趙歡歡 王玲 張國(guó)川

骨肉瘤 ( osteosarcoma，OS ) 是兒童和青少年中最常見(jiàn)的原發(fā)性惡性骨腫瘤[1]。目前的主流治療方案是：手術(shù)切除原發(fā)腫瘤聯(lián)合新輔助化療和輔助化療。標(biāo)準(zhǔn)的治療使局限性骨肉瘤患者的 5 年生存率提高到了 70%，但是對(duì)復(fù)發(fā)性或轉(zhuǎn)移性骨肉瘤的治療效果不理想[2]。在轉(zhuǎn)移性骨肉瘤患者中，長(zhǎng)期生存率低于 30%，轉(zhuǎn)移病灶常常累及到肺臟，而這是造成大部分患者死亡的原因[3]。在過(guò)去的 30 年里，盡管進(jìn)行了大量化療和靶向治療方案試驗(yàn)，骨肉瘤患者生存率一直沒(méi)有得到進(jìn)一步明顯的改善。因此，有必要尋找新型治療藥物來(lái)改善骨肉瘤患者的臨床療效。

腫瘤細(xì)胞可以通過(guò)過(guò)度表達(dá)免疫抑制性檢查點(diǎn)，與免疫細(xì)胞上相應(yīng)受體結(jié)合，使得對(duì)應(yīng)的免疫細(xì)胞功能降低甚至耗竭，從而實(shí)現(xiàn)免疫逃逸。免疫檢查點(diǎn)抑制劑的出現(xiàn)及其應(yīng)用，已經(jīng)改善了多種腫瘤的預(yù)后[4-8]。然而，臨床前研究表明，骨肉瘤對(duì)程序性細(xì)胞死亡蛋白 1 ( programmed cell death protein 1，PD-1 ) 抑制劑治療不敏感[9]，存在抵抗現(xiàn)象。使用 PD-1 抑制劑的臨床試驗(yàn)也表明，其對(duì)大多數(shù)骨肉瘤患者無(wú)明顯效果或者出現(xiàn)耐藥[10]。在一項(xiàng)有關(guān)派姆單抗治療原發(fā)性骨肉瘤的 Ⅱ 期臨床試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)其缺乏療效[11]。因此，研究如何克服 PD-1 抑制劑在骨肉瘤治療中的抵抗效應(yīng)，提高骨肉瘤組織對(duì) PD-1 抑制劑的敏感性具有重要意義。

一、PD-1 概述

PD-1 ( CD279 )，于 1992 年首次被發(fā)現(xiàn)，位于人類 2 號(hào)染色體上。PD-1 由免疫球蛋白 ( Ig ) 超家族結(jié)構(gòu)域、22 個(gè)氨基酸組成的莖干區(qū)、跨膜結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域組成，該細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域包含免疫受體酪氨酸抑制基序 ( immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif，ITIM ) 和免疫受體酪氨酸轉(zhuǎn)換基序 ( immunoreceptor tyrosine-based switch motif，ITSM )。當(dāng)配體程序性細(xì)胞死亡蛋白配體 1 ( programmed cell death protein ligand 1，PD-L1 ) 與受體 PD-1 相互作用時(shí)，可誘導(dǎo)后者的 ITIM 和 ITSM 的磷酸化，隨后將 PD-L1 相關(guān)的抑制性信號(hào)傳遞給各種信號(hào)蛋白，如 PI3K / AKT、STAT3 等，進(jìn)而抑制 T 細(xì)胞、B 細(xì)胞、NK 細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等的免疫活性，介導(dǎo)免疫逃逸[12-19]。

二、PD-1 抑制劑在骨肉瘤治療中的抵抗耐藥機(jī)制

1. 腫瘤免疫原性對(duì) PD-1 抑制劑療效的影響：有研究表明，腫瘤表面越是形成高免疫原性腫瘤特異性抗原，PD-1 抑制劑的療效就會(huì)越好，如高免疫原性的黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌等腫瘤，對(duì) PD-1 抑制劑的治療比較敏感。但是如果腫瘤特異性抗原表達(dá)過(guò)低，免疫原性弱，抗原提呈細(xì)胞無(wú)法識(shí)別有效抗原，便無(wú)法活化 T 細(xì)胞，則會(huì)表現(xiàn)出對(duì) PD-1 抑制劑的抵抗[20-24]。

