朱志文，黃海麗

（廣東醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 肝膽外科研究所，廣東 湛江 524001）

肝臟是人體物質(zhì)代謝和能量轉(zhuǎn)換的樞紐，是維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定最重要的器官，兼具代謝、分泌、解毒和造血等多種功能，此外，肝臟還是膽汁生成的唯一場所。一般認為，肝臟的基本結(jié)構(gòu)單位是肝小葉，其由60%～70%的肝細胞以及30%～40%的非實質(zhì)細胞（non-parenchymal cell，NPC）組成，膽管上皮細胞（biliary epithelial cell，BEC）作為肝臟內(nèi)的一種NPC，參與肝臟的正常生理過程[1]。近年來，隨著我國人民生活水平的提高和飲食習慣的改變，肝臟疾病的發(fā)病率逐年提高，急慢性肝損傷、膽汁淤積性肝病、酒精性肝炎、肝纖維化和肝臟腫瘤等各種難治性肝病，嚴重影響著人們的健康[2]。隨著研究的逐步深入，發(fā)現(xiàn)BEC在各種肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色。本文就BEC的生理學特點及其與肝臟疾病相關性的研究進展進行綜述。

1 BEC的生理學特點

1.1 BEC的基本結(jié)構(gòu)形態(tài)

BEC是單層排列在肝內(nèi)膽管樹的一種上皮細胞，占肝臟細胞總數(shù)的3%～5%，肝內(nèi)膽管相互交錯形成一個復雜的三維導管網(wǎng)絡。相較于其他上皮細胞，BEC在功能上具有異質(zhì)性，大的BEC主要參與膽汁分泌的調(diào)節(jié)，小的BEC具有促增殖能力[3]。BEC具有頂膜和基底外側(cè)膜，從其頂膜延伸出來的微絨毛和初級纖毛具有特征性，微絨毛使細胞表面積增加了5倍，初級纖毛能感受機械、化學刺激以及滲透壓的改變，是維持膽管細胞穩(wěn)態(tài)的關鍵[4]。BEC的肌動蛋白細胞骨架，有助于維持膜張力、穩(wěn)定細胞形態(tài)和調(diào)節(jié)囊泡運輸，研究發(fā)現(xiàn)，以肌動蛋白細胞骨架為靶點的治療，能夠改善囊性纖維化相關的自身免疫性肝病的治療效果[5]。

1.2 BEC的基本功能特性

1.2.1 分泌與吸收：BEC的頂膜和基底外側(cè)膜存在不同的離子載體和通道，分泌和吸收各種物質(zhì)。BEC主要分泌物之一是膽汁，占膽汁總排出量的40%，其在膽汁生成中至關重要，膽汁的分泌主要由BEC頂膜上Cl-通道開放和膽汁酸轉(zhuǎn)運蛋白所引起。另一主要分泌物是HCO3-，膽汁中的碳酸氫鹽形成一個堿性的“碳酸氫根傘”保護屏障，起到堿化膽汁酸和維持滲透壓等作用[4]。此外，BEC還可以吸收膽汁酸、葡萄糖、氨基酸、水和各種離子，通過相關的轉(zhuǎn)運蛋白和通道蛋白實現(xiàn)雙向運輸。這些復雜的分泌與吸收過程，受到細胞內(nèi)多種信號途徑和級聯(lián)反應的共同調(diào)節(jié)[3-4]。

1.2.2 炎癥與修復：BEC參與肝臟損傷引起的炎癥和修復反應，表現(xiàn)出不同程度的膽汁淤積、增殖、凋亡、纖維化甚至惡性轉(zhuǎn)化[6]。BEC經(jīng)各種損傷激活，可分泌多種細胞因子和趨化因子，包括轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素-6（interleukin-6，IL-6）、IL-8、CCL2、血小板源性生長因子-B（platelet derived growth factor-B，PDGF-B）等[6-7]，這些因子會以自分泌和旁分泌的方式參與炎癥反應，致使BEC增殖、凋亡和衰老。隨著炎癥反應加劇，受損膽管周圍瘢痕組織過度沉積，引發(fā)病理性修復反應，此類現(xiàn)象稱為膽管反應（ductal reaction，DR）。DR由多種信號通路介導，但DR持續(xù)發(fā)展最終會導致肝纖維化和肝硬化[8]。

