黃忍，張定練，肖馳

（廣東天農(nóng)食品集團(tuán)股份有限公司，廣東 清遠(yuǎn) 511500）

豬鏈球菌病是由多種不同血清型鏈球菌（Streptococcosis suis，SS）感染引起的，主要以淋巴結(jié)膿腫、腦膜炎、關(guān)節(jié)炎及敗血癥狀為主要臨床特征[1]。通過莢膜抗原可將鏈球菌分為35個(gè)血清亞型，其中豬二型鏈球菌（Streptococcus suistypeⅡ，SS2）是豬體內(nèi)最常分離到，也是致病力最強(qiáng)的菌株[2]。SS2不僅導(dǎo)致豬急性敗血癥、腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、心肌炎和急性死亡的發(fā)生，且可感染人并致死，為人獸共患性傳染病。因此其不僅可給全球養(yǎng)豬業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失，而且嚴(yán)重威脅食品安全和人類健康[3]。

多殺性巴氏桿菌是一種革蘭氏陰性小桿菌，通常存在于健康動(dòng)物的上呼吸道中，被認(rèn)為是一種機(jī)會(huì)性致病菌[4]。多殺性巴氏桿菌具有廣泛的感染宿主，可引起牲畜、家禽和野生動(dòng)物的多種疾病，包括豬、牛、小反芻動(dòng)物和兔子的肺炎、牛的急性敗血癥、家禽的禽霍亂和豬的萎縮性鼻炎[5]。此外，多殺性巴氏桿菌為人獸共患性傳染病原，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致人菌血癥的發(fā)生。多殺性巴氏桿菌主要引起豬萎縮性鼻炎和豬肺疫兩種疾病[6]。這兩種疾病均可導(dǎo)致豬生長(zhǎng)緩慢和飼料轉(zhuǎn)化率降低，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

抗生素是治療這兩種疾病的有效方法，但由于抗生素的濫用，細(xì)菌極易產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致治療的失敗。本研究對(duì)2021年從貴州省黔南州、遵義市、貴陽(yáng)市三個(gè)地區(qū)7個(gè)規(guī)模化豬場(chǎng)分離到的4株多殺性巴氏桿菌和6株豬二型鏈球菌進(jìn)行耐藥性分析，以期為這兩種病的有效防治及減少耐藥性的產(chǎn)生提供參考和依據(jù)。

1 材 料

1.1 菌株

試驗(yàn)用豬源多殺性巴氏桿菌和豬二型鏈球菌，從貴州省黔南州、遵義市、貴陽(yáng)市三個(gè)地區(qū)7個(gè)規(guī)?；i場(chǎng)的病死豬肺臟病料經(jīng)分離鑒定獲得，菌株由貴州日泉農(nóng)牧有限公司實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑

胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA）和胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（TSB），購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司；豬鏈球菌2型熒光PCR檢測(cè)試劑盒和豬多殺性巴氏桿菌熒光PCR檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自廣州悅洋生物技術(shù)有限公司；青霉素、阿莫西林、氨芐西林、頭孢曲松、頭孢他啶、頭孢拉啶、多西環(huán)素、慶大霉素、卡那霉素、新霉素、恩諾沙星、諾氟沙星、復(fù)方新諾明、克林霉素、多黏菌素B、氟苯尼考，購(gòu)自杭州四季青公司。

1.3 主要儀器

PCR儀（CFX96 Touch），美國(guó)伯樂有限公司；超凈工作臺(tái)（PCR-2A），蘇潔醫(yī)療器械（蘇州）有限公司。

2 方法

2.1 菌種復(fù)蘇、革蘭氏染色鏡檢鑒定

將實(shí)驗(yàn)室保存的菌種用含5%馬血清TSA培養(yǎng)基和血平板進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃、12～18 h。菌種復(fù)蘇后觀察菌落形態(tài)，進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢。

2.2 PCR鑒定

使用商業(yè)化試劑盒對(duì)分離菌株進(jìn)行RT-PCR鑒定。

2.3 藥敏試驗(yàn)

