張金魁 林鵬程 王 敏 范瑩瑩

(1.青海民族大學(xué) 藥學(xué)院,西寧 810007;2.天津大學(xué) 管理與經(jīng)濟學(xué)部,天津 300072;3.青海省青藏高原植物化學(xué)重點實驗室,西寧 810007;4.青海省藥品檢驗檢測院,西寧 810007)

柳蘭系常用藏藥材,藏文名恰班曲孜或恰班曲孜協(xié)貝吾投毛弄,是柳葉菜科(Onagraceae)柳蘭屬(Epilobium)植物柳蘭(EpilobiumangustifoliumL.)的干燥全草.柳蘭又名糯芋(云南麗江)、鐵筷子(四川)、火燒蘭(云南麗江)等,分布廣泛,資源豐富.各地藏醫(yī)以柳蘭入藥的品種較多,主要有柳葉菜科植物柳蘭、沼生柳葉菜、圓柱柳葉菜等[1-4].本藥味酸,性涼,具有利尿消腫和清熱利膽功能,藏醫(yī)主治“赤巴”熱、膽囊炎、熱性腹瀉、排尿困難癥及腸道寄生蟲疾病[5-7],柳蘭同時也是傈僳族常用藥材[8-11].

柳蘭藥材在藏藥中用量大,但一直以來缺乏該藥材相應(yīng)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn).《中國藥典》、《中華人民共和國衛(wèi)生部部頒藏藥標(biāo)準(zhǔn)》、六省區(qū)共同編制的《藏藥標(biāo)準(zhǔn)》、《青海省藏藥標(biāo)準(zhǔn)》均未收載此藥,為該藥的鑒別、質(zhì)量控制、炮制應(yīng)用和進(jìn)一步開發(fā)都帶來了一定的困難.因此研究制定該藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)具有重要的現(xiàn)實意義.

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1200 高效液相色譜儀,包括在線脫氣機、四元泵、自動進(jìn)樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器(美國Agilent公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀Buchi Rotavapor R-205(瑞士Buchi公司);KQ-300B 超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司);PL202-L100電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司);全自動薄層點樣儀.

1.2 藥物與試劑

金絲桃苷對照品購自中國藥品生物制品檢定所(批號:111521-201708),乙腈(色譜純,山東禹王),95%乙醇(分析純,天津市富宇精細(xì)化工有限公司),乙酸乙酯、甲酸(分析純,天津市大茂化學(xué)試劑廠),水為超純水(自制).GF254型薄層硅膠板(青島海洋化工廠);于2007年8-9月采集青海、西藏、甘肅、四川不同產(chǎn)地及來源的柳蘭藥材共計13批,經(jīng)青海民族大學(xué)藥學(xué)院林鵬程教授鑒定,為柳葉菜科柳葉菜屬植物柳蘭,樣品陰干、粉碎,過80目篩,冷藏保存.具體采集地及來源見表1.

表1 柳蘭藥材來源

2 方法與結(jié)果

2.1 性狀鑒別

本品根莖呈圓柱形,長短不等,直徑0.5～1.5 cm,表面棕褐色,栓皮具縱皺紋,有芽痕和側(cè)芽痕,頂端呈疙瘩狀,殘留有數(shù)個莖基;莖圓柱形,中空,長32～65cm,基部和上部帶暗紫色;葉多皺縮、破碎,展開后呈披針形,長6～15cm,寬1～2.5cm,葉面暗綠色,葉背灰白色;總狀花序,花瓣4,倒卵形,先端鈍圓,長約1cm,紫色;氣微,味酸、微苦[9,12].

2.2 顯微鑒別

柳蘭根橫切面皮層、木栓層、木質(zhì)部和髓細(xì)胞四界分明,形成層明顯,木質(zhì)部寬廣.表皮細(xì)胞3～5列,細(xì)胞長方形,呈淡黃色;皮層細(xì)胞多列,細(xì)胞排列緊密,類長條形,少數(shù)細(xì)胞中含草酸鈣針晶;木射線細(xì)胞1列,導(dǎo)管散在;髓部明顯、中空,細(xì)胞中富含草酸鈣針晶束.結(jié)果如圖1所示.

圖1 柳蘭根橫切面組織結(jié)構(gòu)顯微特征圖

本品粉末淺綠色,粉末鑒別觀察到6種結(jié)構(gòu),分別為非腺毛、花粉粒、葉上表皮細(xì)胞、氣孔、木栓細(xì)胞、草酸鈣針晶.草酸鈣針晶散在或成束,長約120μm;導(dǎo)管多為螺紋導(dǎo)管,直徑約30μm;葉表皮細(xì)胞,細(xì)胞多長圓形,排列較整齊,氣孔不等式;種皮細(xì)胞長圓形,排列較整齊,直徑約10～15μm;花粉粒圓球形,直徑約115μm,有2～3個萌發(fā)孔.結(jié)果如圖2所示.