1.2.3 肝臟再生：當成熟肝細胞嚴重受損失去增殖能力時，會激活肝細胞和BEC互為“兼性干細胞”的替代機制，即膽管來源的BEC可以轉(zhuǎn)化為肝實質(zhì)細胞，肝細胞亦可轉(zhuǎn)化為BEC，這有助于肝臟再生[9]。研究證實，在斑馬魚等低等脊椎動物中，肝細胞大量受損失去再增殖能力后，肝再生幾乎都是由BEC轉(zhuǎn)化為肝細胞得以實現(xiàn)[10]。Raven等[11]設計了兩種小鼠肝損傷模型，整合素-β1（integrin-β1，ITGB1）丟失導致肝細胞壞死和P21 基因過表達抑制肝細胞增殖，發(fā)現(xiàn)在兩種模型中都觸發(fā)了膽管反應，并且在肝損傷期間出現(xiàn)大量BEC來源的肝細胞，表明在哺乳動物中，BEC同樣對肝實質(zhì)再生做出貢獻。

1.2.4 免疫生物學：BEC擁有復雜的免疫機制，是肝臟免疫調(diào)節(jié)的重要組成部分，BEC在未被激活狀態(tài)下，分泌包含IgA在內(nèi)的多種抗菌蛋白，具有潛在的抗菌作用和免疫功能。BEC表達的Toll樣受體（toll-like receptors，TLRs），在識別抗原后會分泌抗菌蛋白、炎癥性細胞因子和黏附分子[12]。此外，Schrumpf等[13]收集了BEC提呈抗原并激活自然殺傷T細胞（natural killer T cells，NKT）的證據(jù)，證實BEC通過表達CD1d向NKT細胞呈遞脂質(zhì)抗原，從而激活NKT細胞。同時，BEC作為抗原呈遞細胞還可表達人類白細胞抗原（human leukocyte antigen，HLA），促進免疫反應的定位[4]。當BEC被各種損傷激活后，會分泌TNF-α、干擾素-γ（Interferon-γ，IFN-γ）、IL-6、IL-8、CCL2、CXCL16、HLA等參與免疫調(diào)控[7]。

2 BEC與肝臟疾病相關性

2.1 BEC與肝臟損傷

在各種因素刺激下，包括外傷、感染、膽汁淤積、藥物、酒精等，都會使肝細胞發(fā)生急性或慢性損失，造成肝損傷。在嚴重的慢性肝損傷中，肝再生能力受限，肝臟正常的結(jié)構(gòu)和功能無法完全恢復，此時NPCs來源的肝再生途徑，如BEC會在慢性肝損傷過程中發(fā)揮重要作用[14]。

為探究BEC在肝損傷中的增殖模式，Kamimoto等[15]采用三維成像技術追蹤BEC，并結(jié)合數(shù)學模擬，發(fā)現(xiàn)BEC在肝損傷中會發(fā)生形態(tài)和表型的劇烈變化，這些變化實質(zhì)上是BEC的大量增殖，并且這種增殖狀態(tài)具有異質(zhì)性和隨機性。Raven等[11]設計了兩套獨立模型來模擬肝細胞增殖受抑制，首次確定在短期的嚴重肝損傷過程中，BEC顯著再生肝細胞。而在長期肝損傷模型中，Deng等[16]發(fā)現(xiàn)BEC衍生的肝細胞補充了大部分肝實質(zhì)，并在門靜脈周圍和纖維隔中獲得獨特的Hnf4α+CK19+雙表型狀態(tài)。之前的研究已表明，Wnt信號以β-catenin依賴和非依賴的方式調(diào)節(jié)膽汁淤積性損傷后的肝膽修復[17]。Russell等[18]發(fā)現(xiàn)在肝細胞β-catenin缺失使肝臟增殖受損的情況下，會促進BEC轉(zhuǎn)化為肝細胞，BEC來源的肝細胞可以永久性地整合到肝實質(zhì)中并介導肝再生。

