光學遺傳用于聽力恢復的研究進展

喻思楚 王夢琪陳志峰 馬賢 鐘翠萍*

1中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九四〇醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（蘭州 730050）

2寧夏醫(yī)科大學臨床學院研究生院（銀川 750004）

光學遺傳是一種新型多功能工具，它讓控制時空離子通道激活成為可能，利用光操縱依賴光的離子通道來控制膜電位和不同的細胞內(nèi)機制[1]。這些光敏細胞膜蛋白被稱為視蛋白,現(xiàn)已有許多不同類型的視蛋白，如I型和II型視蛋白[2]，最常用的視蛋白是通道視紫紅質(zhì)(channel rhodopsin，ChR)和鹽視紫紅質(zhì)[3]。在綠藻萊茵衣藻中發(fā)現(xiàn)了ChR的前兩種主要亞型[4]，ChR-1[5]是光敏的質(zhì)子選擇性通道，ChR-2[6]是光敏的非特異性陽離子通道。光激活ChR導致細胞膜去極化[7]，鹽視紫紅質(zhì)是光門控氯離子通道，它的激活會導致細胞超極化[8]。這兩個視蛋白家族在被發(fā)現(xiàn)后得到了進一步的證明[9]，并在這些原始家族的基礎(chǔ)上獲得了更多不同波長敏感性和動力學的視蛋白亞型[10，11]。在光照射之前，ChR必須在相應的細胞中表達，其表達是由啟動子/增強子區(qū)域控制的，為了使正確的組織表達ChR，可以用病毒載體將ChR基因敲入組織中培養(yǎng)[3]，亦或用表達ChR的轉(zhuǎn)基因動物模型進行體內(nèi)和體外研究[12]。將ChR與熒光標記融合在熒光顯微鏡下可見[13]，可確認細胞表面的 ChR 表達[14，15]。一旦確定其表達，光照射在其表達的細胞上以驅(qū)動離子通量，通過光療前后細胞電生理反應和離子濃度的變化來觀察ChR的作用。大多數(shù)光遺傳學實驗都是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織中進行的，但只有一小部分在聽覺系統(tǒng)中進行了測試[1]。這些聽覺實驗一直圍繞著激活或滅活Corti器官中的不同細胞，以了解它們的功能，并創(chuàng)造一種新的耳蝸植入裝置即光學人工耳蝸（optical cochlear implant，oCIs）。本文旨在從聽力恢復的現(xiàn)狀和局限性、oCIs的生物醫(yī)學和光電發(fā)展現(xiàn)狀等方面進行綜述，并對oCIs的基因治療和醫(yī)療設備的臨床應用進行展望。

1 聽力恢復的現(xiàn)狀和局限性

聽力損失（Hearing loss，HL）為全球范圍最常見的感覺障礙性疾病，占據(jù)我國殘疾人群1/4，人數(shù)約為2000多萬[16]。除遺傳因素外大多數(shù)HL是耳蝸性疾病，如因噪音、耳毒性藥物、局部缺血、創(chuàng)傷或感染對耳蝸造成的傷害，且傷害一般不可逆[17]。目前感音神經(jīng)性聽力損失（sensorineural hearing loss，SNHL）的因果治療還不完善，再生方法正在研究中，首個耳科的臨床基因治療旨在通過強制表達轉(zhuǎn)錄因子Atoh1從支持細胞再生毛細胞[18]，技術(shù)手段尚無法在活體內(nèi)實現(xiàn)毛細胞再生[19]。現(xiàn)已進行了幾項臨床前基因替代治療研究，闡明了典型的人類遺傳性耳聾小鼠模型的原理[20]。臨床轉(zhuǎn)換需要在耳蝸退行性改變之前進行一定干預，并僅限于150多個已知的耳聾基因的子集中[21]。

