梅澍 荊曉 何貴山

甘肅省腫瘤醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050

PCR實驗又稱基因擴增實驗，通過體外模擬DNA復制過程對病毒體內的基因進行擴增，能夠檢測出含量不高的病毒，PCR靈敏度和特異性高，臨床上常用來檢驗病毒感染性疾病，如艾滋病、乙型肝炎、高致病性呼吸道病毒等的一種重要檢測方法，也逐漸廣泛應用于腫瘤靶向、生殖遺傳等領域[1-2］。隨著近年來高致病性呼吸道病毒的暴發(fā)，檢測的需求大幅增加，國家加大PCR實驗室的建設。PCR實驗室屬于醫(yī)學生物安全二級實驗室（BSL-2），目前PCR實驗室大多數按加強型醫(yī)學BSL-2實驗室建設，對于實驗室建設標準相關部門和組織設置了技術要求和指標[3］，從2020年4月至2021年8月，僅甘肅省的PCR檢測實驗室從46家增至288家。實驗室大規(guī)模的建設，雖然大大提高了檢測能力，但在運行過程中諸多因素會對實驗室造成影響。部分實驗室受空間及建筑格局限制，普遍存在人流、物流、標本不能完全實現分流或單一流向的問題[4］。實驗室檢驗人員對實驗室負壓的運行原理及可能產生的危險因素認識不足、培訓不到位等，都可能帶來生物安全隱患。

1 PCR實驗室在運行過程中存在的隱患對實驗室的影響

1.1 新風過濾系統(tǒng)對實驗室的影響 氣流控制是生物安全實驗室控制的核心，主要包括對氣體流速、流量、壓力的檢測和控制。特別是加強型醫(yī)學BSL-2實驗室，是在普通型醫(yī)學BSL-2實驗室的基礎之上增加了負壓，有明確的壓力梯度要求，設置機械通風系統(tǒng)、高效排風過濾系統(tǒng)等，該系統(tǒng)要控制送排風比例，維持各房間的負壓要求，以保證實驗室內的氣流由清潔區(qū)流向污染區(qū)的定向流動[5］。實驗室內空氣需經過高效過濾后排出，防止實驗室內的生物污染外泄，以保證實驗室周圍環(huán)境的安全[3，6］。

目前PCR實驗室大部分采用機械通風裝置，新風通過初效、中效、高效三級過濾送入實驗室，其中初效和中效過濾器可以起到預過濾的作用，進而能夠延長高效過濾器的使用壽命。初、中效過濾器一般3至6個月更換一次，高效過濾器的更換頻率根據具體使用情況而定[7］。而在西北地區(qū)，容易出現浮塵甚至是沙塵暴天氣，導致送風系統(tǒng)或排風系統(tǒng)初級過濾器被堵塞。當進風系統(tǒng)壓力降低時，導致氣流不能定向流動，樣品制備間的生物污染因子進入緩沖間后，進而向清潔區(qū)擴散，當排風系統(tǒng)過濾器被堵塞后，生物污染因子不能被有效地過濾，會導致實驗室污染風險。

實驗室核心工作間沒有獨立排風口，僅利用生物安全柜等其他負壓排風裝置代替室內排風口，一旦設備操作不當或發(fā)生故障，可能導致室內氣壓或氣流逆轉。核心工作間送風口、排風口的位置也可以影響氣流流動的方向，風口設置可采用對側上送下排的方式。另外，實驗室內設備的擺放位置也可能成為氣流流動過程中的障礙。

1.2 壓力梯度設置對實驗室的影響 負壓實驗室的生物安全防護性能高于常壓狀態(tài)實驗室[8］，臨床上PCR實驗室常用來檢測致病性病毒，實驗室應為負壓以確保生物安全。PCR實驗室存在兩類壓差控制：一類是各個實驗區(qū)之間的壓差，保證氣流的單向流動，避免因不慎同時開啟兩扇門時的氣流逆轉；另一類是每個實驗區(qū)、緩沖間、專用走廊之間的壓差，保證每個實驗區(qū)域各自氣流的獨立性，避免受到共用通道的影響。

根據生物安全實驗室設計的要求，實驗室間的壓差應在10pa，因此設計與運行時應按>15Pa設置，才能保證負壓實驗室的壓力自清潔區(qū)至污染區(qū)逐區(qū)降低。雖然部分實驗室將壓差設計成了10pa，而壓強的正常漂移可為±5Pa，因此，標本處理間和擴增間壓差可能會低于10Pa甚至為5Pa，壓差太小，標本處理間和擴增間未形成壓力梯度，甚至各緩沖間沒有壓差，實驗室內的氣流不能由清潔區(qū)向污染區(qū)定向流動，具有較大的生物擴散隱患[9］。

