唐艷榮，張小梅，張海云★，王雅琴，張雪梅，曹院章，楊秀環(huán)

（1.北京朝陽區(qū)動植物疫病預防控制中心，北京 100018；2.北京市動物疫病預防控制中心，北京 102609）

鸚鵡熱衣原體病是一種嚴格真核細胞內寄生的人獸共患病病原體，最先從鸚鵡體內被分離出來，是一種在眾多宿主動物中廣泛傳播的病原微生物，可以引起人類、家禽、野生禽類、寵物感染和傳播。鸚鵡熱衣原體禽類感染后呈嚴重的呼吸道疾病、消化道疾病和生產性能的降低，由于其部分感染狀態(tài)呈隱性感染,對禽類養(yǎng)殖業(yè)會造成長期性危害和損失。人感染后典型臨床表現(xiàn)為高熱、惡寒、頭痛、肌痛、咳嗽和肺部浸潤性病變等特征。一般癥狀頗似感冒或呼吸道感染，但多見于發(fā)生肺炎。據不完全統(tǒng)計，俄羅斯每年由衣原體引起的急性肺炎發(fā)病率為14.9%，而在美國由鸚鵡熱衣原體引起的人類肺炎為20%。據Meyer調查，1931～1963年間世界范圍內因接觸家禽而發(fā)生的人類鸚鵡熱衣原體病為5390例。據CDC公布數(shù)據，從1988～1998年間，大約有813人死于鸚鵡熱衣原體感染。

目前朝陽區(qū)飼養(yǎng)寵物鳥、鴿子等約15萬只，且是野生鳥類的重要棲息地，存在感染人獸共患鸚鵡熱衣原體病風險。本課題組于2020年引進LAMP核酸快速檢測技術，該技術基于病原DNA恒溫擴增的原理，使用簡易的恒溫設備和試劑，30min可以根據反應顯色差異達到快速診斷的目的，降低了實驗開展的條件，讓基層單位開展寵物疫病的快速診斷變成現(xiàn)實。通過此方法對朝陽區(qū)進行鸚鵡熱衣原體病流行病學調查，為北京地區(qū)鸚鵡熱衣原體病疫情分析、預警和防控策略奠定了基礎，對公共衛(wèi)生安全具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試劑衣原體IHA診斷試劑盒：中國農業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所研制，批號20200928204；鸚鵡熱衣原體（LAMP）核酸檢測試劑盒：北京肽諾生物科技有限公司研制。

1.2 樣品種類和來源2020年5月～2020年12月，課題組在北京市朝陽區(qū)不同方位選取信鴿運動協(xié)會、某肉鴿養(yǎng)殖場、北京會儀中心、朝陽區(qū)3家寵物診療機構，隨機采集樣本的方式，共采集血清200份；EDTA血液和咽肛拭子共計750份，其中信鴿血液39份；信鴿拭子39份；肉鴿血液428份；野禽血液20份；野禽拭子24份；犬血液44份；犬拭子44份；貓血液56份；貓拭子56份。

1.3 主要儀器設備MiniH100恒溫金屬?。?臺，采購于大龍興創(chuàng)；迷你離心機：1臺，移液器：10μL、200μL采購于熱電公司。

1.4 方法

1.4.1 血清學（IHA）抗體檢測方法

1.4.1.1 操作步驟

（1）鋪板 每孔加稀釋液0.075mL。

（2）稀釋血清 用移液器吸取被檢血清0.025mL加入第1孔，呈4倍遞增稀釋3孔（即1:4～1：64）。第3孔棄去0.025mL，孔內液體量仍為0.075mL。同一班上同時設陽性、陰性和空白對照各2孔。

（3）加抗原每孔內加稀釋液好的抗原0.025mL，置微型震蕩器上振蕩2min，蓋上玻璃版在37℃作用2h判定結果。

1.4.1.2 結果判定對照各孔均成立，則被檢血清1:16孔出現(xiàn)“++”以上者為陽性；1:4孔出現(xiàn)“+”以下者為陰性；1:4孔出現(xiàn)“++”至1:16孔“+”以下者為可疑。

1.4.2 病原學（LAMP）核酸檢測方法本試劑適用于檢測疑似患者痰液或盥洗以及咽拭子等和疑似動物（鳥類、寵物等哺乳動物）EDTA抗凝血、肺臟、肝臟、淋巴結等組織中的鸚鵡熱衣原體DNA，用于鸚鵡熱衣原體感染的輔助診斷及流行病學調查，其檢測結果僅供科研研究和參考。