因技術(shù)限制，目前和未來的一段時間內(nèi)助聽器和電子耳蝸（electric Cochlear implants，eCIs）仍將是大多數(shù)HL的聽力康復的選擇[17]。兩者的選擇取決于HL的嚴重程度和損傷的部位，當輕度HL時助聽器分析周圍的聲音信號，并通過揚聲器或骨耦合為耳朵提供放大和被處理過的聲信號；當重度HL或耳聾患者不能通過助聽器實現(xiàn)充分的聽力康復時，可以使用eCIs，它通過直接刺激耳蝸螺旋節(jié)神經(jīng)元(spiral ganglion neurons，SGNs)，從而繞過功能失調(diào)或缺失的毛細胞[22]。雖eCIs被認為是目前最成功的神經(jīng)假體，但仍有其不足。eCIs的電極接觸電流的廣泛傳播，導致SGNs的廣泛興奮，限制了人工聲音編碼的頻率分辨率[23]，使得患者在嘈雜的背景下語言理解有困難且難以欣賞音樂?，F(xiàn)為提高其的性能，一般使用多極刺激[24]和神經(jīng)內(nèi)刺激[25]來控制電流，不過效果不夠理想。光在空間中可更好地被控制，聽覺神經(jīng)光遺傳刺激可能克服eCIs的缺陷[1]。未來的oCIs有望提高人工聲音編碼，從而提高噪音背景下的語音識別及欣賞音樂的能力[26]。

2 oCIs的生物醫(yī)學和光電發(fā)展現(xiàn)狀

oCIs是基因治療和光電醫(yī)療設備的結(jié)合，其發(fā)展需要生物醫(yī)學和光學工程的多學科研究。近年來，基因治療方法主要用于探索感覺恢復。美國食品和藥物管理局已批準了一種基于腺相關(guān)病毒(adeno-associated virus，AAV)的基因療法，用于治療幼年利伯氏先天性黑朦，現(xiàn)視網(wǎng)膜已經(jīng)成為基因治療前沿[27]。DiGuiseppi等[1]認為視網(wǎng)膜和耳蝸都只需要微小的載體劑量，而且由于血-視網(wǎng)膜/迷路屏障和獨特的眼內(nèi)/蝸內(nèi)微環(huán)境對免疫反應的局部抑制作用，它們可以作為基因治療的靶點。而Weiss等[28]認為與視網(wǎng)膜細胞的光遺傳操作不同，由于SGNs的主體隱藏在耳蝸的骨核心羅森塔爾管中，所以對SGNs產(chǎn)生聽神經(jīng)的光遺傳操作有特定的挑戰(zhàn)。

生物醫(yī)學方面oCIs可以借鑒光遺傳視覺恢復，醫(yī)療器械的發(fā)展在一定程度上可以建立在eCIs聽力康復的長期經(jīng)驗基礎(chǔ)上。在oCIs中音頻處理、經(jīng)顱信號[29]和動力傳輸[30]等功能，可以通過圓窗將柔性和良好封裝的刺激植入體前端非創(chuàng)傷性地插入鼓階也可以實現(xiàn)類似的功能[31]。最近對經(jīng)過SGNs光基因修飾的嚙齒動物[10]進行的基于光纖的耳蝸光遺傳學實驗[32]，在實現(xiàn)這些目標方面取得了相當大的進展[33]。刺激由電轉(zhuǎn)為光確實有一些優(yōu)勢，但也存在諸多挑戰(zhàn)，亟待解決，這些將在下面討論。

2.1 生物醫(yī)學的發(fā)展

截至目前為止已經(jīng)在沙鼠[34]、豚鼠[35]和貓[36]等活體動物耳蝸模型實驗已證實了oCIs原理的可行性。Hernandez[37]、Keppeler[38]、Duarte[39]各自帶領(lǐng)的研究團隊已在體外測量到通過光纖激活SGNs，表明光遺傳學工具具有適當?shù)穆犛X系統(tǒng)刺激的速度和功率。一些研究方法已經(jīng)允許在體外以高時空分辨率控制基因表達[40]，并正在針對不同的哺乳動物細胞系[41]和體內(nèi)[42]研究進行優(yōu)化。光遺傳基因表達控制已在細菌、酵母以及不同的哺乳動物細胞系[43]中檢測出陽性結(jié)果。原理研究的第一個證據(jù)報道了在Thy1.2啟動子下[44]，轉(zhuǎn)基因鼠神經(jīng)表達ChR2的聽覺系統(tǒng)的光遺傳激活[29]。通過ChR2-EYFP免疫熒光在SGNs以及光學誘發(fā)電位(optical auditory brainstem responses，oABRs)，是單一聽覺神經(jīng)纖維放電和聽覺中腦局部場電位中顯示功能性表達。其與聽神經(jīng)的聲學和電刺激相比，表明在低光水平下提高光譜選擇性的可行性，但相比于SNGs的生理發(fā)射率，光遺傳編碼的時間保真度相對較差。將人突觸蛋白啟動子下攜帶鈣轉(zhuǎn)運ChR2變體(calcium-translocating ChR2-varian，CatCh)的AAV注射到胚胎耳囊[45]，鼠聽覺神經(jīng)的光遺傳激活也被證實[29]。

