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      干細(xì)胞來(lái)源外泌體通過(guò)調(diào)控MMP-9 表達(dá)減輕脊髓損傷的機(jī)制分析

      2023-01-03 13:29:28王東郜振武楊秋薈孫留群楊學(xué)斌陳晨
      關(guān)鍵詞:外泌體屏障脊髓

      王東 郜振武 楊秋薈 孫留群 楊學(xué)斌 陳晨

      血脊髓屏障中的粘附連接蛋白與緊密連接蛋白能夠防止外周循環(huán)物質(zhì)進(jìn)入骨髓。脊髓受損后,血脊髓屏障隨之受損,使血細(xì)胞進(jìn)入脊髓,產(chǎn)生炎癥反應(yīng),導(dǎo)致脊髓受損和神經(jīng)功能永久性損傷[1]?;|(zhì)金屬蛋白酶在血脊髓屏障受損中起主導(dǎo)作用,而屏障損傷是造成繼發(fā)性損傷的影響因素[2]。說(shuō)明維持脊髓屏障的完整及正常功能可能有助于減輕脊髓損傷和恢復(fù)神經(jīng)系統(tǒng)。間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療脊髓損傷療效確切,而外泌體是間充質(zhì)干細(xì)胞旁分泌機(jī)制的重要成分[3]。臨床上將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)來(lái)源外泌體用于治療心血管等疾病,但目前在脊髓損傷方面的研究較少?;诖?本研究將構(gòu)建大鼠脊髓損傷模型,移植干細(xì)胞來(lái)源外泌體,探討其通過(guò)MMP-9 表達(dá)減輕脊髓損傷的機(jī)制。現(xiàn)報(bào)告如下。

      1 材料與方法

      1.1 實(shí)驗(yàn)材料

      1.1.1 細(xì)胞來(lái)源 BMSCs(廠家:廣州賽業(yè)生物科技有限公司)選自大鼠股骨骨髓。

      1.1.2 實(shí)驗(yàn)大鼠 選取60 只SD 大鼠(廠家:珠海百試通生物科技有限公司),體質(zhì)量約200 g,本研究于2021 年1 月~2022 年1 月在白求恩醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室完成,本研究經(jīng)白求恩醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

      1.2 方法

      1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) BMSCs 復(fù)蘇后,用10%胚胎牛血清(廠家:Ausbian;貨號(hào):WS500T;規(guī)格:500 ml/瓶)和1%青霉素(廠家:普利萊;貨號(hào):APC8250-5;規(guī)格:5 g)和鏈霉素DMEM/F12 完全培養(yǎng)基培養(yǎng),1 d 后換成新鮮完全培養(yǎng)基,待細(xì)胞融合率達(dá)80%時(shí)通過(guò)0.25%胰酶消化,并以1∶4 的比例傳代。

      1.2.2 提取外分泌體 從細(xì)胞培養(yǎng)上清液中提取外泌體,首先使用超濾離心管將胎牛血清離心55 min(3000×g),獲取去外泌體胎牛血清。當(dāng)干細(xì)胞融合率約70%時(shí),更換含10%去外泌體胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基,培養(yǎng)36 h,按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行外泌體提取。

      1.2.3 構(gòu)建脊髓損傷模型及注射外泌體 將60 只SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組及外泌體組,每組20 只。構(gòu)建大鼠脊髓損傷模型(改良Allen's法),大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉(3 ml/kg)麻醉,作切口后切除椎板,充分暴露T9~10段脊髓,在T10處造成重度損傷,術(shù)畢用0.9%氯化鈉沖洗,縫合傷口。持續(xù)3 d 抗生素方案,手動(dòng)排空膀胱至大鼠排尿功能恢復(fù)正常。假手術(shù)組不對(duì)脊髓進(jìn)行打擊,僅行T10椎板切除術(shù)。外泌體組在脊髓損傷30 min 和1 d 后進(jìn)行干細(xì)胞來(lái)源外泌體尾靜脈注射(200 μl)。模型組分別于損傷后30 min、1 d 經(jīng)尾靜脈注射200 μl PBS 緩沖液。