骨肉瘤的基因組復(fù)雜，大多數(shù)骨肉瘤的特征是復(fù)雜的染色體異常，具有明顯的細(xì)胞間異質(zhì)性，而高度突變和重排的骨肉瘤基因組可能不能夠產(chǎn)生足夠的新抗原，從而導(dǎo)致其免疫原性有限[25]，對(duì) PD-1 抑制劑的治療不敏感。

2. CD38 表達(dá)對(duì) PD-1 抑制劑抵抗的影響：已有報(bào)道稱 CD38 的升高是 PD-1 / PD-L1 抑制劑獲得性耐藥的主要機(jī)制，其可以抑制 T 細(xì)胞的免疫功能[26]。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 ( NAD+) 在維持 T 細(xì)胞功能方面起著重要作用，CD38 水平升高導(dǎo)致 NAD+濃度降低，從而降低 T 細(xì)胞活性[27]。同時(shí)，CD38 是腺苷在產(chǎn)生過(guò)程中一種重要的催化酶，而腺苷可通過(guò)下游的腺苷受體 2A 或 2B 信號(hào)級(jí)聯(lián)途徑抑制 CD8+T 細(xì)胞的活性，從而減弱對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力[20]?？?CD38 單克隆抗體和 PD-1 抑制劑的聯(lián)合應(yīng)用可提高抗腫瘤免疫應(yīng)答，提示了 CD38 與出現(xiàn) PD-1 抑制劑抵抗現(xiàn)象的相關(guān)性[28]。通過(guò)降低 CD38 的表達(dá)，可以提高 PD-1 抑制劑治療的敏感性，為骨肉瘤提供了一個(gè)新的治療理念。

Nasarre 等[26]在一項(xiàng)小鼠體內(nèi)骨肉瘤的藥物試驗(yàn)中，分泌卷曲相關(guān)蛋白 2 ( secreted frizzled-related protein 2，SFRP2 ) 單克隆抗體可以明顯減少 CD38 在小鼠脾臟 T 細(xì)胞、腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞上的表達(dá)，進(jìn)一步研究顯示 SFRP2 通過(guò)促進(jìn)活化 T 細(xì)胞核因子 3 ( nuclear factor of activated T cells 3，NFATC3 ) 來(lái)增加 CD38 和 PD-1 在 T 細(xì)胞上的表達(dá)，而使用 SFRP2 單克隆抗體可特異性下調(diào) CD38 和 PD-1 的表達(dá)，從而克服骨肉瘤對(duì) PD-1 抑制劑的藥物抵抗性。PD-1 抑制劑聯(lián)合 SFRP2 單克隆抗體治療小鼠骨肉瘤，二者表現(xiàn)出協(xié)同促進(jìn)作用，可抑制轉(zhuǎn)移性骨肉瘤，且無(wú)毒性跡象。近年來(lái)，一些免疫檢查點(diǎn)抑制劑與 CD38 單克隆抗體的組合已開始被應(yīng)用[29]。

3. 腫瘤 PD-L1 表達(dá)水平與 PD-1 抑制劑抵抗的關(guān)系：對(duì)于大部分腫瘤，PD-L1 表達(dá)陽(yáng)性的患者對(duì) PD-1 / PD-L1 抑制劑治療的臨床反應(yīng)更好[30-31]。如在黑色素瘤患者身上，PD-L1 在腫瘤細(xì)胞上的早期表達(dá)可以提高 PD-1 抗體的療效。對(duì)于骨肉瘤來(lái)說(shuō)，腫瘤細(xì)胞 PD-L1 表達(dá)水平的提高同樣可以提高 PD-1 抑制劑免疫治療的敏感性。