后續(xù)研究，通過向出生后早期小鼠內(nèi)耳注射卵泡內(nèi)病毒建造動物模型，證實聽覺通路的光遺傳激活，使用快速通道ChRs，并提供時間信息的光遺傳編碼的更詳細的特征，以提高保真度。在人類突觸蛋白啟動子下注射帶有紅光轉(zhuǎn)移、快速門控的ChRvariant f-Chrimson的AAV，可使oABRs的低閾值0.5μJ達到200 Hz，聽神經(jīng)纖維反應達到幾百Hz[31]。Klapoetke等[46]研究中，在人類突觸蛋白啟動子下注射有效的AAV-PHP，攜帶快速的ChR Chronos，包含內(nèi)整流鉀通道的高爾基轉(zhuǎn)運序列，使SGNs反應在群體和單個神經(jīng)元水平上達到幾百Hz。因此，f-Chrismson和Chronos都支持接近生理速率的SGNs放電。這兩項研究都在注射耳的所有頻率區(qū)域?qū)崿F(xiàn)了高轉(zhuǎn)導率[10]，且沒有造成明顯的SGNs損失[31]。在這些研究中，強刺激誘發(fā)的oABRs的潛伏期、波形和波幅與生理的聽性腦干反應相似，反映了注射耳聽覺神經(jīng)的特異性的光遺傳激活。但在未注射的對側(cè)耳中，ChR表達可明顯傳播病毒。另一項在不同實驗室進行的研究涉及在CAG啟動子的控制下，將攜帶原始Chronos的AAV-Anc80注射到出生后的小鼠耳中，并顯示了可能涉及毛細胞激活的oABRs，因為即使AAV局部應用于內(nèi)耳[32]，CAG也能促進SNGs以外的表達。

沙鼠的聽覺頻率與人類相近，可用其實現(xiàn)病毒介導的光基因SGNs操作[30]。將攜帶CatCh的AAV直接注射到突觸蛋白啟動子下的耳蝸軸中，可在所有壓力位區(qū)域的SGNs中產(chǎn)生CatCh表達，在大約一半的注射動物中，平均表達率為30%，僅10%表達CatCh的SGNs即可誘導oABRs。oABRs波幅小于小鼠，但潛伏期較短，刺激可達約200 Hz。在注射的耳朵中發(fā)現(xiàn)了輕微的SGNs損失(20-30%)，在對照組動物注射鹽水時也觀察到，這可能是內(nèi)部蝸軸壓力增加引起的。用沙鼠來演示光遺傳SGNs刺激的感知:基于光纖的單通道oCIs使沙鼠在激光閾值低于2μJ的情況下學習刺激的回避行為[30]。動物的回避行為從光刺激轉(zhuǎn)移到聲刺激，表明刺激從光到聲的感知存在一定的泛化[17]。

