辣木籽不同提取物降血糖及降膽固醇活性測定

邵馨漫，林 琳，文 茜，徐艷妮，張金鳳，劉蒲蘋，王占龍

（廊坊師范學(xué)院，河北 廊坊 065000）

0 引言

辣木籽是辣木樹的種子，富含多種化學(xué)成分，主要有油脂、蛋白質(zhì)、纖維素、多糖、礦物元素、黃酮、多酚等［1-2］。辣木籽具有降血壓、降血糖、降膽固醇、抗氧化、抗炎、抗腫瘤［3-10］等功效。目前，對(duì)辣木籽的研究多集中在食品［11］、醫(yī)藥、飼料［12］、工業(yè)原料及凈水［13］等領(lǐng)域，但辣木籽降血糖功能研究及膽酸鹽結(jié)合能力鮮見報(bào)道。本文測定了辣木籽提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制能力及膽酸鹽的結(jié)合能力，為辣木籽降血糖降膽固醇功能的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

材料：辣木籽。試劑：α-葡萄糖苷酶，25.4U/mg，上海源葉生物有限公司；4-硝基苯酚-α-D-吡喃葡萄糖苷，1g，上海源葉生物有限公司；胃蛋白酶，3U/mg，上海源葉生物有限公司；阿卡波糖，250mg，山東捷采化工有限公司；二甲基亞砜（DMSO），甘膽酸鈉，天津碧橙藍(lán)生物科技有限公司；牛膽酸鈉，天津碧橙藍(lán)生物科技有限公司；水合膽酸鈉，天津碧橙藍(lán)生物科技有限公司；考來烯胺，上海源葉生物有限公司。

1.1.2 儀器設(shè)備

pH計(jì)，PH-S25，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，LC-RE-52AA，上海力辰邦西儀器科技有限公司；分析天平，JA3003，上海力辰邦西儀器科技有限公司；BIO-RADi MarkTM酶標(biāo)儀；離心機(jī)，TDZ4-WS，金壇市醫(yī)療儀器廠；可見分光光度計(jì)，7200型，優(yōu)尼柯（上海）儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品制備

降血糖活性測定樣品制備：辣木籽磨粉后用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇及水依次萃取得提取物。將不同溶劑提取物分別用20%DMSO溶解并配制濃度分別為5mg/mL、25mg/mL、125mg/mL、250mg/mL樣品溶液。阿卡波糖陽性對(duì)照用20%DMSO溶解配成5mg/mL［14］溶液。

膽酸鹽結(jié)合率測定樣品制備：將所得不同溶劑提取物配制濃度分別為2mg/mL、4mg/mL、6mg/mL、8mg/mL、10mg/mL樣品溶液，考來烯胺陽性對(duì)照用蒸餾水溶解配成10mg/mL［15］溶液。

1.2.2 溶劑制備

參考王昭潤［16］的配制方法，PNPG溶液制備：精確稱取0.075g PNPG，用pH=6.8的0.01mol/L磷酸緩沖液溶解，定容至100mL，得2.5mmol/L的PNPG溶液，棕色瓶4℃保存。

0.254U/mg α-葡萄糖苷酶溶液制備：稱取酶活單位為25.4U/mg的α-葡萄糖苷酶0.001g，用磷酸緩沖液稀釋100倍，得0.254U/mg的α-葡萄糖苷酶溶液。

1.2.3 提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率的測定

不同濃度樣品各取1mL于試管中，分別加入9mg/mL NaCl溶液2mL及4mg/mL胃 蛋白 酶 溶液2mL，用0.1mol/L的HCl溶液或0.1mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至2.0，37℃恒溫水浴鍋中孵育1h（適當(dāng)振蕩3-4次），得胃消化樣品；96孔板中加入磷酸鉀緩沖液（pH=6.8）100μL，取消化后的樣品20μL及2.5mmol/L PNPG溶液20μL，37℃恒溫孵育15min后，加入0.254U/mL α-葡萄糖苷酶20μL，37℃恒溫反應(yīng)15min。加入80μL 0.2mol/L Na2CO3溶液，用酶標(biāo)儀在415nm波長處測定吸光度值A(chǔ)1。以蒸餾水代替α-葡萄糖苷酶，測定吸光度，記為A2，以蒸餾水代替樣品，測定吸光度，記為A0。由式（1）計(jì)算α-葡萄糖苷酶抑制率，每種樣品做三次平行實(shí)驗(yàn)，以5mg/mL阿卡波糖為陽性對(duì)照［17］。

