基于轉(zhuǎn)錄組分析溫度誘導(dǎo)黑斑原鮡（Glyptosternum maculatum）選擇性剪接的變化

王萬良，周建設(shè),2，扎西拉姆，張馳，陳美群

（1.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院水產(chǎn)科學(xué)研究所，西藏 拉薩 850032；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河南 鄭州 450046）

近些年，全球氣候變化[1]導(dǎo)致了一系列水生態(tài)問題[2]。西藏是我國重要的生態(tài)安全屏障，對(duì)全國乃至全球氣候的變化影響顯著[3]，水生生態(tài)系統(tǒng)是西藏生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分。魚類是水生低等變溫脊椎動(dòng)物，與環(huán)境水體的熱交換速率高，容易受到外界水溫的影響[4,5]。溫度變化可能對(duì)它們的行為、生長(zhǎng)和繁殖產(chǎn)生負(fù)面影響，甚至導(dǎo)致死亡[6]。為了維持這種自我平衡狀態(tài)，魚類需要在生理、細(xì)胞和分子水平上迅速有效地響應(yīng)水溫的變化。

轉(zhuǎn)錄組分析是研究魚類應(yīng)對(duì)溫度變化的有效手段，揭示了多個(gè)與氧化應(yīng)激、蛋白合成、蛋白折疊、細(xì)胞凋亡等相關(guān)的基因[7,8]，尤其是熱應(yīng)激蛋白（Hsps）表達(dá)水平在魚類響應(yīng)溫度變化中顯著上調(diào)[9]。然而，有關(guān)魚類對(duì)溫度脅迫后轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控知之甚少，比如轉(zhuǎn)錄后的選擇性剪接（Alternative Splicing,AS）。選擇性剪接在增強(qiáng)真核生物的調(diào)節(jié)能力和蛋白質(zhì)機(jī)構(gòu)組成中起關(guān)鍵作用[10]，其基本類型包括外顯子跳躍（SE）、互斥外顯子（MXE）、選擇性5’剪接位點(diǎn)（A5SS）、選擇性3’剪接位點(diǎn)（A3SS）和內(nèi)含子保留（RI）[11]。選擇性剪接所產(chǎn)生的mRNA 和蛋白質(zhì)亞型在結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性、亞細(xì)胞定位和功能上可能不同[12]。在發(fā)育和對(duì)環(huán)境壓力的反應(yīng)過程中，選擇性剪接是一個(gè)被嚴(yán)格調(diào)控的過程[13,14]，它在應(yīng)對(duì)非生物脅迫，包括熱脅迫的過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[7,15]。斑馬魚（Danio rerio）響應(yīng)熱應(yīng)激后，其熱休克蛋白1（hsf1）轉(zhuǎn)錄變體的比例發(fā)生了明顯的變化[16]。

圖1 黑斑原鮡背部（a）、胸部（b）及棲息地環(huán)境（c）（張馳拍攝）Fig.1 Photos of dorsal（a）,chest（b）and habitat of G.maculatum（by Zhang Chi）

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)來源

實(shí)驗(yàn)中，用三層刺網(wǎng)在夜間布網(wǎng)，凌晨收網(wǎng)采捕多雄藏布支流（N29°27′58.72″，E86°54′36.06″）的黑斑原，用魚罐車運(yùn)輸?shù)轿鞑刈灾螀^(qū)農(nóng)牧科學(xué)院水產(chǎn)科學(xué)研究所養(yǎng)殖基地水族箱暫養(yǎng)10 d。箱溫度保持在12℃。為了避免性別和年齡對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響[21]，挑選體長(zhǎng)、體質(zhì)量相近的雌性個(gè)體90 尾，分為3 組，每組30 尾。根據(jù)黑斑原棲息環(huán)境溫度的范圍[22]，試驗(yàn)溫度設(shè)置3 個(gè)組：A 組為對(duì)照組，水溫保持12℃；B 組以2℃/h 從12℃下降到4℃；C 組以2℃/h 上升，達(dá)到24℃時(shí)，黑斑原表現(xiàn)張口呼吸，鰓蓋猛烈震動(dòng)，身體顏色變淺，身體出現(xiàn)弓張反應(yīng)，瀕死魚開始出現(xiàn)。

