豬鞭蟲(chóng)基于ITS 基因PCR 診斷

黃志堅(jiān)

（福建省三明市綠色食品發(fā)展中心，福建三明 365000）

豬鞭蟲(chóng)（Trichuris suis）又稱豬毛尾線蟲(chóng)，屬于無(wú)尾感器綱（Aphasmidea）毛尾目（Trichurata）毛尾科（Trichuridea）毛尾屬（Trichuris），蟲(chóng)體前部細(xì)長(zhǎng)，后部粗短，形似馬鞭，故也有毛首線蟲(chóng)或鞭蟲(chóng)之稱[1-5]。鞭蟲(chóng)蟲(chóng)體呈乳白色，前部為食道部，約占細(xì)長(zhǎng)前部的3/5，內(nèi)含由1 串單細(xì)胞圍繞的食道；后部為體部，約占短粗后部的2/5，內(nèi)有生殖器和腸管。雌蟲(chóng)體長(zhǎng)40～50mm，尾直、末端呈圓形；雄蟲(chóng)體長(zhǎng)30～40mm，尾部呈螺旋狀卷曲[6]。蟲(chóng)卵腰鼓狀，兩端有塞，卵殼厚，呈棕黃色。豬鞭蟲(chóng)的生活史不需要中間宿主，蟲(chóng)卵或幼蟲(chóng)在外界發(fā)育到具有感染性后直接感染終末宿主。

豬鞭蟲(chóng)病的感染度較強(qiáng)、較普遍，四季均有發(fā)生，但蟲(chóng)卵在夏季的孵化率和感染率均高于其他季節(jié)[7]，寄生的鞭蟲(chóng)以吸血為主，Layrisse 等[8]報(bào)道每條成蟲(chóng)的日吸血量為0.005mL。感染重者往往導(dǎo)致死亡，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展造成一定的威脅[9]。1～4 月齡的仔豬較容易感染和寄生鞭蟲(chóng)，45 日齡仔豬糞便中即可檢查出蟲(chóng)卵，4 月齡豬只蟲(chóng)卵數(shù)目和感染率均顯著提高，而對(duì)6 個(gè)月齡以上的育肥豬和成年母豬的影響較小，且比較少見(jiàn)相關(guān)臨床感染報(bào)道。少量的豬鞭蟲(chóng)寄生對(duì)豬只造成的健康危害不大，但是嚴(yán)重感染時(shí)，仔豬則表現(xiàn)出消瘦、血清蛋白降低、貧血、黏膜蒼白、皮膚無(wú)彈性、被毛無(wú)光澤等臨床癥狀[10]。豬鞭蟲(chóng)寄生于結(jié)腸和盲腸內(nèi)[11]，蟲(chóng)體頭部深入黏膜，引起結(jié)腸和盲腸的慢性卡他性炎癥，有時(shí)還會(huì)出現(xiàn)出血性腸炎，通常為瘀斑性出血，剖檢可見(jiàn)結(jié)腸和盲腸黏膜有出血性壞死、水腫、結(jié)節(jié)和潰瘍。

目前寄生蟲(chóng)的診斷和分析發(fā)現(xiàn)，除使用傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)觀察外，隨著分子生物學(xué)方法的成熟應(yīng)用，PCR擴(kuò)增和序列分析已成為寄生蟲(chóng)在分子水平上分類和鑒別的有效手段。為此，本研究采用PCR 方法，擴(kuò)增疑似豬鞭蟲(chóng)分離株轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列（Internal Transcribed Spacer，ITS）序列并進(jìn)行測(cè)序，BLAST 對(duì)比分析，建立豬鞭蟲(chóng)PCR 診斷方法，為今后豬鞭蟲(chóng)的鑒別、診斷、防治以及分子流行病學(xué)調(diào)查等更深層次的研究奠定基礎(chǔ)，以降低豬鞭蟲(chóng)對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成的經(jīng)濟(jì)損失。