在上述肝損傷過程中都觸發(fā)了DR，且DR程度與肝損傷程度呈正相關。然而，DR作為一種病理性修復反應，在肝損傷再生過程中的作用尚有爭議[19]。在四氯化碳誘導的慢性肝損傷過程中發(fā)現(xiàn)，有高達12%的新生肝細胞來源于DR細胞分化，而不是來自未損傷的肝細胞復制，這些新形成的肝細胞具有更好的增殖能力以及更高效的DNA修復能力[20]。BEC中的YAP和mTORC1 信號通路是觸發(fā)DR這一過程所必需的，而非LGR4/5介導的Wnt/β-catenin信號通路[21]。以上發(fā)現(xiàn)證明了BEC是肝再生途徑的重要來源之一。

2.2 BEC與膽汁淤積性肝病

膽汁淤積性肝病（cholestatic liver diseases，CLD），是由各種原因引起的膽汁生成、分泌和排泄障礙，進而引發(fā)膽汁淤積和炎癥反應，最終導致膽管和肝細胞損傷，CLD最常見的類型包括原發(fā)性膽汁性膽管炎（primary biliary cholangitis，PBC）和原發(fā)性硬化性膽管炎（primary sclerosing cholangitis，PSC）[22]。

CLD的發(fā)病機制包括DR、膽汁毒性和線粒體功能障礙，BEC作為膽汁流量和成分的主要調(diào)節(jié)者，與CLD的發(fā)生發(fā)展有緊密聯(lián)系。頂端連接復合體（apical junctional complexes，AJCs），如緊密連接和黏附連接，可在肝實質(zhì)和膽汁毒物之間形成一道保護性物理屏障，AJC受到BEC表達的維生素D核受體（vitamin D nuclear receptor，VDR）的調(diào)節(jié)，研究表明當VDR缺乏時，AJC完整性的缺失會導致膽管結(jié)構(gòu)缺陷[23]。同時，細胞衰老、缺氧以及膽汁毒性會誘導BEC大量表達賴氨酰氧化酶樣蛋白2（lysyl oxidase-like protein 2，LOXL2），LOXL2對BEC的屏障功能產(chǎn)生負性調(diào)節(jié)，促進PSC患者的肝損傷[24]。應激性保護蛋白角蛋白19，在BEC和肝祖細胞中廣泛表達，其丟失會導致BEC角蛋白網(wǎng)絡重新分布并減弱DR細胞增殖，有利于CLD的發(fā)生[25]。另外，BEC表達的鞘氨醇1-磷酸受體2（sphingosine 1-phosphate receptor2，S1PR2），具有調(diào)節(jié)多種細胞增殖的功能，S1PR2的激活會進一步激活ERK1/2和AKT信號級聯(lián)，進而促進炎癥反應和BEC增殖[26]。在PBC和PSC患者中還發(fā)現(xiàn)，BEC中的微小核糖核酸506（miR-506）過表達，可增加BEC對膽汁的敏感度，造成線粒體功能障礙，最終導致PBC和PSC的免疫激活[27]。

BEC在CLD中亦發(fā)揮積極作用。法尼醇X受體（farnesoid X receptor，F(xiàn)XR）在BEC中廣泛分布，是平衡膽汁酸的主要調(diào)節(jié)因子，BEC表達的β-catenin與FXR相互作用，形成一種物理復合體，調(diào)節(jié)膽汁酸的合成和轉(zhuǎn)運，進而減輕膽汁酸毒性對肝臟的損傷[28]。此外，G蛋白偶聯(lián)的膽汁酸受體TGR5，已被證實在氯化物分泌、BEC增殖和膽囊充盈中發(fā)揮作用，TGR5通過影響連接黏附分子A的表達和磷酸化，調(diào)控BEC的細胞旁通透性，以刺激增強膽管上皮屏障功能[29]，同時，BEC也自發(fā)表達緊密連接蛋白2（tight junction protein 2，Tjp2），Tjp2對膽汁-血液屏障的建立至關重要[30]，故兩者都可在一定程度上減輕膽汁淤積造成的損傷。近期在對PSC和PBC的研究中又發(fā)現(xiàn)，通過沉默BEC來源的TGF-β2，能夠有效改善膽源性肝損傷[31]。BEC在CLD中的促損傷和修復作用正逐步被揭示，深入對其分子機制的研究，將有望開拓更多前瞻性治療靶點。

