史芳芳，楊其享，胡長(zhǎng)軍，李 明

（新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第十二師農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，新疆烏魯木齊 830088）

草莓（Fragaria×ananassaDuch.），屬薔薇科草莓屬多年生常綠草本小漿果果樹(shù)，果實(shí)色澤鮮艷、芳香多汁、酸甜適口、含有豐富的維生素C，被譽(yù)為“水果皇后”。近幾年，隨著中國(guó)草莓種植面積的不斷擴(kuò)大，其栽培模式也在發(fā)生轉(zhuǎn)變，草莓栽培過(guò)程中的病害問(wèn)題逐漸突顯。草莓病害種類(lèi)較多，除了地上部的灰霉病、白粉病等重要常發(fā)病害以外，還有重茬帶來(lái)的土傳根部病害，輕者引起植株生長(zhǎng)不良，嚴(yán)重時(shí)可造成植株死亡，對(duì)草莓產(chǎn)量影響較大，給草莓種植者造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。目前，草莓土傳病害在全國(guó)的草莓種植區(qū)域逐漸加重。已報(bào)道的草莓根腐病的病原菌已達(dá)20 多種，主要有鐮刀菌屬（Fusarium）[1]、炭疽菌屬（Colletotrichum）、絲核菌屬（Rhizoctoni）a、柱孢菌屬（Cylindrocarpon）、擬盤(pán)多毛孢屬（Pestalotiopsis）等病原真菌。其中，由絲核菌屬病原菌引起的草莓根腐病是影響草莓生產(chǎn)的重要病害之一[2]，嚴(yán)重威脅草莓的生產(chǎn)并減少草莓的經(jīng)濟(jì)效益，此病原菌產(chǎn)生的病害在歐美國(guó)家，如美國(guó)、意大利等國(guó)均有報(bào)道。而中國(guó)對(duì)草莓絲核菌引起的根腐病研究比較少，前期已報(bào)道的絲核菌屬病原菌一般為立枯絲核菌（R.solani）。2016年，鐘珊等[3]首次報(bào)道了絲核菌屬引起的草莓根腐病在中國(guó)北京發(fā)生，其病原真菌菌種為雙核絲核菌（binucleateRhizoctonia）[4]。絲核菌屬種類(lèi)繁多，通過(guò)培養(yǎng)、分離和純化，其在平板上的形態(tài)各有不同，有些形態(tài)很相近，利用形態(tài)學(xué)建立的分類(lèi)系統(tǒng)很難對(duì)該屬進(jìn)行準(zhǔn)確的分類(lèi)鑒定。近年來(lái)，常見(jiàn)的分子生物學(xué)技術(shù)包括單核苷酸多態(tài)性[5]、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA[6]、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性[7]以及簡(jiǎn)單重復(fù)序列分子標(biāo)記[8]等擴(kuò)增技術(shù)逐漸被應(yīng)用于絲核菌屬真菌的分類(lèi)鑒定中。DNA 條形碼鑒定技術(shù)作為一種新興的分子生物學(xué)檢測(cè)手段已得到快速的發(fā)展，該技術(shù)是利用一段相對(duì)較短的標(biāo)準(zhǔn)DNA 序列對(duì)物種進(jìn)行準(zhǔn)確而高效的分子鑒定，而不受物種發(fā)育階段的限制，易擴(kuò)增且具有較強(qiáng)的通用性[9]。通常鑒定使用的多種基因位點(diǎn)包括內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）、細(xì)胞核翻譯延伸因子（EF-1α）、β-微管蛋白（β-tubulin）、線粒體小亞基核糖體（mtSSU）[10-12]等，這些基因已被廣泛用于植物病原真菌中屬及種間的鑒定，目前應(yīng)用最多的是ITS和EF-1α基因[13]，而ITS、GAPDH（磷酸甘油醛脫氫酶）和CAL（鈣調(diào)蛋白）基因常被用于絲核菌屬菌種鑒定。

本研究利用DNA 條形碼鑒定技術(shù)，選取GAPDH、ITS和CAL共3 個(gè)候選基因片段對(duì)2 種絲核菌進(jìn)行檢測(cè)鑒定，將獲得各基因序列的難易程度和種內(nèi)與種間遺傳距離頻率分布作為DNA 條形碼主要的評(píng)價(jià)篩選基因標(biāo)準(zhǔn)，從而篩選出適合于準(zhǔn)確鑒定絲核菌屬的DNA 條形碼基因，最終為絲核菌屬病原菌的分子快速檢測(cè)、分類(lèi)鑒定及其系統(tǒng)發(fā)育研究提供有力的技術(shù)支持，為我國(guó)草莓根腐病其中一種病原真菌的快速鑒定提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