其中：A1為415nm波長處測定的吸光度，L/（g·cm）；A2為以蒸餾水代替α-葡萄糖苷酶測定的吸光度，L/（g·cm）；A0為以蒸餾水代替樣品測定的吸光度，L/（g·cm）。

1.2.4 膽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

稱取甘膽酸鈉0.01464g，牛膽酸鈉0.01614g，水合膽酸鈉0.01293g，以磷酸緩沖液（pH=7.6）為溶劑，分別配制100mL母液。取上述母液0mL、0.1mL、0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL于試管，添加磷酸緩沖液（pH=7.6）2mL、1.9mL、1.5mL、1.0mL、0.5mL、0mL。分別加入5mL濃硫酸，70℃水浴20min，取出后置于冰水中5min，分光光度計(jì)于波長387nm處測定其吸光度。以膽酸鹽質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制3種膽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5 提取物對(duì)膽酸鹽結(jié)合率的測定

分別取2mg/mL、4mg/mL、6mg/mL、8mg/mL及10mg/mL的樣品溶液5mL于試管中，加入1mL 0.1mol/L HCl溶液，37℃恒溫培養(yǎng)2h，以0.1mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7.6，每個(gè)樣品分別加入2mL膽酸鹽母液，37℃恒溫培養(yǎng)2h。4000r/min離心20min，取2mL上層液，加入5mL濃硫酸，70℃恒溫水浴20min，取出后置于冰水中5min，分光光度計(jì)于波長387nm處測定其吸光度A3，底物空白吸光度為A4。由式（2）計(jì)算膽酸鹽結(jié)合率，每種樣品做三次平行實(shí)驗(yàn)，以10mg/mL考來烯胺為陽性對(duì)照［18-19］。

其中：X樣品-底物空白：將（A3-A4）作為y值，分別代入水合膽酸鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=12.893x-0.0231，甘膽酸鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=11.17x-0.0114，牛膽酸鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=5.9774x-0.0044，分別求得的x值，單位：mg/mL；X膽酸鹽空白為對(duì)應(yīng)膽酸鹽的質(zhì)量濃度，mg/mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 辣木籽不同溶劑提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率測定

圖1-4為辣木籽不同溶劑提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率的測定。由圖1可知，5mg/mL石油醚樣品提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率為69.3%，隨著石油醚樣品濃度增加，其提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率無明顯變化（60.4%-69.3%之間），表明辣木籽石油醚提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶活性抑制不顯著。由圖2可知，辣木籽乙酸乙酯相提取物濃度在5mg/mL、25mg/mL、125mg/mL、250mg/mL對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率分別為77.6%、84.5%、97.1%、98.9%。由此可知，隨著辣木籽乙酸乙酯提取物濃度增加，α-葡萄糖苷酶抑制率逐漸增大。辣木籽乙酸乙酯相提取物濃度在125mg/mL和250mg/mL對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率均大于陽性對(duì)照（92.5%）。由圖3可知，辣木籽正丁醇相提取物濃度在5mg/mL、25mg/mL、125mg/mL、250mg/mL對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率分別為62.80%、73.60%、86.00%、99.50%。由此可知，辣木籽正丁醇相提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率隨濃度的增大而增大。當(dāng)辣木籽正丁醇相提取物濃度為250mg/mL時(shí)，α-葡萄糖苷酶抑制率達(dá)到99.5%，大于陽性對(duì)照（92.5%）。由圖4可知，辣木籽水相提取物濃度為5mg/mL、25mg/mL、125mg/mL、250mg/mL時(shí)，對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率分別為54.70%、80.00%、86.20%、93.30%。表明隨著辣木籽水相提取物濃度增加，α-葡萄糖苷酶抑制率逐漸增大。當(dāng)辣木籽水相提取物濃度為250mg/mL時(shí)，α-葡萄糖苷酶抑制率達(dá)93.30%，大于陽性對(duì)照（92.50%）。

圖1 辣木籽不同濃度石油醚相提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率

圖2 辣木籽不同濃度乙酸乙酯相提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率

圖3 辣木籽不同濃度正丁醇相提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率

圖4 辣木籽不同濃度水相提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率

2.2 辣木籽膽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線測定

水合膽酸鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=12.893x-0.0231，相關(guān)系數(shù)R2為0.999。甘膽酸鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=11.17x-0.0114，相關(guān)系數(shù)R2為0.9991。牛膽酸鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=5.9774x-0.0044，相關(guān)系數(shù)R2為0.9994。三種標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)性良好，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 辣木籽不同溶劑提取物對(duì)膽酸鈉結(jié)合率的測定