成年沙鼠表達CatCh被用于全面研究自然和人工SGNs刺激的光譜選擇性[33]，采用聲、光、電等刺激對側(cè)耳蝸時，在聽覺中腦進行神經(jīng)元簇活動的多通道記錄。在耳蝸張力軸不同位置放置多達3根激光耦合光纖進行光刺激，在聽覺中腦的張力對應區(qū)域觀察到空間選擇性神經(jīng)元活動[33]。在所有激活強度下，光遺傳刺激比單極電刺激更具選擇性，在中、高激活強度下均優(yōu)于雙極電刺激。光刺激在較低和適中的激活水平下與聲波刺激一樣具有選擇性，但在較高的刺激強度下可引起更廣泛的激活[33]。通過Monte Carlo射線追蹤模擬光在耳蝸中的傳播，證實了生理評估所證明的光譜選擇性的提高[30，33]。進一步表明，較小孔徑和較窄光束輪廓的發(fā)射體以及距離目標神經(jīng)組織較近的發(fā)射體可以進一步提高光刺激的光譜選擇性。

目前研究通過為SGNs刺激提供生理或行為證據(jù)，證明了光遺傳聽力恢復的可行性。在ChR-2轉(zhuǎn)基因小鼠中，藥理學或基因干擾聽覺[29]后仍可誘發(fā)oABRs，在氨基糖苷致聾后，光刺激SGNs在生理和行為水平上重新激活沙鼠的聽覺系統(tǒng)[30]。小鼠視蛋白表達的穩(wěn)定性和生物安全性在注射后的9個月已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)，f-Chrimson穩(wěn)定表達且沒有SGNs的損失[31]。另一項研究發(fā)現(xiàn)，病毒注射后6-18周，小鼠聽神經(jīng)中有類似的Chronos表達水平[47]。在植入光纖的沙鼠中，重復的oABRs測量顯示植入后100多天內(nèi)，對光刺激SGNs有穩(wěn)定的反應[30]。未來的實驗需要整合這些方法，并在行為水平上證明耳蝸光遺傳學的光譜特異性，理想的方式是結(jié)合生物安全的縱向研究。

2.2 多通道oCIs的發(fā)展方向

總結(jié)多項實驗研究結(jié)果，有理由相信以光作為能量來源的oCIs或許將成為一種可精確刺激耳蝸特定區(qū)域且有潛力的助聽裝置[48]。除了生物醫(yī)學方面的困難需要攻克外，我們還需要去著力研究oCIs的光學傳導的工具，目前的研究集中于研究多通道oCIs。多通道oCIs工程正在迅速發(fā)展，采用了兩種基本策略:有源oCIs(將光電發(fā)射器帶入耳蝸)和無源oCIs(使用波導將腦外發(fā)射器的光引入耳蝸)[49]。oCIs必須具備生物相容性、安全性和長期穩(wěn)定性，設計要求包括集成了幾十到數(shù)百個刺激通道，可接受的能量預算和熱釋放的節(jié)能光學發(fā)射器，狹窄的光束輪廓和適當?shù)亩ㄎ辉诠碾A發(fā)射器，合適的形狀因素和低剛度。

2.2.1 有源oCIs

有源oCIs的發(fā)光元件更靠近SGNs，避免在波導內(nèi)外耦合時的光損耗，目前發(fā)光元件考慮發(fā)光二極管（light emitting diodes，μLEDs）和激光二極管。商用μLEDs是在20mm長，0.24mm寬的柔性聚酰亞胺基板上進行組裝[39]，10個可以單獨處理的μLEDs間距為350或500mm，在5mA的電流驅(qū)動下，μLEDs的光功率約為0.3mW[50]。另一項研究使用15個μLEDs，嵌入生物兼容的硅酮，并將該oCIs植入鼓階中，其插入力可與商業(yè)可用的eCIs相媲美[51]。定制微尺度μLEDs薄膜，已開發(fā)尺寸小至50*50μm[52，53]，并已描述了平行晶圓級制造[43]。這種總寬度為230μm，長度為5mm的oCI封裝了4個50*50*15μm，可以通過圓窗插入鼠耳蝸。基于已建立的晶圓級工藝，最近設計的oCIs的寬度為350μm，長度為15mm，共144個分別可尋的μLEDs50*50μm。在下一代基于μLEDs的光學元件中，全環(huán)氧基載體最大限度地減少了熱機械彎曲。此外，光功率大幅提高:在10mA時，輸出功率達到0.82mW。最后，最高溫度增加1℃當種植體放置在瓊脂糖上時，用持續(xù)時間為20ms、強度為10mA的直流脈沖驅(qū)動μLEDs，測量C值，使該種植體適合于體內(nèi)應用[44]。在后續(xù)的研究中，通過添加錐形聚光器和由聚二甲基硅氧烷制成的球形微透鏡，這些基于μLED的光學器件的光學性能得到了改善[54]。對于主動oCIs的轉(zhuǎn)換，需要長時間穩(wěn)定、透明的封裝，以保持oCIs的足夠靈活性。目前面臨的挑戰(zhàn)是，要在不破壞光電元件的情況下，實現(xiàn)對水蒸氣和離子的足夠屏障功能，以保護光電元件，同時避免光電元件粒子擴散到耳蝸。