      1.2.4 運(yùn)動(dòng)功能評(píng)定 采用BBB 評(píng)分對(duì)大鼠運(yùn)動(dòng)功能進(jìn)行評(píng)定,評(píng)分范圍0~21 分,0 分表示無(wú)自主運(yùn)動(dòng);21 分表示正常自主運(yùn)動(dòng),動(dòng)作協(xié)調(diào)。大鼠于造模前及造模后第1、3、5、7、10、14、21 天在防滑、平坦的塑料板上自由移動(dòng),觀察5 min。在雙盲條件下由2 位掌握BBB 評(píng)分執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)的研究組員對(duì)大鼠進(jìn)行運(yùn)動(dòng)功能評(píng)定。

      1.2.5 伊文思藍(lán)染色 在大鼠脊髓損傷后第3 天,注射2%伊文思藍(lán)溶液(2 ml/kg)于大鼠尾靜脈,2 h 后麻醉大鼠(1%戊巴比妥),用0.9 氯化鈉溶液灌注至右心房流出的液體為澄清樣。將脊髓損傷節(jié)段與50%TCA溶液充分勻漿后離心10 min(10000×g),將上清液用分光光度計(jì)在發(fā)射波長(zhǎng)620、680 nm 下檢測(cè)樣品吸光度。將樣品吸光度轉(zhuǎn)化成每克組織中所含染料微克數(shù)。

      1.2.6 Western blot 檢測(cè) 用RIPA 裂解液將脊髓組織勻漿后于冰上裂解30 min,在4℃條件下離心10 min(12000×g),用BCA 蛋白質(zhì)定量法分析上清液總蛋白含量。電泳分離樣品,將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上,室溫密封1 h,再將claudin-5、Occludin、ZO-1、MMP-9 一抗加入在4℃下過(guò)夜,加入HRP 標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h。以β-actin 為內(nèi)參,獲取條帶灰度值,蛋白水平的表達(dá)形式為目的條帶灰度值/β-actin 帶灰度值。

      1.2.7 明膠酶譜法 采用明膠酶譜法檢測(cè)MMP-9 活性,取損傷脊髓節(jié)段,在裂解緩沖液中勻漿,離心后分析上清液蛋白含量,加入緩沖液混勻,待蛋白量上樣后洗脫變性,漂洗40 min,放入孵育液37℃48 h,染色2 h,再用脫色液脫色至出現(xiàn)條帶,拍照記錄分析。

      1.3 觀察指標(biāo) ①比較三組大鼠脊髓損傷后不同時(shí)間點(diǎn)的BBB 評(píng)分;②比較三組大鼠染料滲出量;③比較三組大鼠緊密連接蛋白(claudin-5、ZO-1、Occludin)表達(dá)水平;④比較三組大鼠脊髓組織中MMP-9 表達(dá)水平及活性。

      1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,多組間比較采用F檢驗(yàn),兩組比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以率(%)表示,采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

      2 結(jié)果

      2.1 三組大鼠脊髓損傷后不同時(shí)間點(diǎn)的BBB 評(píng)分比較 假手術(shù)組大鼠無(wú)行動(dòng)障礙,BBB 評(píng)分均為21 分。外泌體組、模型組大鼠脊髓損傷后運(yùn)動(dòng)功能均受損,第1 天BBB 評(píng)分為0 分,兩組大鼠脊髓損傷后第3、5、7 天BBB 評(píng)分比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);外泌體組大鼠脊髓損傷后第10、14、21 天BBB 評(píng)分高于模型組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1,圖1。

      表1 三組大鼠脊髓損傷后不同時(shí)間點(diǎn)的BBB 評(píng)分(±s,分)

      表1 三組大鼠脊髓損傷后不同時(shí)間點(diǎn)的BBB 評(píng)分(±s,分)

      注:與模型組比較,aP<0.05;“-”表示無(wú)數(shù)據(jù)

      圖1 三組大鼠脊髓損傷后不同時(shí)間點(diǎn)的BBB 評(píng)分

      2.2 三組大鼠緊密連接蛋白表達(dá)水平及血脊髓屏障染料滲出量比較 三組大鼠損傷后第3 天血脊髓屏障染料滲出量及claudin-5、ZO-1、Occludin 表達(dá)水平比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。外泌體組大鼠脊髓損傷后第3 天血脊髓屏障染料滲出量少于模型組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);外泌體組大鼠claudin-5、ZO-1 及Occludin 相對(duì)表達(dá)量高于模型組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