按美國(guó)臨床與實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)推薦的K-B法對(duì)分離菌株進(jìn)行16種抗生素藥物敏感性試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果按照美國(guó)臨床與實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)編制的抗微生物藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)手冊(cè)[7]要求進(jìn)行判讀。

3 結(jié)果與分析

3.1 菌落形態(tài)及染色鏡檢結(jié)果

4株菌株在血平板上呈現(xiàn)β溶血環(huán)，形成表面光滑、邊緣整齊、無色透明的針尖狀小菌落，且4株菌株革蘭氏染色鏡檢均為兩端鈍圓、單個(gè)、散在排列的陰性短桿菌（見圖1）。將這4株菌株分別命名為TN-1、TN-2、TN-3、TN-4。6株菌株在血平板上呈現(xiàn)α溶血環(huán)，形成表面光滑、邊緣整齊、乳白色小菌落，且6株菌株革蘭氏染色鏡檢均呈二聯(lián)或四聯(lián)革蘭氏陽(yáng)性球菌。將這6株菌株分別命名TN-5、TN-6、TN-7、TN-8、TN-9、TN-10。

圖1 分離的革蘭氏陰性短桿菌（左）和革蘭氏陽(yáng)性球菌（右）

3.2 分離菌qPCR檢測(cè)結(jié)果

采用豬源多殺性巴氏桿菌和豬二型鏈球菌RTPCR檢測(cè)試劑盒對(duì)10株菌株進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果顯示，TN-1、TN-2、TN-3、TN-4為豬源多殺性巴氏桿菌，TN-5、TN-6、TN-7、TN-8、TN-9、TN-10為豬二型鏈球菌。

3.3 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

共檢測(cè)4株豬源多殺性巴氏桿菌和6株豬二型鏈球菌對(duì)9大類16種抗菌藥物的敏感性，藥敏試驗(yàn)結(jié)果表1和表2。從表1可知，4株多殺性巴氏桿菌對(duì)克林霉素耐藥率為100%，對(duì)慶大霉素、卡那霉素、新霉素、諾氟沙星的耐藥率為75%，耐藥情況十分嚴(yán)重。對(duì)青霉素、氨芐西林、多西環(huán)素、復(fù)方新諾明、氟苯尼考耐藥率為50%，耐藥情況較為嚴(yán)重。對(duì)多黏菌素B和頭孢類抗生素敏感。從表2可知，6株豬二型鏈球菌對(duì)青霉素、頭孢他啶、頭孢拉啶、多西環(huán)素、慶大霉素、卡那霉素、新霉素、恩諾沙星、克林霉素、氟苯尼考完全耐藥，對(duì)氨芐西林、阿莫西林、諾氟沙星、復(fù)方新諾明和多黏菌素B耐藥較為嚴(yán)重。對(duì)三代頭孢頭孢曲松耐藥率為33.3%，現(xiàn)階段僅有三代頭孢較為敏感，多數(shù)菌株表現(xiàn)為多重耐藥。

表1 4株豬多殺性巴氏桿菌對(duì)14種抗生素的藥敏試驗(yàn)結(jié)果

表2 6株豬2型鏈球菌對(duì)16種抗生素的藥敏試驗(yàn)結(jié)果

4 討 論

隨著養(yǎng)豬規(guī)模不斷擴(kuò)大，養(yǎng)豬大集團(tuán)產(chǎn)能不斷增加，引種和生豬交易頻繁進(jìn)行，將會(huì)增加疾病的發(fā)生率。并且疾病的發(fā)展也會(huì)越來越復(fù)雜，為了保證豬群的健康，預(yù)防和治療性用藥也會(huì)越來越頻繁[8]。雖然在一段時(shí)間、一定程度上對(duì)疫病起到了控制作用，但是很多時(shí)候的無效用藥和長(zhǎng)期用藥都會(huì)增加耐藥菌株的產(chǎn)生。特別是母豬群出現(xiàn)大面積耐藥的情況下，保育、育肥至出欄的豬可選擇的藥物會(huì)越來越少。隨著耐藥性的增加和藥效的減弱，藥物使用劑量也會(huì)越來越大，成本也會(huì)增加。