試驗(yàn)菌株：試驗(yàn)中所用的絲核菌株見(jiàn)表1。

表1 絲核菌屬菌株信息Table 1 The strain information of Rhizoctonia

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

DNA 快速提取試劑盒、PCR 擴(kuò)增試劑，生工生物工程（上海）股份有限公司；1×TAE 電泳緩沖液、DL2000 Marker，天根生化科技（北京）有限公司；DHP-9080B 電熱恒溫培養(yǎng)箱，上?，樮帉?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；T100 梯度PCR 擴(kuò)增儀、Power PacBasic 型電泳儀、凝膠成像儀，美國(guó)伯樂(lè)公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株DNA 的提取及PCR 擴(kuò)增

將草莓病株根部分離純化，獲得的菌株置于PDA 培養(yǎng)基上，培養(yǎng)3～5 d，采用真菌基因組提取試劑盒提取各菌株DNA，置于-20 ℃下保存?zhèn)溆谩ａ槍?duì)真菌DNA 條形碼技術(shù)的研究進(jìn)展及絲核菌屬的分子系統(tǒng)分類(lèi)學(xué)研究現(xiàn)狀，本研究共選取了4 對(duì)候選基因序列對(duì)收集的19 株絲核菌屬病原菌進(jìn)行分子生物學(xué)檢測(cè)鑒定，候選基因分別為ITS1/2、ITS1/4、CAL和GAPDH（表2）。25 μL PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系為10×PCR Buffer 溶液、0.5 μL Taq DNA 聚合酶，1.2 μL MgCl2，0.4 μL dNTP，上下游引物（10 μmol/L）各1 μL、1 μL 模板DNA，補(bǔ)ddH2O 至25 μL。擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃總延伸10 min，擴(kuò)增結(jié)束后，置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。采?.0%瓊脂糖進(jìn)行電泳檢測(cè)，PCR 產(chǎn)物由上海生工生物技術(shù)有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序，所有擴(kuò)增出條帶的序列提交至NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)。

表2 本研究所用序列及引物信息Table 2 The information of sequences and primers in this study

1.2.2 候選基因序列的PCR 擴(kuò)增與測(cè)序成功率

目標(biāo)序列獲得的難易程度用PCR 擴(kuò)增與測(cè)序成功率表示，即PCR 擴(kuò)增成功率乘以測(cè)序成功率的乘積。制備濃度為1.5%的瓊脂糖放涼備用進(jìn)行電泳檢測(cè)，取5 μL的PCR 產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，用1×TAE 電泳緩沖液在150 V 的電場(chǎng)下電泳30 min，電泳結(jié)束后，取出凝膠塊置于凝膠成像儀上，觀察照相并分析，電泳條帶單一、明亮、特異性強(qiáng)、大小正確，則認(rèn)為該序列擴(kuò)增成功，可用于后續(xù)測(cè)序，若無(wú)條帶或出現(xiàn)多條亮帶，則是未擴(kuò)增出目標(biāo)條帶或者特異性不強(qiáng)，需要調(diào)整擴(kuò)增條件。

1.2.3 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)建立及遺傳距離分析

將測(cè)序成功的序列用DNAMAN 8 分子生物學(xué)專(zhuān)業(yè)軟件進(jìn)行序列比對(duì)，將比對(duì)后的序列輸入系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)MEGA 5.05 分析軟件，采用鄰接法（neighbor-joining，NJ），并選擇Kimura 雙參數(shù)模型（Kimura2-parameter model，K2P）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，Bootstrap 自展重復(fù)選擇1 000 次。使用MEGA 5.05 軟件以K2P 模型計(jì)算種內(nèi)與種間遺傳距離，從而檢驗(yàn)該物種的種內(nèi)個(gè)體間與種間遺傳變異的差異是否顯著，同時(shí)利用Excel 2007 分析種間遺傳距離頻率分布對(duì)種內(nèi)與種間距離的DNA 條形碼間隙（DNA barcoding gap）進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 候選基因序列PCR 擴(kuò)增與測(cè)序