1.3 實驗分區(qū)設置對實驗室的影響 由于目前很多實驗室是在原有房屋基礎上改建的實驗室，新改建的實驗室因場地限制，沒有達到真正意義的三分區(qū)，缺少緩沖區(qū)，采用內部公用走廊與實驗區(qū)直接連接，當實驗室門開啟時，由于溫差、門的卷吸和人的裹帶作用，必然會產生實驗室內空氣外泄，會引起短時間、大風量的室內外空氣交換，產生交叉污染[5］。

1.4 生物安全柜選擇使用不當對實驗室影響 生物安全柜作為一級屏障，是PCR實驗室的核心設備。PCR實驗室需要配備二級生物安全柜，并有獨立的通風系統(tǒng)[10］。生物安全柜的操作窗口吸入氣流的方向應與房間氣流方向一致。送風口位置不應設置在操作人員的正上方和有氣溶膠產生的上方，防止含有病原微生物的氣溶膠擴散造成污染。通風系統(tǒng)能有效地保證生物安全柜與實驗室的壓力平衡。生物安全柜的工作原理是保持安全柜內的負壓，讓氣流從外部進入安全柜，同時其循環(huán)風和排風經過高效過濾器過濾，既阻止柜內的病原微生物溢出，又能保護實驗室環(huán)境和實驗操作者。當送風系統(tǒng)故障時，壓力平衡被破壞，生物安全柜所在的樣品制備室的負壓，加上生物柜內的負壓，會造成壓力疊加，讓樣品制備間成為高負壓狀態(tài)。這種情況在使用全排式B2型生物安全柜的實驗室更加突出。這時樣品制備室的壓力小于PCR擴增室，致使污染因子倒灌入制備間，在室內聚集漂浮，不能及時排除室外，引起嚴重的安全隱患。

部分實驗室操作人員對生物安全柜的使用不當，實驗操作過程動作幅度太大引起壓力波動，如當壓力未達到穩(wěn)定要求時開始實驗操作，快速拉起或關閉窗口玻璃而引起瞬時的風量巨變，會對實驗人員造成嚴重的生物安全隱患。

1.5 實驗室洗手設備不合理對實驗室影響 部分實驗室洗手池排水沒有獨立的排水系統(tǒng)，并且采用直排方式，沒有防回流設計。負壓實驗室壓力小于排水管壓力，會造成污水倒吸，管道內的污染因子也會因倒灌漂浮在室內，造成安全隱患。

1.6 消毒不及時對實驗室影響 由于PCR實驗強大的擴增能力和極高的敏感性，極微量的污染都會出現假陽性，所以防止污染的發(fā)生是一個不容忽視的問題[11］。近來，檢測需求量大，檢測任務重，實驗室常常處于超負荷運行狀態(tài)，甚至是24小時運轉，無法停止實驗進行及時嚴格消毒，大大增加了實驗室污染的機會。

2 PCR實驗室生物安全問題的解決措施

2.1 對實驗室設計、維護工程師規(guī)范化培訓 在進入實驗室前應有建筑設計及暖通工程師對實驗室的運行原理做培訓，一定要模擬在不同的通風及排風狀況時出現的壓力變化對實驗室造成的影響，避免因壓力變化可能產生的生物危險因素。如果因沙塵天氣導致濾膜堵塞，應及時更換初級濾膜。

排風管道是負壓狀態(tài)，也有可能被致病因子污染，要定期進行消毒處理[3］。實驗室內設備的擺放應注意是否影響氣流流動，應利于氣流由清潔區(qū)向污染區(qū)的流動，最大限度減少室內渦流與回流。

2.2 對實驗室檢驗人員規(guī)范化培訓 增強實驗室檢驗人員的生物安全意識和基本操作技能是實驗室生物安全管理中的一項重要內容，尤其針對高致病性病毒的檢測，實驗室更應該具備完善的操作規(guī)程、儀器設備使用章程、生物安全培訓、應急處置流程等方面的培訓。另外，還應該對實驗室的設置及運行原理、負壓實驗室的概念、壓力差的設置、壓力表的應用等方面進行規(guī)范化培訓，使實驗室檢驗人員對整個實驗室的情況都能熟練掌握。

要求實驗操作人員認真觀察記錄壓力變化，將被動的記錄實驗室壓力變?yōu)橹鲃拥挠^察壓力，及時發(fā)現壓力表的異常變化，在實驗室壓差不夠的情況下能熟練調節(jié)壓力表，使每間實驗室的壓差保持在合理的范圍內。實驗室人員要充分意識到壓力表裝錯、不調零、壓力差不達標等問題所造成嚴重后果。當壓力發(fā)生變化時應停止實驗，查找原因，排除故障，避免因此造成的生物安全隱患。

2.3 加強人員個人防護，規(guī)范工作流程 根據不同病毒的生物安全危害要求，實驗室應建立不同等級的個人防護用品使用和管理規(guī)范，使用符合相關標準的個人防護用品。實驗室管理人員應定期對防護用品的儲備、有效期等進行檢查和監(jiān)督管理。