Mochizuki 等[32]介紹了一種使用端粒酶特異性溶瘤腺病毒來(lái)克服骨肉瘤中 PD-1 抑制劑治療的抵抗效應(yīng)。端粒酶特異性溶瘤腺病毒顯著增加了 PD-L1 蛋白在小鼠 K7M2 和 NHOS 骨肉瘤細(xì)胞表面的表達(dá)。CD8+T 細(xì)胞與骨肉瘤細(xì)胞之間可以通過(guò) PD-1 與 PD-L1 的結(jié)合來(lái)加強(qiáng)二者的聯(lián)系，從而改善骨肉瘤對(duì) PD-1 抑制劑的抵抗，而 PD-L1 表達(dá)的增加可以促進(jìn)這種結(jié)合。

4. CD8+T 細(xì)胞耗竭與 PD-1 抑制劑抵抗的關(guān)系：PD-1 的表達(dá)在 T 細(xì)胞的功能失調(diào)中起著重要作用，其持續(xù)高表達(dá)往往提示存在著免疫功能的嚴(yán)重受損。隨著腫瘤在體內(nèi)存在時(shí)間的延長(zhǎng)，生長(zhǎng)速度的加快，PD-1 的表達(dá)會(huì)越高，導(dǎo)致失效的 T 細(xì)胞就會(huì)越多，特別是 CD8+T 細(xì)胞的失活，甚至嚴(yán)重耗竭，從而降低免疫敏感性，面對(duì) PD-1 抑制劑而出現(xiàn)的抵抗效應(yīng)就越嚴(yán)重[20,33]。對(duì)于輕度或者中度表達(dá) PD-1 的 CD8+T 細(xì)胞，PD-1 抑制劑還可以使其重新恢復(fù)活力并發(fā)揮免疫功能，但 PD-1 抑制劑對(duì) PD-1 高表達(dá)的失活 CD8+T 細(xì)胞則無(wú)明顯的刺激作用[34-35]，依此可以判斷腫瘤對(duì) PD-1 抑制劑的抵抗程度。

使用端粒酶特異性溶瘤腺病毒，克服骨肉瘤中 PD-1 抑制劑治療的抵抗效應(yīng)，端粒酶特異性溶瘤腺病毒聯(lián)合 PD-1 抑制劑，除了可以增加 PD-L1 蛋白的表達(dá)，還可明顯增加腫瘤內(nèi) CD8+T 細(xì)胞的數(shù)量和恢復(fù)其活力并使其充分浸潤(rùn)到腫瘤組織內(nèi)。提示端粒酶特異性溶瘤腺病毒治療具有誘導(dǎo)產(chǎn)生腫瘤浸潤(rùn) CD8+T 細(xì)胞的作用，從而增強(qiáng)骨肉瘤對(duì) PD-1 抑制劑治療的敏感性，促進(jìn)抗腫瘤免疫應(yīng)答。

5. 髓系來(lái)源抑制性細(xì)胞 ( MDSCs ) 與 PD-1 抑制劑抵抗的關(guān)系：MDSCs 可以表達(dá) VEGF、bFGF 等促血管生成因子，其可以直接促進(jìn)腫瘤血管的形成，另外，MDSCs 還通過(guò)釋放活性氧去除 T 細(xì)胞增殖所需的關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，從而抑制 T 細(xì)胞功能[36]，抑制細(xì)胞毒性 T 淋巴細(xì)胞 ( cytotoxic T lymphocyte，CTL ) 進(jìn)入腫瘤組織，所以在 MDSCs 存在時(shí)，即使 CTL 被 PD-1 抑制劑激活，但由于腫瘤組織中 CTL 的浸潤(rùn)不足，影響 PD-1 抑制劑作用的發(fā)揮，出現(xiàn)抵抗現(xiàn)象。