利用4 個(gè)候選的DNA 條形碼基因ITS、CAL和GAPDH片段對(duì)收集的20 個(gè)菌株進(jìn)行PCR 擴(kuò)增和凝膠電泳檢測(cè)，符合測(cè)序的要求。本試驗(yàn)中有19 個(gè)菌株測(cè)序成功，比對(duì)驗(yàn)證是絲核菌的菌株，包含兩個(gè)菌種，分別為7 個(gè)Ceratobasidium（禾谷絲核菌）和12 個(gè)Rhizoctonia（立枯絲核菌）。3 個(gè)基因中ITS1/2引物PCR 擴(kuò)增與測(cè)序成功率分別為100.0%和92.7%，其序列片段更易獲得，而其余2 個(gè)基因引物PCR 擴(kuò)增率很低。因此最終選擇ITS 基因中的ITS1/2引物序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建和分析。

2.2 絲核菌種內(nèi)與種間遺傳距離頻率分布

采用K2P 參數(shù)模型計(jì)算了絲核菌種內(nèi)和種間遺傳距離，絲核菌ITS基因表現(xiàn)出種內(nèi)與種間遺傳距離的重疊，存在條形碼間隙，重疊少則說(shuō)明能更好地區(qū)分種內(nèi)和種間，而種間遺傳距離大，說(shuō)明種間關(guān)系相距遠(yuǎn)。ITS基因種內(nèi)與種間遺傳距離分別為0～0.35 和0.28～0.54（圖1A）。ITS基因存在種內(nèi)與種間遺傳距離部分重疊（嵌套部分），主要集中在0.28～0.33 之間，其中Rhizoctonia菌種內(nèi)遺傳距離為0～0.35，Ceratobasidium菌種內(nèi)遺傳距離為0～0.28（圖1B），其中Rhizoctonia_sp._isolate_Rh_293_isolate 菌株與其它Rhizoctonia種內(nèi)菌株遺傳距離為0.29～0.35，其種間的遺傳距離小于種內(nèi)遺傳距離，其它絲核菌種間差異明顯大于種內(nèi)的差異，較其它基因能更好地區(qū)分絲核菌，因此將ITS基因作為鑒定絲核菌屬的DNA 條形碼。

圖1 A 候選基因ITS 種內(nèi)和種間遺傳距離的頻率分布比較Fig.1 A Comparison of the frequency distributions intra and interspecific genetic distances for the gene ITS

圖1 B 候選基因ITS 種間遺傳距離的頻率分布比較Fig.1 B Comparison of the frequency distribution in the interspecific genetic distance of the gene ITS within Ceratobasidium species

2.3 基于ITS 基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

將候選基因所得的測(cè)序結(jié)果在GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST 同源性比對(duì)，結(jié)果顯示，各菌株樣品與數(shù)據(jù)庫(kù)中屬、種的相似度大部分在99%以上，2 類(lèi)絲核菌分別為立枯絲核菌（Rhizoctonia）和禾谷絲核菌（Ceratobasidium）。基于ITS基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中，不同菌種的菌株均位于不同的進(jìn)化樹(shù)分支末端，同一個(gè)菌種的菌株都不同程度地聚在一起，兩個(gè)菌種的基因鑒定支持率在96%以上，表明該候選基因的鑒定能力較好。利用鄰接法構(gòu)建的NJ 進(jìn)化樹(shù)由19 條基因序列構(gòu)成（圖2），從聚類(lèi)結(jié)果看，Rhizoctonia和Ceratobasidium分別聚集在兩個(gè)大的進(jìn)化樹(shù)分支上，說(shuō)明ITS基因能夠較好地區(qū)分本研究中的兩個(gè)絲核菌菌種。

圖2 基于ITS 基因序列構(gòu)建的19 株絲核菌屬菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 The constructed phylogenetic tree of 19 Rhizoctonia strains based on ITS gene sequences