      表2 三組大鼠緊密連接蛋白表達(dá)水平及血脊髓屏障染料滲出量比較(±s)

      注:與模型組比較,aP<0.05

      2.3 三組大鼠脊髓組織中MMP-9 表達(dá)水平和活性比較 Western blot 檢測(cè)結(jié)果顯示,三組大鼠脊髓組織中MMP-9 表達(dá)水平和活性比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。外泌體組大鼠脊髓組織中MMP-9 表達(dá)水平低于模型組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);外泌體組大鼠脊髓組織中MMP-9 活性低于模型組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

      表3 三組大鼠脊髓組織中MMP-9 的表達(dá)水平和活性比較(±s)

      表3 三組大鼠脊髓組織中MMP-9 的表達(dá)水平和活性比較(±s)

      注:與模型組比較,aP<0.05

      3 討論

      脊髓損傷除影響感覺(jué)、運(yùn)動(dòng)和自主神經(jīng)功能外,還會(huì)出現(xiàn)慢性疼痛、肌肉萎縮等繼發(fā)性問(wèn)題。在臨床實(shí)驗(yàn)中,脊髓損傷可進(jìn)一步造成血管損傷、血脊髓屏障破裂?;|(zhì)金屬蛋白酶、腫瘤壞死因子-α 等都參與破壞脊髓損傷后的血脊髓屏障[4]。

      干細(xì)胞治療脊髓損傷有良好的治療效果。本研究結(jié)果顯示,大鼠脊髓損傷后運(yùn)動(dòng)功能均受損,第1、3、5、7 天,外泌體組和模型組BBB 評(píng)分比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);外泌體組第10、14、21 天BBB 評(píng)分高于模型組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),表明外泌體能促進(jìn)運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)。BMSCs 移植可以通過(guò)髓內(nèi)、鞘內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)或靜脈內(nèi)途徑加速脊髓損傷后神經(jīng)功能修復(fù)[5,6]。數(shù)據(jù)顯示,進(jìn)入損傷部位的BMSCs 通過(guò)旁分泌機(jī)制發(fā)揮作用,并不會(huì)完全分化成神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞[7]。外泌體是BMSCs 分泌的細(xì)胞外囊泡的主要成分,攜帶如miRNA 等重要活性物質(zhì)[8]。

      外泌體是脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu),可避免其內(nèi)容物被吸收或分泌,從而使它們能夠自由地從血脊髓屏障到達(dá)損傷部位。BMSCs 來(lái)源外泌體可預(yù)防神經(jīng)元凋亡、抗炎和抗瘢痕形成,并促進(jìn)脊髓損傷后的功能恢復(fù)[9]。Lu 等[10]的研究表明,BMSCs 來(lái)源的外泌體可降低NF-κB p65 信號(hào)調(diào)控,限制周細(xì)胞遷移,增強(qiáng)周細(xì)胞覆蓋,使血脊髓屏障通透性下降。本研究結(jié)果顯示:損傷后第3 天外泌體組血脊髓屏障染料滲出量少于模型組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);外泌體組claudin-5、ZO-1 及Occludin 相對(duì)表達(dá)量高于模型組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),進(jìn)一步補(bǔ)充了外泌體可防止緊密連接蛋白降解降低血脊髓屏障的通透性。同時(shí)本研究Western blot 檢測(cè)結(jié)果顯示:外泌體組MMP-9 表達(dá)水平低于模型組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);外泌體組MMP-9 活性水平低于模型組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),提示BMSCs 來(lái)源外泌體能通過(guò)抑制MMP-9 表達(dá)減少緊密連接蛋白claudin-5、Occludin、ZO-1 的降解,從而加快血脊屏障的修復(fù)。

      綜上所述,干細(xì)胞來(lái)源外泌體可通過(guò)抑制MMP-9表達(dá)和活性降低緊密連接蛋白的降解,改善血脊髓屏障的破壞,從而加速恢復(fù)大鼠脊髓損傷后運(yùn)動(dòng)功能。外泌體不僅能自由通過(guò)學(xué)脊髓屏障,還具有低免疫原性,在治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷中有較大的治療潛力,其可能成為脊髓損傷一種具有前景的治療策略。

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