1 材料與方法

1.1 蟲(chóng)體樣品

豬鞭蟲(chóng)樣品來(lái)自福建三明某豬場(chǎng)的保育舍小豬盲腸內(nèi)，70%酒精保存。

1.2 主要試劑

10×PCR buffer、MgCl2、dNTPs、Taq 酶、蛋白酶K、DL-2000 DNA marker 均購(gòu)自福州晶泰生物技術(shù)有限公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 蟲(chóng)體DNA 提取

從70%的酒精保存液中取出一條疑似豬鞭蟲(chóng)蟲(chóng)體，剪成4 段，用雙蒸水反復(fù)吹打沖洗3 次，用吸水紙吸干蟲(chóng)體表面的水分。分別置于已滅菌干燥的1.5mL Eppendorf 管中，充分剪碎后用研磨器研磨；加入500μLTES（裂解液）混勻，再加入2μL 蛋白酶K（50mg/mL），充分混勻后，于56℃水浴保溫6h，每2h 搖1 次（充分裂解組織、細(xì)胞、消化蛋白等），至體系透亮；加入500μL 酚、氯仿、異戊醇混合液，體積比為25: 24 :1，緩慢顛倒5min 混勻，12000rpm，離心10min，取上清液到已滅菌干燥的1.5mL Eppendorf 管中；加入等體積氯仿、異戊醇混合液，體積比為24 : 1，緩慢顛倒5min 混勻，10000rpm，離心10min，取上層清液到一個(gè)已滅菌干燥的1.5mL Eppendorf 管中；加入3 倍體積的-20℃預(yù)冷的無(wú)水乙醇沉 淀 DNA，置于-20℃冰箱中保存 30min；12000rpm，離心10min，棄乙醇；-20℃保存的75%乙醇洗滌2 次，12000rpm，離心5min，棄乙醇，用濾紙小心吸干Eppendorf 管壁的乙醇，置于超凈工作臺(tái)干燥1h 左右；加入適量雙蒸水溶解DNA（30μL），-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 PCR 擴(kuò)增

采用引物序列NC2（5，-TTAGTTTCTTTTCCTC CGCT-3，）和NC5（5，-GTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATT-3，）[4]，為擴(kuò)增鞭蟲(chóng)ITS 及5.8S 基因的保守引物，由上海生工生物工程有限公司合成。預(yù)期擴(kuò)增片段大小約為1500bp，擴(kuò)增體系為25μL。PCR 反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，55℃復(fù)性30s，72℃延伸90s，進(jìn)行35 個(gè)循環(huán)，最后72℃后延伸10min。并設(shè)不加DNA 模板的陰性對(duì)照。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，將電泳好的瓊脂糖凝膠于紫外透射儀上觀察并記錄結(jié)果。

1.5 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序

將PCR 產(chǎn)物寄到上海生工生物工程股份有限公司測(cè)序，然后進(jìn)行序列比較和分析。

2 結(jié)果

2.1 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

PCR 產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，電泳好后可見(jiàn)約1500bp 的條帶，跟預(yù)期的目的片段大小一致。DNA 陰性對(duì)照無(wú)條帶出現(xiàn)（圖1）

圖1 豬鞭蟲(chóng)ITS 序列PCR 產(chǎn)物電泳圖

2.2 測(cè)序序列對(duì)比分析

將測(cè)序株在線BLAST 比對(duì)，通過(guò)DNA star 軟件分析測(cè)序株與GenBank 上豬鞭蟲(chóng)的同源性。由圖2 序列分析可以看出，Longyan（本次試驗(yàn)蟲(chóng)體序列，標(biāo)注為“China:Longyan，F(xiàn)ujian Province”）與AM9930 03（China:Miluo，Hunan Province）的同源性達(dá)93.3%；與AM993005（China:Yiyang，Hunan Province）的同源性達(dá)95.3% ；與AM993006（China:Yangjiang，Guangdong Province）的同源性達(dá)94.9%；與AM9930 12（China:Zhanjiang，Guangdong Province）的同源性達(dá)94.0%；與GQ301555（Cameroon:Kumba）的同源性高達(dá)98.7%。綜上所述，所擴(kuò)增序列達(dá)到預(yù)期要求，該測(cè)序株為豬鞭蟲(chóng)。