為實(shí)現(xiàn)物種快速而準(zhǔn)確地鑒定DNA 條形碼，必須滿(mǎn)足2 個(gè)重要指標(biāo)，首先要有較高的PCR 擴(kuò)增與測(cè)序成功率，其次要有較好的種內(nèi)與種間遺傳距離頻率分布。本研究結(jié)果中，ITS基因片段（ITS1與ITS2引物擴(kuò)增出的序列）具備了較高的PCR 擴(kuò)增與測(cè)序成功率92.7%，相對(duì)于其它3 個(gè)基因片段，擴(kuò)增效率高，且種內(nèi)與種間遺傳距離重疊部分較少，除立枯絲核菌種內(nèi)遺傳距離大于立枯絲核菌和雙絲核菌的種間遺傳距離外，其余絲核菌種內(nèi)差異明顯小于種間差異，該基因片段能將絲核菌屬菌種更好地區(qū)分開(kāi)，因此選擇ITS基因片段進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析。本研究中，基于ITS片段構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，大部分相同種聚集在同一分支，不同種劃分在不同分支，鑒別能力較好，并且支持率多數(shù)達(dá)到96%以上；在3 個(gè)候選基因中，ITS基因（ITS1/2引物）較其它候選片段更適宜作為絲核菌屬DNA 條形碼。

3 討論

草莓根腐病病原菌較多，其中絲核菌是引起該病的重要病原菌。由絲核菌引起的是重要的草莓根部病害之一。研究報(bào)道，絲核菌屬可被分為單核、雙核和多核絲核菌不同類(lèi)群。在國(guó)外，引起草莓根腐病的多數(shù)為雙核絲核菌和多核絲核菌[14-17]。與草莓根腐病有關(guān)的多核絲核菌為立枯絲核菌（R.solani）。國(guó)內(nèi)對(duì)草莓絲核菌根腐病的報(bào)道有限，在東北和華北地區(qū)發(fā)現(xiàn)的與草莓根腐病有關(guān)的絲核菌均為立枯絲核菌（R.solani）[18]。近幾年，對(duì)于草莓病害的鑒定中發(fā)現(xiàn)，絲核菌也是引起新疆草莓病害的主要病原菌之一，其癥狀與其它草莓根腐病相似。因此，精準(zhǔn)鑒定病原菌種類(lèi)對(duì)后期針對(duì)性治療草莓根腐病有重要意義。

近幾年，很多研究學(xué)者利用DNA 條形碼鑒定技術(shù)對(duì)病原菌分類(lèi)系統(tǒng)發(fā)育展開(kāi)研究，而對(duì)于絲核菌的鑒定多基于形態(tài)學(xué)、菌絲細(xì)胞核熒光染色、菌絲融合群測(cè)定、不同基因序列分析和柯赫氏法則驗(yàn)證，但該方法不僅檢測(cè)程序復(fù)雜，而且不能確保一次性準(zhǔn)確判斷菌種的歸類(lèi)。本項(xiàng)目通過(guò)不同基因驗(yàn)證，篩選出一個(gè)較為合適的ITS基因序列鑒定絲核菌屬。

ITS序列因其片段較短、物種間變異性強(qiáng)易擴(kuò)增測(cè)序等優(yōu)點(diǎn)被廣泛用于真菌的分類(lèi)研究，并在2011 年國(guó)際真菌DNA 條形碼工作會(huì)議上確定ITS為真菌的通用條形碼。本研究對(duì)于ITS基因的兩個(gè)片段采用不同引物進(jìn)行擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)常用的ITS1/4引物擴(kuò)增效果不佳，而ITS1/2引物擴(kuò)增效率較好，這與很多科研工作者將ITS 作為真菌的通用鑒定基因一致[19]。在已有的關(guān)于絲核菌類(lèi)鑒定的報(bào)道中，ITS基因可對(duì)大多數(shù)絲核菌進(jìn)行鑒定，但大部分采用的是ITS1/4引物，且鑒定的是一個(gè)種[19]。通過(guò)研究多條序列對(duì)絲核菌屬的鑒定能力，得出ITS 基因比其它基因更有利于絲核菌的分類(lèi)鑒定。對(duì)于某些絲核菌，ITS1/4基因也有其優(yōu)勢(shì)，如能成功鑒定引起草莓絲核菌根腐病的雙核絲核菌AG-A 融合群，但不能將立枯絲核菌和雙絲核菌區(qū)分開(kāi)。此外，本項(xiàng)目中絲核菌屬菌株有限，在以后的工作中，還需補(bǔ)充絲核菌菌種的菌源進(jìn)一步驗(yàn)證ITS基因的鑒定能力或?qū)ふ倚碌幕蚱我约岸嗷蚵?lián)合鑒定的方法。