2.2.2 無源oCIs

無源oCIs利用波導將外部光源傳送到耳蝸，所以它可將光電子從耳蝸中分離出來，并像最先進的eCIs和心臟起搏器一樣將其密封起來。其優(yōu)點是穩(wěn)定性、生物相容性、較低的耳蝸熱產(chǎn)生和較小的尺寸的蝸內(nèi)光發(fā)射器，缺點是在發(fā)射光波導界面和沿波導內(nèi)耦合時的光損耗，影響了這種耦合的潛在機械磁化率[55]。最近報道了一種由8根直徑為25μm的玻璃纖維包埋在硅樹脂中的無源oCIs，該裝置測量的插入力與傳統(tǒng)的eCIs相當，在人類顳骨中插入深度可達20mm[56]。采用芯厚低于10μm的聚合物基波導，提供了一種替代方法，特別是考慮到靈活性和獨立刺激通道的數(shù)量[42，46，57]，但聚合物纖維的光傳播受到波長依賴性的限制。

3 展望

oCIs的相關(guān)研究已取得巨大的突破，但絕大部分仍停留在動物試驗階段。未來的研究重點在于基因治療、醫(yī)療設備等方面臨床化。在基因治療中耳蝸光學遺傳學的有效性、穩(wěn)定性和生物安全性為臨床應用提供可能，聽覺神經(jīng)光敏的結(jié)構(gòu)應設計為在生理發(fā)射速率和低光需求下使SGNs強光遺傳激活，神經(jīng)轉(zhuǎn)導所需的載體應該得到優(yōu)化，以便安全有效地傳遞其基因負載。最近，兩項涉及AAVs介導的光遺傳視覺恢復的臨床試驗已獲批準，證實了光遺傳治療神經(jīng)恢復的潛力[17]。

與典型的基因治療不同，SGNs的光遺傳學操作并不是為了自身恢復聽力，它需要結(jié)合oCIs這種醫(yī)療設備，由外部聲音處理器、內(nèi)部發(fā)光植入物以及這些設備之間的適當編碼程序組成。雖然通信和處理器技術(shù)可以借鑒eCIs，但由于視蛋白動力學突破時域限制和刺激通道的增加很可能需要對編碼程序進行大量的重新工作。足夠SGNs激活的最小光脈沖持續(xù)時間和強度將取決于所選光遺傳工具的通道動力學。單個脈沖的能量需要在其持續(xù)時間和強度之間進行平衡，且需考慮到oCIs的合理電池壽命。另外，光學刺激的結(jié)果模式將被映射到一套與eCIs增加的獨立刺激通道，以編碼光譜信息。雖然光發(fā)射器的最終數(shù)量仍有待確定，但據(jù)估計，光發(fā)生SGNs刺激的光譜選擇性至少比電編碼高出兩倍，50-100光學發(fā)射器為目標的范圍似乎是一個合理的數(shù)目[21]。

綜上所述，在oCIs大規(guī)模應用臨床前，我們需要最大限度地保證患者的安全的前提下，去優(yōu)化相關(guān)基因治療方式，改進相關(guān)醫(yī)療設備?；谀壳暗目蒲屑夹g(shù)和研究基礎(chǔ)，我們相信光學遺傳用于聽力恢復將會是一個很有前途的領(lǐng)域,oCIs也將會大幅度提高SNHL患者的生活質(zhì)量。