1.2 樣本收集和RNA 提取

選擇肝組織作為試驗(yàn)組織[23,24]。C 組在處理過程中，一旦出現(xiàn)瀕死魚，立即取出肝臟，收取3 尾魚的肝臟樣本，然后以2℃/h 降溫至12℃保持。同時(shí)從A 組和B 組各收集3 尾魚，用100 mg/L 的MS-222 麻醉致死后取肝臟樣本，樣本均置于液氮中?？俁NA 提取使用TRIzol 試劑（Invitrogen，USA）。采用瓊脂糖凝膠電泳和安捷倫2100 生物分析儀（Agilent Technologies,CA,USA）分別測(cè)定RNA 濃度和RNA 完整性（RIN）。每個(gè)樣本3 μg RNA 用于建庫，使用NEBNextUltraTMRNA 生成測(cè)序文庫，使用TruSeq PE Cluster Kit v3-cbo-hs 對(duì)樣本進(jìn)行聚類。聚類生成后在Illumina Hiseq 平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序項(xiàng)目由上海派森諾基因科技有限公司服務(wù)，RNA-Seq 結(jié)果已上傳至NCBI 數(shù)據(jù)庫（PRJNA634869）。

1.3 熱應(yīng)激后選擇性剪接分析

使用rMATS[25]檢測(cè)不同樣品間的差異剪接基因和樣品自身的剪接事件。通過rMATS 統(tǒng)計(jì)模型對(duì)不同樣本進(jìn)行可變剪接事件的表達(dá)定量，然后以likelihood-ratio test 計(jì)算P-value 來表示兩組樣品在Inclusion Level（IncLevel）水平上的差異，lncLevel 并利用Benjamini Hochberg 算法對(duì)P-value 進(jìn)行校正得FDR。FDR＜5%為選擇性剪接的標(biāo)準(zhǔn)，rMATS 可識(shí)別的可變剪接事件有5 種，分別是外顯子跳躍（skipped exon，SE）、第一個(gè)外顯子可變剪接（alternative 5′ splice site，A5SS）、最后一個(gè)外顯子可變剪接（alternative 3′ splice site，A3SS）、外顯子選擇性跳躍（mutually exclusive exons，MXE）和內(nèi)含子滯留（retained intron，RI）。

1.4 功能富集分析

根據(jù)GO 注釋結(jié)果以及官方分類，將差異選擇性剪接基因進(jìn)行功能分類，同時(shí)使用R 軟件中的phyper 函數(shù)進(jìn)行富集分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度處理后的選擇性剪接分析

RNA-Seq 結(jié)果，共獲得395.87 M的Clean reads，每個(gè)樣本超過87.29%比對(duì)到黑斑原基因組和77.70%比對(duì)到外顯子區(qū)域（表1）。高溫組、對(duì)照組和低溫組選擇性剪接事件均只存在MXE 和SE 兩種，高溫和低溫處理后選擇性剪接事件均顯著減少（圖2-a），其中SE 剪接事件在對(duì)照組、高溫組和低溫組分別為4 008、3 336 和3 786 個(gè)，MXE 剪接事件在對(duì)照組、高溫組和低溫組分別為207、188 和211個(gè)。與控制組相比，高溫誘導(dǎo)減少了16.39%選擇性剪接事件和16.35%選擇性剪接基因，低溫誘導(dǎo)減少了5.17%選擇性剪接事件和6.21%的選擇性剪接基因（圖2-b）。

圖2 溫度脅迫下黑斑原鮡肝臟組織可變剪接事件統(tǒng)計(jì)Fig.2 Statistical graph of variable splicing events in the liver tissues of Glyptosternum maculatum exposed to different temperature