2.3 BEC與酒精性肝炎

酒精性肝炎（alcoholic hepatitis，AH），是一種慢性肝臟炎癥，具有顯著的發(fā)病率和病死率，AH由長期大量酗酒導致的酒精性肝?。╝lcoholic liver disease，ALD）發(fā)展而來，初期常為脂肪肝表現(xiàn)，后期逐步發(fā)展為肝纖維化和肝硬化[32]。AH的發(fā)病機制涉及多種因素，包括酒精及其代謝產(chǎn)物引起的肝細胞損傷、膽汁淤積、促炎因子的募集和激活。BEC在AH發(fā)展過程中發(fā)揮作用與中性粒細胞有密切聯(lián)系，DR是慢性肝病的一大特征，然而AH也不例外，DR在AH中促進炎癥反應發(fā)展是通過募集中性粒細胞和趨化因子實現(xiàn)的[33]，募集到的中性粒細胞可與BEC上的整合素-β1（ITGB1）相結(jié)合，降低3型肌醇1，4，5-三磷酸受體（type 3 inositol 1，4，5-trisphosphate receptor，ITPR3）的表達（ITPR3是BEC中主要的Ca2+釋放通道，影響碳酸氫鹽分泌），導致AH中的膽汁淤積性改變[34-35]。此外，AH患者的BEC中高表達成纖維細胞生長因子19（fibroblast growth factor 19，F(xiàn)GF19），并且FGF19隨AH加重而表達增加，F(xiàn)GF19 在與其受體結(jié)合后，可導致膽汁酸合成限速酶——膽固醇7α-羥化酶基因表達下調(diào)，抑制膽汁酸合成，從而起到一定的保護作用[36]。由此可見，BEC在AH發(fā)生發(fā)展過程中扮演的角色是不容忽視的，這對于理解驅(qū)動AH的潛在機制和開發(fā)新的生物標志物及靶向治療有重要意義。

2.4 BEC與肝纖維化

肝纖維化通常歸因于各種慢性肝病，是一種與愈合機制相關的復雜病理生理過程，其終末階段肝硬化有著高發(fā)病率和病死率。肝纖維化過程涉及多種細胞機制，其中BEC相關的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）和膽管反應（DR）發(fā)揮重要作用[37]。

EMT在組織器官發(fā)育和胚胎發(fā)生中起著至關重要的作用，肝臟中的上皮細胞通過EMT會失去其典型的極性和黏附特性，獲得成纖維細胞表型，并大量表達EMT相關蛋白，促進纖維化形成。Omenetti等[38]提供了Hedgehog信號通路介導的BEC-EMT促進肝纖維化的直接證據(jù)。在對原發(fā)性膽汁性肝硬化患者的研究中發(fā)現(xiàn)，IL-17A誘導的BEC-EMT參與了該疾病的發(fā)病過程，IL-7A可能在體外誘導BEC發(fā)生成纖維細胞樣的形態(tài)學變化[39]。Tang等[40]結(jié)果表明，敲除Toll樣受體4（TLR4）基因后可抑制核因子kB（nuclear factor-kB，NF-kB）信號通路，進而抑制BEC-EMT，他汀類藥物也可通過下調(diào)TLR4 和NFkB抑制LPS或TGF-β1誘導的BEC-EMT[41]。

