。

圖3 光譜法測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)硝酸鉀參比溶液氮同位素比值的準(zhǔn)確度與精密度(數(shù)據(jù)為平均值，誤差棒為SD值，n=6)Fig.3 Precision and accuracy of the determination of 15N abundance of two types of KNO3 standard solution relative to the content of N determined by laser spectrum analysis system(Data are mean ± standard deviation, n=6)

標(biāo)準(zhǔn)硝酸鉀參比溶液的氮同位素比值測(cè)定結(jié)果(見圖3)顯示，在儀器最佳測(cè)量范圍內(nèi)的樣品均獲得了理想的δ15N結(jié)果，分別為4.33‰～5.17‰和-2.38‰～-3.18‰，與給定值4.7‰和-2.8‰基本一致(差值小于0.5‰)，前處理(包括冷凍干燥)過程未對(duì)樣品造成同位素分餾，6次重復(fù)測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)偏差也小于0.5‰。而超出測(cè)定量程的參比樣品δ15N值測(cè)定的準(zhǔn)確度和精密度均較差，重復(fù)誤差在1.0‰～2.5‰，與標(biāo)定值偏離超過了2‰，因此，在保證理想的測(cè)試準(zhǔn)確度和精密度條件下，推薦單次反應(yīng)體系中氮最低量為0.5 μmol，而最佳范圍為1.0～2.5 μmol。

2.2 水樣中硝態(tài)氮的測(cè)試

用經(jīng)典的穩(wěn)定同位素質(zhì)譜法測(cè)定樣品值作為參考值。根據(jù)前處理最佳樣品量的要求，取8 mL水樣進(jìn)行冷凍干燥濃縮。濃縮后的水樣按照方法要求進(jìn)行前處理，通過自動(dòng)進(jìn)樣前端-Picarro G5131-i分析儀聯(lián)用系統(tǒng)測(cè)定其中的氮穩(wěn)定同位素比值，測(cè)定結(jié)果見表2。由表2可知，三個(gè)采樣點(diǎn)水樣品的氮同位素比值測(cè)試結(jié)果較好，數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)均小于0.5‰，與質(zhì)譜法測(cè)定值的絕對(duì)偏差小于0.5‰。

表2 激光光譜儀測(cè)定3種未知水樣三個(gè)重復(fù)樣中硝態(tài)氮的δ15N值(n=6)Table 2 Results of nitrogen isotope of three types of water sample determined by laser spectrum analysis system (n=6)

3 結(jié)論

本研究通過一系列實(shí)驗(yàn)方法驗(yàn)證，建立了冷凍干燥預(yù)濃縮結(jié)合化學(xué)轉(zhuǎn)化N2O氣體的樣品前處理方法，并建立了自動(dòng)進(jìn)樣前端-激光光譜儀聯(lián)用系統(tǒng)，檢測(cè)水中硝態(tài)氮穩(wěn)定同位素的測(cè)定方法。采用該套分析方法對(duì)不同來(lái)源水樣中的硝態(tài)氮進(jìn)行了氮穩(wěn)定同位素測(cè)試，研究結(jié)果表明，該方法的檢測(cè)限低，僅需要約10 mL的水樣，就可獲得理想的測(cè)試結(jié)果，滿足常規(guī)樣品的分析，可為初步判別水體中硝態(tài)氮的來(lái)源，為水環(huán)境污染的預(yù)防、控制與治理提供方向。相較傳統(tǒng)質(zhì)譜法分析中涉及的多次樣品氣低溫冷阱預(yù)濃縮，測(cè)試時(shí)長(zhǎng)需約30 min，而光譜法操作簡(jiǎn)單快速，測(cè)試時(shí)長(zhǎng)僅需5 min，不涉及復(fù)雜的定量結(jié)果校正。此外，穩(wěn)定同位素比率質(zhì)譜儀的購(gòu)置成本和維護(hù)成本遠(yuǎn)高于激光光譜儀。因此，鑒于該方法測(cè)試精度高，所用儀器設(shè)備自動(dòng)化程度高、操作簡(jiǎn)單、維護(hù)和測(cè)試成本低廉等諸多優(yōu)點(diǎn)，在水體環(huán)境質(zhì)量的監(jiān)測(cè)和水體硝酸鹽污染源追蹤溯源等研究中具有廣闊的應(yīng)用前景。