表1 RNA-Seq 測(cè)序結(jié)果Tab.1 Summary of RNA-Seq reads mapping to reference genome

2.2 差異選擇性剪接分析

如表2 和圖3-a 所示，通過不同處理組間兩兩比較，對(duì)照組與高溫組間有3 425 個(gè)差異選擇性剪接事件和2 400 個(gè)差異選擇性基因，對(duì)照組與低溫組間有3 106 個(gè)差異選擇性剪接事件和2 199 個(gè)差異選擇性剪接基因，低溫組與高溫組間有3 679 個(gè)差異選擇性剪接事件和2 530 個(gè)差異選擇性剪接基因。高溫組有75 個(gè)特有基因高表達(dá)，低溫組有32個(gè)特有基因高表達(dá)。

表2 差異選擇性剪接事件Tab.2 Differential alternative splicing events in the three comparisons

2.3 功能富集分析

為了進(jìn)一步了解差異剪接事件和基因的功能，對(duì)溫度脅迫產(chǎn)生的選擇性剪接基因進(jìn)行GO 富集分析。從C vs.H、C vs.L 和L vs.H 的3 個(gè)比較組中分別選出309、187 和390 個(gè)選擇性剪接基因（P＜0.01）進(jìn)行GO 富集分析。其中在C vs.H 組有190 個(gè)基因富集到生物學(xué)過程（biological process，BP），88 個(gè)基因富集到細(xì)胞組成（cellular component，CC），318 個(gè)基因富集到分子功能（molecular functions，MF）；在C vs.L 組，101 個(gè)基因富集到生物學(xué)過程，50 個(gè)基因富集到細(xì)胞組成，210 個(gè)基因富集到分子功能；在L vs.H 組，富集到生物學(xué)功能、細(xì)胞組成和分子功能的基因分別是250、109 和406 個(gè)（圖3-b）。

圖3 差異選擇性剪接基因韋恩圖（a）及GO 富集分析（b）Fig.3 The Venn diagram（a）and GO enrichment analysis（b）of differential alternative splicing genes in the three comparisons

KEGG 分析表明，83、9 和88 個(gè)通路分別顯著富集（P＜0.05）在C vs.H 組、C vs.L 組和L vs.H 組，這些通路中，Protein processing in endoplasmic reticulum 和Purine metabolism 在3 個(gè)比較組中共有（圖4）。2 個(gè)共有通路中共有7 個(gè)基因（表3），其中熱休克蛋白40 同源物亞家族C 成員1（dnajc1）和次黃嘌呤脫氫酶1（impdh1）基因在C vs.H 組差異顯著（P＜0.05），內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)降解蛋白2（derl2）、dnajc1、黃嘌呤脫氫酶（xdh）和3′磷酸腺苷5′磷酰硫酸合成酶2（papss2）在C vs.L 組差異顯著（P＜0.05），xdh、papss2、impdh1、聚合酶（RNA）III（DNA 引導(dǎo)）肽H（polr3h）、dnajc1、derl2 和熱休克蛋白40 同源物亞家族C 成員10（dnajc10）在L vs.H 組差異顯著（P＜0.05）。值得注意的是，dnajc1 在3 個(gè)比較組中均差異顯著。該基因?qū)賖sp40 亞家族成員[26]。

表3 3 個(gè)比較組共有通路中基因名稱Tab.3 Gene name of co-pathway in the three comparison groups

圖4 3 個(gè)比較組基因數(shù)目前20 個(gè)KEGG 通路分析Fig.4 The top 20 KEGG pathways in the three comparison groups