DR的特征是包括BEC在內(nèi)的細胞增殖，膽管反應細胞（ductal reaction cells，DRCs）在向肝臟募集免疫細胞、促進炎癥和纖維化的微環(huán)境方面發(fā)揮關鍵作用。在PSC發(fā)展過程中，DRC可以通過分泌各種炎癥因子來改變膽管周圍的微環(huán)境，導致基質(zhì)中免疫細胞和成纖維細胞募集和活化，從而啟動和維持肝臟炎癥和促纖維化反應[42]。研究表明，非經(jīng)典型NF-kB信號通路及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子RELB是引發(fā)DR的核心介質(zhì)，RELB在健康肝臟中是非必需的，但在慢性肝病中會被激活，抑制BEC中RELB基因的表達，將有助于改善肝纖維化[43]。最新的研究結(jié)果也指出，當髓細胞白血病因子1（myeloid cell leukemia 1，MCL1）受抑制時會誘導DRC發(fā)生凋亡，因此，通過MCL1 介導的DRC靶向凋亡，可有效減少膽汁淤積性肝纖維化[44]。此外，降低TGF-β1和IL-13的表達，也可抑制BEC增殖和成纖維細胞的活化[19]。因此，BEC相關的EMT和DR，可能是肝纖維化的一種潛在的治療靶點。

2.5 BEC與肝內(nèi)膽管癌

肝內(nèi)膽管癌（intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC）是來自于肝內(nèi)膽管上皮的惡性腫瘤，可由多種疾病或因素導致，約占原發(fā)性肝癌的10%～15%，其病死率在肝臟原發(fā)惡性腫瘤中排名第二，僅次于肝細胞肝癌。ICC被認為有多種細胞來源，如肝內(nèi)BEC、分化的肝細胞和肝祖細胞等多能干細胞[45]。Guest等[46]使用細胞譜系追蹤系統(tǒng)來定位膽管上皮p53缺失，表明在慢性炎癥和p53缺失的情況下，肝內(nèi)BEC是ICC的起源細胞。鑒于Notch信號通路參與BEC分化和膽管發(fā)育，也有研究發(fā)現(xiàn)成熟肝細胞也具有向ICC轉(zhuǎn)化的潛力，并且這一過程依賴于細胞內(nèi)Notch信號通路的激活[47]。

ICC有著復雜的分子機制，近年來發(fā)現(xiàn)，BEC中的miRNA失調(diào)以及DNA甲基化對ICC發(fā)生發(fā)展做出重要貢獻。例如誘導miR-21過表達，可間接增加ICC細胞的增殖和侵襲性[48]；miR-200相關的ICCEMT與腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移有密切聯(lián)系[49]。初級纖毛對BEC內(nèi)穩(wěn)態(tài)有重要意義，有分析指出，miR-22 和miR-433 在BEC內(nèi)表達下調(diào)，可導致組蛋白去乙?；? 過表達介導的纖毛喪失，從而增加ICC的惡性程度，因此恢復相關miRNA的表達，將是減緩ICC進展的潛在途徑[50]。轉(zhuǎn)錄因子SOX17是調(diào)節(jié)BEC分化過程和維持膽管表型的關鍵因子，并被鑒定為ICC中的有效腫瘤抑制物，在慢性炎癥中，通過啟動子甲基化依賴機制下調(diào)BEC中SOX17 的表達，可提高BEC的致瘤能力，促進BEC向ICC轉(zhuǎn)化[51]。但據(jù)最新報道，由SOX17 刺激表達的張力蛋白-4，在ICC中有促進腫瘤進展作用，因此SOX17在作為腫瘤抑制因子同時不排除其對腫瘤進展的貢獻[52]。目前，關于BEC在ICC中發(fā)揮作用的分子機制還知之甚少，鑒于ICC仍缺乏有效的非手術治療手段，從分子途徑對ICC的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生影響，有望成為新的治療方向。

3 結(jié)語

BEC在肝臟疾病中發(fā)揮重要作用，近年來，隨著各種難治性肝臟疾病的研究不斷深入，BEC與肝臟疾病發(fā)展的相關性研究越發(fā)成為焦點，各方面進展不斷被更新報道，取得重大突破。目前可以確定，BEC參與各種肝臟疾病進程中均涉及到DR，然而DR作為眾多BEC相關的肝臟疾病的中心事件，仍有許多問題等待解決，其相關的分子機制仍未被完全闡明。但值得肯定的是，以BEC為靶點的治療策略，將為各種難治性肝病的臨床治療提供更多方向。