2.3.1 辣木籽不同溶劑提取物對(duì)水合膽酸鈉結(jié)合率的測定

圖5-8為辣木籽不同溶劑提取物對(duì)水合膽酸鈉結(jié)合率的測定。由圖5可知，隨著辣木籽石油醚提取物濃度增加，水合膽酸鈉的結(jié)合率逐漸增大。辣木籽石油醚相提取物濃度為2mg/mL、4mg/mL、6mg/mL、8mg/mL、10mg/mL時(shí)，對(duì)水合膽酸鈉的結(jié)合率分別為79.3%、79.4%、84.3%、88.8%、96.4%。辣木籽石油醚相提取物濃度在10mg/mL對(duì)水合膽酸鈉的結(jié)合率大于考來烯胺陽性對(duì)照（91.2%）。由圖6可知，隨著樣品濃度的增加，乙酸乙酯相提取物對(duì)水合膽酸鈉結(jié)合率先增加后趨于平緩（73%-79.3%之間），且均低于考來烯胺陽性對(duì)照（91.2%），表明辣木籽乙酸乙酯相提取物對(duì)水合膽酸鈉結(jié)合作用不明顯。由圖7可知，隨著樣品濃度的增加，正丁醇相提取物對(duì)水合膽酸鈉結(jié)合率逐漸增加（73.3%-86.7%之間），且均低于考來烯胺陽性對(duì)照（91.2%），表明辣木籽正丁醇相提取物對(duì)水合膽酸鈉結(jié)合作用不明顯。由圖8可知，隨著辣木籽水相提取物濃度增加，水合膽酸鈉的結(jié)合率逐漸增大。辣木籽水相提取 物 濃 度 為2mg/mL、4mg/mL、6mg/mL、8mg/mL、10mg/mL時(shí)，對(duì)水合膽酸鈉的結(jié)合率分別為76%、79%、88%、88.4%、94.2%。辣木籽水相提取物濃度為10mg/mL時(shí)，對(duì)水合膽酸鈉的結(jié)合率大于考來烯胺陽性對(duì)照（91.2%）。

圖5 辣木籽不同濃度石油醚相提取物對(duì)水合膽酸鈉結(jié)合率

圖6 辣木籽不同濃度乙酸乙酯相提取物對(duì)水合膽酸鈉結(jié)合率

圖7 辣木籽不同濃度正丁醇相提取物

圖8 辣木籽不同濃度水相提取物對(duì)水合膽酸鈉結(jié)合率

2.3.2 辣木籽不同溶劑提取物對(duì)甘膽酸鈉結(jié)合率的測定

圖9-12為辣木籽不同溶劑提取物對(duì)甘膽酸鈉結(jié)合率的測定。由圖9可知，隨著辣木籽石油醚相提取物濃度增加，甘膽酸鈉的結(jié)合率逐漸增大。辣木籽石油醚相提取物濃度為2mg/mL、4mg/mL、6mg/mL、8mg/mL、10mg/mL時(shí)，對(duì)甘膽酸鈉的結(jié)合率分別為76.8%、77.2%、82.8%、91.5%、91.2%。辣木籽石油醚相提取物濃度為8mg/mL和10mg/mL時(shí)，對(duì)甘膽酸鈉的結(jié)合率均大于考來烯胺陽性對(duì)照（90.2%）。由圖10可知，隨著樣品濃度的增加，乙酸乙酯相提取物對(duì)甘膽酸鈉結(jié)合率無明顯增大（69.3%-90%之間），且均低于考來烯胺陽性對(duì)照（90.2%），表明辣木籽乙酸乙酯相提取物對(duì)甘膽酸鈉結(jié)合作用不明顯。由圖11可知，隨著樣品濃度的增加，正丁醇相提取物對(duì)甘膽酸鈉結(jié)合率先增加后減少（66.7%-81.2%之間），且均低于考來烯胺陽性對(duì)照（90.2%），表明辣木籽正丁醇相提取物對(duì)甘膽酸鈉結(jié)合作用不明顯。由圖12可知，隨著辣木籽水相提取物濃度增加，甘膽酸鈉的結(jié)合率逐漸增大。辣木籽水相提取物濃度為2mg/mL、4mg/mL、6mg/mL、8mg/mL、10mg/mL時(shí)，對(duì)甘膽酸鈉的結(jié)合率分別為82%、89.1%、89.6%、92.4%、91.3%。辣木籽水相提取物濃度在8mg/mL和10mg/mL時(shí)，對(duì)甘膽酸鈉的結(jié)合率均大于考來烯胺陽性對(duì)照（90.2%）。