2.4 dnajc1 基因生物信息學(xué)分析

人dnajc1 基因選擇性剪接轉(zhuǎn)錄本如圖5-A 所示有12 種，其中選擇性剪接體a 為基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄本，含12 個(gè)外顯子和11 個(gè)內(nèi)含子，其他轉(zhuǎn)錄本均是由a轉(zhuǎn)錄本通過外顯子跳躍、互斥外顯子、選擇性5’剪接位點(diǎn)、選擇性3’剪接位點(diǎn)和內(nèi)含子保留的方式衍變而來。本研究中，dnajc1 基因在對(duì)照組和低溫組魚肝臟中均產(chǎn)生1 個(gè)剪接體。該剪接體在13 號(hào)染色體跳過外顯子起始和終止位點(diǎn)分別為11110521和11110612、上游外顯子起始和終止位點(diǎn)分別為11110338 和11110429、下游外顯子起始和終止位點(diǎn)分別為11110761 和11110922。而高溫處理后發(fā)現(xiàn)了選擇性剪接，除了原有剪接體外產(chǎn)生了1 個(gè)剪接體。該剪接體在13 號(hào)染色體跳過外顯子起始和終止位點(diǎn)分別為11109595 和11109642、上游外顯子起始和終止位點(diǎn)分別為11109387 和11109489、下游外顯子起始和終止位點(diǎn)分別為11109728 和11109894（表4）。生物信息學(xué)分析顯示，黑斑原肝臟dnajc1 基因選擇性剪接轉(zhuǎn)錄本如圖5-C 所示，與人dnajc1 基因比較，黑斑原選擇性剪接體a 為基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄本，與鯰（Silurus asotus）（圖5-B）和人dnajc1基因一樣都有12 個(gè)外顯子，11 個(gè)內(nèi)含子，黑斑原肝臟選擇性剪接體b 在本研究的對(duì)照組、低溫組和高溫組出現(xiàn)，而選擇性剪接體e 只在高溫組出現(xiàn)，也有報(bào)道對(duì)鯰進(jìn)行熱應(yīng)激后誘導(dǎo)了熱休克蛋白基因hsf1 產(chǎn)生了2 種選擇性剪接體[27]，進(jìn)一步說明dnajc1 基因在黑斑原遭遇溫度脅迫后肝臟通過產(chǎn)生選擇性剪接體來保護(hù)細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)。

表4 不同溫度下dnajc1 基因選擇性剪接轉(zhuǎn)錄體Tab.4 Alternative splicing transcript of dnajc1 gene at different temperatures

圖5 dnajc1 基因選擇性剪接示意圖Fig.5 Diagram of alternative splicing of dnajc1 gene

3 討論

3.1 選擇性剪接在溫度應(yīng)激中的作用

魚類是研究環(huán)境脅迫下生理和分子反應(yīng)的良好材料[28]。環(huán)境脅迫下生物體通過調(diào)控基因的表達(dá)模式快速改變轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物來適應(yīng)環(huán)境[29]，環(huán)境脅迫因子對(duì)基因表達(dá)的影響可能是來自于選擇性剪接機(jī)制的調(diào)控[14,30]。然而，選擇性剪接事件對(duì)魚類應(yīng)對(duì)環(huán)境影響的報(bào)道并不多。隨著全球氣候的逐漸變暖[31]，溫度脅迫對(duì)魚類的各種影響也在增加。本研究分析了黑斑原在低溫和高溫處理下肝臟組織的選擇性剪接，同時(shí)對(duì)溫度脅迫下選擇性剪接基因進(jìn)行了富集分析，為更好地理解選擇性剪接調(diào)控機(jī)制在應(yīng)對(duì)溫度脅迫中的作用提供理論基礎(chǔ)。研究表明，選擇性剪接有助于動(dòng)植物更好地適應(yīng)環(huán)境的各種變化[13-15,30]。本研究中，黑斑原經(jīng)低溫和高溫處理后，肝臟組織選擇性剪接基因和事件數(shù)量均減少（圖2-b），表明選擇性剪接在黑斑原溫度脅迫后肝臟組織調(diào)解基因表達(dá)發(fā)揮了作用，這與鯰肝臟[27]熱應(yīng)激后選擇性剪接事件和基因均增加相反，選擇性剪接在發(fā)育和對(duì)環(huán)境壓力的反應(yīng)過程中受到嚴(yán)格調(diào)控[13,14]，是增加基因表達(dá)復(fù)雜性的重要機(jī)制，在細(xì)胞分化和機(jī)體發(fā)育中起重要作用[32]，溫度應(yīng)激后選擇性剪接事件和基因的增加和減少均是對(duì)熱應(yīng)激的反應(yīng)。黑斑原屬冷水性魚類，常年生活在平均海拔4 000 m 以上、水溫低于15℃的水域中[19]，環(huán)境溫度的改變致使其減少一些生物功能以維持在高寒環(huán)境中生存的需要很有必要。