1.4.2.1 引物設計從NCBI數(shù)據庫下載鸚鵡熱衣原體ompA基因全長，這些序列（AF269281.1、X56980.1、Y16561.1、AF169265.1、L25436.1、AF2692 66.1、EF375557.1、X12647.1AY762613.1、EU159263.1、AB284062.1、AF269259.1、AF269268.1、AF269269.1、EF028916.1、EF197820.1、AB284058.1、AJ243525.1、AB284065.1、AB284064.1）包含A-F、E/B、M56和WC等9種常見的基因型,使用ClastW在線比對工具選取保守序列251bp，并以此序列為模板在線設計（http://primerexplorer.jp/e/）LAMP引物組?？梢詸z測包括基因型A、B、C、D、E、F、E/B、M56、WC 9種鸚鵡熱衣原體。

1.4.2.2 試驗方法和步驟

（1）取樣及前處理 用無菌咽拭子拭取咽部分泌物，將分泌物或咽拭子置于無菌離心管，加入30～50μL樣本裂解液，置于金屬浴上95℃加熱7min，加熱完畢后可適當離心，上清液備用。

表1 保守模板及LAMP引物組序列

（2）試劑分裝和反應 從8連PCR管上剪取所需檢測數(shù)量的管子，分別在每個管子中加入24μL復溶液，同時加入1μL上步驟待用的上清液，之后輕輕將30μL礦物油加到每個PCR管子中，此時可看到管子中有分層的液體。完畢后扣上蓋子置于金屬浴中63℃加熱30min，嚴禁超時。

1.4.2.3 結果判讀30min后，將反應管取出并倒置并輕輕顛倒，待管蓋上橙紅色染料溶解后可觀察液體顏色；液體顏色顯示黃綠色的為鸚鵡熱衣原體陽性，液體顏色顯示橙黃色的為鸚鵡熱衣原體陰性。

2 結果

2.1 血清學（IHA）抗體檢測結果對200份犬貓、肉鴿、野禽的血清樣品進行的IHA抗體檢測，結果為陽性樣品30份，陽性率為15%。

2.2 IHA方法檢出的陽性血清對應的EDTA血液樣品、咽肛拭子的樣品，用LAMP核酸病原學檢測。

對IHA檢測出的30分陽性血清所對應的30份EDTA血液、咽肛拭子的樣本經LAMP核酸檢測，共檢出30份陽性樣品。IHA檢出樣品的陽性率為15.0%，結果見表2。

表2 寵物（鴿鳥）鸚鵡熱衣原體血清學（IHA）抗體檢測調查結果

2.3 病原學（LAMP）核酸檢測結果通過LAMP核酸快速檢測技術和標準方法（IHA）的結果比較，從而進一步判斷該方法的可靠性，應用LAMP核酸檢測方法檢測朝陽區(qū)寵物犬貓、鴿子、野禽樣本共計750份，陽性率13.87%。結果統(tǒng)計見表2和統(tǒng)計圖1。

圖1 寵物（鴿鳥）各種樣本鸚鵡熱衣原體病原學檢測結果圖

3 討論

通過IHA和LAMP檢測方法對北京市朝陽區(qū)的寵物、鴿鳥200份血清，750份血液和咽肛拭子樣品的檢測結果，發(fā)現(xiàn)陽性率高達15%左右，遠高于我國1987～1989年全國鸚鵡熱衣原體陽性率的10.96%。表明本市朝陽區(qū)地區(qū)，有寵物、鴿鳥鸚鵡熱衣原體感染情況。本次采集的各種樣品涵蓋了寵物犬、貓、信鴿、肉鴿、野生禽類等。發(fā)現(xiàn)各種環(huán)境下的鸚鵡熱衣原體陽性感染率區(qū)別不大，都呈現(xiàn)一定的感染率，表明了鸚鵡熱衣原體在北京地區(qū)寵物、鴿鳥中的整體流行性。

表3 寵物（鴿鳥）鸚鵡熱衣原體病原學檢測調查結果

寵物、鴿鳥和人類接觸緊密，人被感染的情況也時有發(fā)生。根據美國一項研究揭示，當禽衣原體病的流行率達到60%時，30%養(yǎng)有病鳥的家庭成員會感染上該病。因此，鸚鵡熱衣原體對北京地區(qū)居民健康也具有相當大的威脅。有必要對與寵物、鴿鳥類接觸緊密的人員及其家庭成員做進一步的鸚鵡熱衣原體的檢測，特別是有可疑癥狀的人員，非常有必要加強監(jiān)控。

鑒于北京地區(qū)寵物、信鴿、肉鴿、野禽已經出現(xiàn)鸚鵡熱衣原體的流行，建議采取如下措施來阻斷其發(fā)生和流行。首先，加強進口信鴿的檢疫，嚴防鸚鵡熱衣原體從國外進口到國內群體；其次，對高密度飼養(yǎng)的信鴿、肉鴿進行鸚鵡熱衣原體疫苗免疫，阻斷其再次感染；再次，建議農業(yè)部強化對禽用弱毒、凍干疫苗質量的監(jiān)督，防治鸚鵡熱衣原體污染疫苗，切斷向健康群體傳播。