圖9 辣木籽不同濃度石油醚相提取物對(duì)甘膽酸鈉結(jié)合率

圖10 辣木籽不同濃度乙酸乙酯相提取物對(duì)甘膽酸鈉結(jié)合率

圖11 辣木籽不同濃度正丁醇相提取物對(duì)甘膽酸鈉結(jié)合率

圖12 辣木籽不同濃度水相提取物對(duì)甘膽酸鈉結(jié)合率

2.3.3 辣木籽不同溶劑提取物對(duì)牛膽酸鈉結(jié)合率的測定

圖13-16為辣木籽不同溶劑提取物對(duì)牛膽酸鈉結(jié)合率的測定。由圖13可知，隨著樣品濃度的增加，牛膽酸鈉的結(jié)合率逐漸增大（61%-80.2%），且均低于考來烯胺陽性對(duì)照（91.5%），表明辣木籽石油醚相提取物對(duì)牛膽酸鈉結(jié)合作用不明顯。由圖14可知，隨著樣品濃度的增加，辣木籽乙酸乙酯相提取物對(duì)牛膽酸鈉的結(jié)合率先減少后增加（44.5%-90.1%），且均低于考來烯胺陽性對(duì)照（91.5%），表明辣木籽乙酸乙酯相提取物對(duì)牛膽酸鈉結(jié)合作用不明顯。由圖15可知，隨著辣木籽正丁醇相提取物濃度增加，牛膽酸鈉的結(jié)合先減少后增加。辣木籽正丁醇相提取物濃度在2mg/mL、4mg/mL、6mg/mL、8mg/mL、10mg/mL對(duì)牛膽酸鈉的結(jié)合率分別為77.7%、63.4%、91.2%、92%、90.2%。辣木籽正丁醇相提取物濃度在8mg/mL對(duì)牛膽酸鈉的結(jié)合率大于考來烯胺陽性對(duì)照（91.5%）。由圖16可知，隨著辣木籽水相提取物濃度增加，牛膽酸鈉的結(jié)合率逐漸增大。辣木籽水相提取物濃度在2mg/mL、4mg/mL、6mg/mL、8mg/mL、10mg/mL對(duì)牛膽酸鈉的結(jié)合率分別為62%、74%、87.4%、93.1%、94%。辣木籽水相提取物濃度在8mg/mL和10mg/mL對(duì)牛膽酸鈉的結(jié)合率均大于考來烯胺陽性對(duì)照（91.5%）。

圖13 辣木籽不同濃度石油醚相提取物對(duì)牛膽酸鈉結(jié)合率

圖14 辣木籽不同濃度乙酸乙酯相提取物對(duì)牛膽酸鈉結(jié)合率

圖15 辣木籽不同濃度正丁醇相提取物對(duì)牛膽酸鈉結(jié)合率

圖16 辣木籽不同濃度水相提取物對(duì)牛膽酸鈉結(jié)合率

3 結(jié)論

本研究按照溶劑極性由小到大的順序選取石油醚、乙酸乙酯、正丁醇及水依次對(duì)辣木籽進(jìn)行萃取，分別配制辣木籽不同溶劑提取物樣品溶液，測定其對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活性。結(jié)果表明，辣木籽水相、正丁醇相及乙酸乙酯相提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活性隨提取物濃度的增加而增大。當(dāng)乙酸乙酯、正丁醇及水相提取物在250mg/mL濃度時(shí)，具有較強(qiáng)的α-葡萄糖苷酶抑制活性，抑制率均高于陽性對(duì)照。不同濃度石油醚相樣品提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率無明顯變化，均低于陽性對(duì)照。表明辣木籽水相、正丁醇相、乙酸乙酯相提取物中存在α-葡萄糖苷酶活性抑制物，而石油醚相中無明顯α-葡萄糖苷酶抑制物。

辣木籽不同極性提取物膽酸鹽結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果表明，辣木籽水相提取物對(duì)水合膽酸鈉、甘膽酸鈉及牛膽酸鈉結(jié)合能力均較強(qiáng)。辣木籽石油醚相提取物對(duì)水合膽酸鈉和甘膽酸鈉具有較強(qiáng)的結(jié)合能力。辣木籽正丁醇相提取物對(duì)牛膽酸鈉結(jié)合能力較強(qiáng)。辣木籽乙酸乙酯相提取物對(duì)三種膽酸鹽無明顯結(jié)合能力。

本研究測定了辣木籽不同極性提取物的降血糖及降膽固醇能力，初步明確辣木籽降血糖及降膽固醇有效部位，為后續(xù)活性單體物質(zhì)的分離純化奠定基礎(chǔ)。后續(xù)將對(duì)功能性組分單體物質(zhì)進(jìn)行分離純化，以期發(fā)現(xiàn)降血糖、降膽固醇活性單體物質(zhì)。