Horlad 等[37]在小鼠骨肉瘤模型的腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)大量 MDSCs，MDSCs 在骨肉瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要的作用。Jiang 等[38]發(fā)現(xiàn)趨化因子受體 4 ( chemokine receptor 4， CXCR4 ) 拮抗劑可以減少小鼠骨肉瘤組織內(nèi)表達(dá) CXCR4 的 MDSCs，而 MDSCs 的抑制可以恢復(fù) T 細(xì)胞介導(dǎo)的特異性抗腫瘤免疫以及 NK 細(xì)胞和巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的天然抗腫瘤免疫，并且 CXCR4 拮抗劑與 PD-1 抑制劑共同應(yīng)用時(shí)具有協(xié)同作用，可顯著提高抗腫瘤作用，延長(zhǎng)小鼠生存期。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn) CXCR4 拮抗劑與 PD-1 抑制劑的聯(lián)合應(yīng)用可以促進(jìn) CTL 在骨肉瘤組織內(nèi)浸潤(rùn)并控制腫瘤生長(zhǎng)。提示 CXCR4 拮抗劑通過(guò)抑制 MDSCs 并增加腫瘤組織中 CTL 的浸潤(rùn)，克服 PD-1 抑制劑在骨肉瘤治療中的抵抗。

6. PI3K-AKT 信號(hào)通路與 PD-1 抑制劑抵抗的關(guān)系：PI3K 磷脂酰肌醇-3-激酶，AKT 又稱作蛋白激酶 B ( PKB )， 是 PI3K 重要的下游分子，組成 PI3K / AKT 信號(hào)通路，其是調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成的主要信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞周期的進(jìn)展，包括細(xì)胞增殖、分化、凋亡等。同時(shí)，又與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，因此也受到許多因子的負(fù)調(diào)控，以避免其過(guò)度激活[20]。腫瘤細(xì)胞 PD-L1 的表達(dá)受到 PI3K / AKT 信號(hào)通路的調(diào)控，并且有試驗(yàn)研究顯示，選擇性地抑制 PI3K 可增強(qiáng)相關(guān)腫瘤對(duì) PD-1 / PD-L1 抑制劑的敏感性。

Shi 等[39]報(bào)道了一項(xiàng)關(guān)于 PI3K 特異性抑制劑 SNA 促進(jìn)骨肉瘤對(duì) PD-1 抑制劑敏感性的研究。試驗(yàn)中對(duì)荷瘤小鼠聯(lián)合使用 SNA 和 PD-1 抑制劑治療，結(jié)果顯示，與單獨(dú)藥物治療相比明顯減緩了腫瘤的生長(zhǎng)，并顯著延長(zhǎng)了小鼠生存時(shí)間。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，SNA 通過(guò)抑制下游 AKT 和 S6 的磷酸化來(lái)抑制 MDSCs 的活性，并且促進(jìn) CD8+T 細(xì)胞對(duì)腫瘤組織的浸潤(rùn)，提高了 PD-L1 在腫瘤細(xì)胞上的表達(dá)，促使腫瘤組織內(nèi)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞 M1 型轉(zhuǎn)變，從而激活了腫瘤微環(huán)境，增強(qiáng)了 T 淋巴細(xì)胞的免疫效能，提高 PD-1 抑制劑的抗骨肉瘤免疫能力。

PD-1、PD-L1 在骨肉瘤組織中表達(dá)增高，并且與患者的預(yù)后密切相關(guān)[40-45]，PD-1 抑制劑在骨肉瘤免疫治療當(dāng)中本應(yīng)起到重要作用，但是其效果并不太盡如人意。本文通過(guò)對(duì) PD-1 抑制劑在骨肉瘤治療中的抵抗機(jī)制進(jìn)行總結(jié)分析，發(fā)現(xiàn)其受到了免疫原性、免疫因子、免疫抑制細(xì)胞、腫瘤信號(hào)通路、腫瘤微環(huán)境等多方面的影響。今后還須深入地研究，分析各方面的因素，以期獲得解決 PD-1 抑制劑抵抗性的最佳方案，以給骨肉瘤患者帶來(lái)更大的益處。