本研究前期對(duì)貴州地區(qū)呼吸道疾病死亡和急性死亡豬只進(jìn)行解剖采集肺臟組織。經(jīng)過細(xì)菌分離、染色鏡檢、qPCR檢測(cè)等技術(shù)，發(fā)現(xiàn)了豬源多殺性巴氏桿菌和鏈球菌為致豬死亡的主要病原菌，對(duì)這幾個(gè)豬場(chǎng)而言，致病性細(xì)菌是引起呼吸道疾病和急性死亡的主要病原菌，其中又以豬源多殺性巴氏桿菌和豬二型鏈球菌為主。

本研究對(duì)分離到的4株豬源多殺性巴氏桿菌和6株豬二型鏈球菌進(jìn)行了藥敏檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)均存在多重耐藥現(xiàn)象。4株豬源多殺性巴氏桿對(duì)β內(nèi)酰胺類和多肽類藥物較為敏感，對(duì)氨基糖苷類和喹諾酮類藥物嚴(yán)重耐藥，對(duì)青霉素類、四懷素類、磺胺類和酰胺醇類抗生物耐藥較為嚴(yán)重。6株豬二型鏈球菌對(duì)青霉素、頭孢他啶、頭孢拉啶、多西環(huán)素、慶大霉素、卡那霉素、新霉素、恩諾沙星、克林霉素、氟苯尼考完全耐藥，對(duì)氨芐西林、阿莫西林、諾氟沙星、復(fù)方新諾明和多黏菌素B耐藥較為嚴(yán)重。三代頭孢頭孢曲松耐藥率為33.3%，現(xiàn)階段僅有三代頭孢較為敏感。多數(shù)菌株表現(xiàn)為多重耐藥。因此對(duì)豬二型鏈球菌而言，耐藥程度已經(jīng)很高。

通過對(duì)這幾個(gè)養(yǎng)豬場(chǎng)的走訪發(fā)現(xiàn)，豬場(chǎng)長(zhǎng)期并且僅使用大環(huán)內(nèi)酯類的泰萬和泰樂菌素，青霉素類的青霉素和阿莫西林，β-內(nèi)酰胺類的頭孢噻夫，酰胺醇類的氟苯尼考，林可胺類的克林霉素。并且上游母豬場(chǎng)也長(zhǎng)期并且僅使用以上藥物。此外，發(fā)現(xiàn)這些豬場(chǎng)缺少獸醫(yī)的指導(dǎo)，缺乏針對(duì)性用藥策略，長(zhǎng)期開大處方，長(zhǎng)期低劑量長(zhǎng)時(shí)間進(jìn)行藥物保健。因此，一系列的不規(guī)范操作導(dǎo)致了豬場(chǎng)發(fā)生嚴(yán)重耐藥。在了解了豬場(chǎng)用藥和疾病背景的情況下，有針對(duì)性地開展了藥物敏感性試驗(yàn)，同時(shí)確保豬群吃到足量的藥物是很關(guān)鍵的，長(zhǎng)期低劑量使用藥物不僅達(dá)不到治療效果還會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌耐藥的產(chǎn)生。

基于此案例，為了避免耐藥菌株的持續(xù)出現(xiàn)，豬場(chǎng)應(yīng)該根據(jù)豬群的臨床癥狀，嚴(yán)格控制藥物的使用，通過藥物敏感試驗(yàn)嚴(yán)格篩選敏感藥物用于疾病的預(yù)防和治療[9]。同時(shí)在日常管理中，加強(qiáng)豬場(chǎng)生物安全防控工作，做好豬群的免疫和免疫監(jiān)測(cè)，提高豬群抵抗力，減少不良誘因繼發(fā)細(xì)菌性疾病的發(fā)生，降低經(jīng)濟(jì)損失。