對缺少緩沖間的實驗室，人員進入實驗室要嚴格執(zhí)行三級實驗室防護制度。待氣壓穩(wěn)定后再進入實驗室，進入實驗室后應在5分鐘后等氣壓穩(wěn)定時再開始實驗。在實驗過程中絕對不允許擅自開門。操作結束后，應讓生物安全柜繼續(xù)運行至少3min來完成柜內空氣凈化過程[12］，再打開實驗室門。

2.4 正確選擇和規(guī)范使用生物安全柜 在實驗過程不涉及有機溶劑或無特殊氣體需要全排情況下，建議PCR實驗室優(yōu)先選擇A2型生物安全柜[5］。在實際操作過程中，生物安全柜應當始終保持一定的排風量，保證生物安全柜系統(tǒng)的穩(wěn)定性。實驗室檢驗人員應熟練掌握生物安全柜的原理、操作規(guī)范、操作技能，物品擺放原則，操作過程中做到操作緩慢，移動物品時避免交叉污染，避免震動引起的壓力波動。

在生物安全柜整個啟閉過程中，每一項操作保證相對緩慢、平穩(wěn)地進行，使壓力波動適當地控制在一個可接受的范圍內。如果啟閉時間足夠長，波動風量帶來的壓差影響會慢慢被抵消，則系統(tǒng)穩(wěn)定性將大大提高。實驗室應當制定嚴格的操作規(guī)程，盡量避免由于快速拉起或關閉窗口而引起瞬時的風量巨變。

2.5 實驗室洗手設備的改進 負壓實驗室洗手池龍頭應是免接觸型的，防護區(qū)的給水管道應設置倒流防止器或其他有效地防止回流污染的裝置，并且應設在輔助工作區(qū)；給排水系統(tǒng)應不滲漏，下水應有防回流設計，所有圍護結構表面除同BSL-2外，縫隙均應密封。實驗室的工作區(qū)還應配備洗眼裝置。

2.6 實驗室嚴格消毒 實驗室必須做好嚴格的清潔消毒工作。對生物安全柜應當定期進行檢測、清潔消毒與保養(yǎng)。每日實驗前、實驗結束后，按照要求對實驗室進行嚴格徹底的清潔消毒，防止實驗室污染的發(fā)生。

在實驗室滿負荷運行的情況下，更應該按要求對實驗室進行嚴格消毒。PCR實驗前應用75%乙醇對試劑準備區(qū)及標本制備區(qū)生物安全柜和臺面進行消毒后再用紫外線照射30min，然后打開生物安全柜風機運行15~30min，等生物安全柜內形成穩(wěn)定且潔凈的氣流循環(huán)后開始實驗。

3 小結

呼吸道病毒暴發(fā)以后，對實驗室的生物安全的重視程度有了很大的提高[13］。近兩年，實驗室的生物安全又提到了新的高度。疫情防控常態(tài)化階段，PCR實驗檢測工作是疫情防控重要的技術支撐。健全的實驗室生物安全體系是確保PCR實驗室穩(wěn)定、高效、安全運行的前提條件和重要保障。針對目前各個實驗室存在的問題，實驗室在設計設置、人員培訓、管理監(jiān)督等方面還需要進一步的完善和加強，各實驗室對人員、設備和物資儲備方案仍需進一步細化，應急預案還有待進一步完善。

目前根據疫情防控需求，國內大量PCR實驗室投入使用，許多醫(yī)院是改建的PCR實驗室，部分實驗室分區(qū)設置不合理，實驗室存在人流、氣流、標本流不能實現單向流動，壓力梯度不合格，實驗室分散，監(jiān)管困難等現況。其次，人員培訓管理不到位，操作不規(guī)范，尤其是新建實驗室底子薄，新入崗的實驗人員生物安全意識薄弱，專業(yè)知識技能還有待提高。為保證實驗室環(huán)境及檢測人員的安全，建議將實驗室的運行安全納入生物安全管理手冊，并對實驗室進行不定期檢查及監(jiān)管。各地區(qū)應高度重視PCR實驗室的建設和管理，保證實驗室設備儀器的配備和專業(yè)檢測人員的儲備，確保人員安全和實驗室安全，為疫情防控做好保障。

面對PCR實驗室地域上分散，監(jiān)管難度大，建議各地區(qū)將PCR實驗室聯(lián)網并納入統(tǒng)一管理，創(chuàng)建智能化、信息化管理的監(jiān)管平臺。通過監(jiān)管平臺對實驗室工作環(huán)境、區(qū)域、工作流程、人員防護、實驗檢測等各個環(huán)節(jié)及風險點進行全方位管理和監(jiān)控，尤其對實驗室的壓力、人員、標本流動的重要環(huán)節(jié)等納入統(tǒng)一監(jiān)管，提升PCR實驗室的監(jiān)管水平，對可能帶來生物安全隱患的各個風險點進行預警，及時發(fā)現生物安全隱患并排除隱患，減少或杜絕實驗室污染和人員感染，保證實驗室的生物安全，同時也保證了實驗室的質量控制。