3.2 熱休克蛋白保護(hù)機(jī)體細(xì)胞穩(wěn)態(tài)

Hsp40 蛋白（也稱為Dna J 蛋白）是hsp 超級(jí)家族中成員最多的亞家族之一，其結(jié)構(gòu)中保守的J 區(qū)域?yàn)閔sp40 與hsp70 結(jié)合并調(diào)節(jié)hsp70 蛋白ATP 酶活性所必需[33]。hsp40 蛋白參與多種細(xì)胞功能，包括調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)折疊、易位和組裝，具有多達(dá)50 余個(gè)同源基因，其中包括dnajc1 基因[26]。本研究中黑斑原經(jīng)低溫和高溫處理后，dnajc1 基因在3 個(gè)比較組中均差異顯著，都富集在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)蛋白過程通路中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是一個(gè)動(dòng)態(tài)的、復(fù)雜的細(xì)胞器，在細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)細(xì)胞過程，維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)。當(dāng)這種動(dòng)態(tài)平衡被打破，便出現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，使內(nèi)質(zhì)腔內(nèi)未折疊的蛋白質(zhì)不斷累積，一種稱為未折疊蛋白反應(yīng)（UPR）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制啟動(dòng)以恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的功能和蛋白質(zhì)平衡[34]。HSP 蛋白在協(xié)助內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)合成蛋白質(zhì)、保護(hù)新生多肽免受各種應(yīng)激刺激和維持蛋白停滯等方面起著決定性的作用[35]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激后誘導(dǎo)的選擇性剪接可能有重要的生理和病理意義[36]。本研究中，高溫處理后黑斑原的dnajc1 基因產(chǎn)生了2 個(gè)剪接體，而低溫處理后和對(duì)照組一樣只產(chǎn)生了1 個(gè)剪接體（表4）。黑斑原屬冷水性魚類，高溫的脅迫作用比低溫更明顯，因此dnajc1 基因在高溫脅迫選擇性剪接體發(fā)生了變化，以保護(hù)多肽免受溫度脅迫的應(yīng)激。大量證據(jù)已經(jīng)證實(shí)，Hsp 蛋白的表達(dá)對(duì)機(jī)體的熱應(yīng)激具有保護(hù)作用[37,38]，但具體保護(hù)哪些酶或結(jié)構(gòu)蛋白以及哪些核苷酸的代謝值得研究，Smolenski等[39]通過分析熱休克大鼠心臟腺嘌呤、鳥嘌呤、嘧啶和吡啶核苷酸的濃度，證實(shí)熱應(yīng)激引起大鼠心臟核苷酸代謝的顯著改變，在含氧量正常的條件下，鳥嘌呤和嘧啶核苷酸水平升高，而本研究中溫度脅迫下黑斑原肝臟中的4 個(gè)基因（表3）均在嘌呤代謝通路中差異顯著，進(jìn)一步推測(cè)黑斑原可能在溫度脅迫下，dnajc1 基因通過產(chǎn)生選擇性的可變剪接來保護(hù)嘌呤代謝過程以維持機(jī)體細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)。