圖2 DNA star 序列分析

3 討論

對(duì)寄生蟲(chóng)進(jìn)行分類和鑒定是寄生蟲(chóng)學(xué)研究的基礎(chǔ)和前提，也對(duì)防治人、動(dòng)物和植物的寄生蟲(chóng)病有重要意義。根據(jù)形態(tài)學(xué)鑒定寄生蟲(chóng)是傳統(tǒng)的分類和鑒定方法，但是隨著生物種群的進(jìn)化和發(fā)展，形態(tài)學(xué)在不同發(fā)育時(shí)期寄生蟲(chóng)的鑒別及相似蟲(chóng)體的鑒別存在一定的局限性。近年來(lái)，PCR 診斷方法作為一種實(shí)用性檢測(cè)方法，既保證檢測(cè)的準(zhǔn)確性，又保證檢測(cè)的時(shí)效性，是目前應(yīng)用最普遍的分子生物學(xué)工具，該技術(shù)因其所具有的敏感性高、特異性強(qiáng)和適合于大規(guī)模群體監(jiān)測(cè)的特點(diǎn)，在疾病診斷方面得到了廣泛應(yīng)用。在寄生蟲(chóng)分子分類學(xué)研究中，利用核糖體DNA 對(duì)寄生蟲(chóng)進(jìn)行分類學(xué)和蟲(chóng)種進(jìn)化關(guān)系學(xué)的研究已經(jīng)成為國(guó)際上普遍的應(yīng)用方法[12]。ITS 是位于寄生蟲(chóng)的遺傳物質(zhì)特別是核糖體DNA（rDNA）的18S 和28S 基因之間區(qū)域片段，由于它在種間變異較大，從而可以用作蟲(chóng)種間以及株間的分類鑒定。在現(xiàn)代分子分類學(xué)領(lǐng)域，越來(lái)越多地采用rDNA 的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）作為分子標(biāo)記[13]。羅建勛等[14]對(duì)中國(guó)境內(nèi)發(fā)現(xiàn)的4種牛巴貝斯蟲(chóng)和一種牛巴貝斯蟲(chóng)未定種進(jìn)行了18S rRNA 基因測(cè)序，并將所測(cè)序列與GeneBank 上已經(jīng)發(fā)表的牛巴貝斯蟲(chóng)18S rRNA 比對(duì)，研究發(fā)現(xiàn)該未定種在基因樹(shù)上與卵形巴貝斯蟲(chóng)在同一枝上，進(jìn)而確定該未定種屬卵形巴貝斯蟲(chóng)。張龍現(xiàn)等[15]為了準(zhǔn)確、快速鑒別人畜隱孢子蟲(chóng)的種類，建立了巢式PCR 擴(kuò)增隱孢子蟲(chóng)的18S rRNA 基因特殊區(qū)域，結(jié)果顯示，在18S rRNA 基礎(chǔ)上建立的PCR-RFLP 方法可以有效鑒別隱孢子蟲(chóng)的種類。

4 結(jié)論

該研究對(duì)三明地區(qū)豬體內(nèi)分離獲得的疑似豬鞭蟲(chóng)，應(yīng)用PCR 技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增其ITS 序列，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序后，與GenBank 中的AM993003、AM993005、AM993006、AM993012、GQ301555 進(jìn)行比對(duì)，應(yīng)用DNA star 軟件進(jìn)行序列分析，同源性分別為93.3%、95.3%、94.9%、94.0%和98.7%，證明該測(cè)序株為豬鞭蟲(chóng)。本研究建立了基于ITS 基因豬鞭蟲(chóng)的分子診斷方法，研究結(jié)果對(duì)豬鞭蟲(chóng)進(jìn)一步的診斷、鑒定和遺傳變異的研究奠定了基礎(chǔ)，為豬鞭蟲(chóng)病的臨床診斷和流行病學(xué)調(diào)查提供了科學(xué)依據(jù)。