圖2 柳蘭粉末顯微特征圖

2.3 薄層鑒別

2.3.1 樣品溶液的制備

取本品粉末1.0g,加入60%乙醇50mL,超聲提取60min,過濾,減壓濃縮至干,加25mL 蒸餾水溶解,用50mL 乙酸乙酯萃取,將水相濃縮至干,用10mL甲醇溶解作為供試品溶液.另取金絲桃苷對照品,加甲醇制成每1mL含1.25mg的溶液,作為對照品溶液.

2.3.2 薄層色譜條件

依照薄層色譜法(《中國藥典》四部通則)試驗,吸取樣品18μL、對照品5μL,分別點于同一硅膠G 薄層板上,以乙酸乙酯-甲酸-水(8∶1∶1)的溶液為展開劑,展開,取出,晾干,噴3% AlCl3乙醇溶液顯色,365nm 紫外燈下觀察.供試品色譜中,在與對照品色譜相應(yīng)的位置上,顯相同顏色的斑點.如圖3所示.

圖3 柳蘭TLC圖

2.4 檢查

按照《中國藥典》2020年版水分測定法(烘干法,通則0832)、灰分測定法(通則2302)、浸出物測定法(熱浸法,通則2201),對13批柳蘭藥材進(jìn)行測定,每份藥材重復(fù)3次實驗,見表2.

表2 柳蘭藥材水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定

綜合實驗結(jié)果,13 批柳蘭藥材的含水量在4.49%～5.87%之間,平均值為5.29%;總灰分在3.47%～4.55%之間,平均值為4.00%;酸不溶性灰分在0.11%～0.24%之間,平均值為0.17%;醇溶性浸出物在17.37%～30.26%之間,平均值為21.12%.以不合格率低于樣本量的20%進(jìn)行限量,建議柳蘭藥材水分不得超過12.00%,總灰分不得超過10.00%,酸不溶性灰分不得超過2.00%,醇溶性浸出物不得少于25.00%.

2.5 重金屬含量測定(《中國藥典》四部通則)

2.5.1 供試品的制備

準(zhǔn)確稱取1～13號柳蘭樣品粉末各0.25g,置于13個消解罐中,加10mL濃HNO3,預(yù)消解過夜后進(jìn)行微波消解,消解程序(時間:0-30-50min,溫度25-180-180℃).將消解罐置于趕酸儀中,至剩余溶液體積不超0.5mL,將其轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中,用超純水洗滌消解罐,并轉(zhuǎn)移至容量瓶中,加水定容至刻度,待測.同法制備空白試驗溶液,每份供試品平行3次.

2.5.2 檢測方法

銅元素用ICP-OES法測定,砷、汞元素用原子熒光光譜儀測定,鉛、鎘元素用原子吸收光譜儀測定.

對13批不同產(chǎn)地柳蘭中重金屬的含量進(jìn)行了測定,結(jié)果見表3.由表3可知,上述13批不同產(chǎn)地柳蘭中重金屬含量均符合國家限量標(biāo)準(zhǔn).

表3 重金屬含量測定結(jié)果 (單位:mg/kg)

2.6 含量測定

2.6.1 供試品溶液及對照品溶液的制備

供試品溶液的制備取本品粉末(過三號篩)約1g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,加入60%乙醇25ml,稱定重量,加熱回流1h,放冷,再稱定重量,用60%乙醇補足減失的重量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得.

對照品溶液的制備:取金絲桃苷對照品適量,精密稱定,加60%乙醇制成每1ml含50μg的溶液,即得.

2.6.2 色譜條件及方法

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;以乙腈-水為流動相;檢測波長為360nm.分別吸取對照品溶液與供試品溶液各10μL,注入液相色譜儀,測定.

2.6.3 方法學(xué)考察

1)線性關(guān)系考察

分別精密吸取對照品溶液(0.1mg/mL)5、10、15、20、25μL,按上述條件分別注入色譜儀測定,以進(jìn)樣量對峰面積進(jìn)行回歸,得回歸方程y=1320.5x-98.29,r=0.9999,金絲桃苷在0.5～2.5μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,結(jié)果見表4和圖4.

表4 線性關(guān)系考察

圖4 對照品標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2)精密度實驗

取1號柳蘭(青海澤庫縣)供試品溶液,在選定色譜條件下測定連續(xù)進(jìn)樣5次,記錄金絲桃苷峰面積,計算得其峰面積RSD 為1.96%,表明儀器精密度良好.結(jié)果見表5.

表5 精密度試驗結(jié)果

3)穩(wěn)定性試驗

取1號柳蘭(青海澤庫縣)供試品溶液,分別在0、2、4、6、8、12、24、48h 8個時間點在選定色譜條件下測定,記錄金絲桃苷峰面積,計算得其峰面積RSD 為2.0%,表明柳蘭樣品溶液在10h內(nèi)穩(wěn)定.結(jié)果見表6.

表6 穩(wěn)定性實驗結(jié)果

4)重現(xiàn)性試驗

按照上述含量測定方法對1號樣品制備6份供試品,分別進(jìn)樣10μL,測得峰面積并計算含量.記錄金絲桃苷峰面積,計算得其峰面積RSD 為1.89%,表明建立的液相分析方法重復(fù)性良好.結(jié)果見表7.

表7 重復(fù)性試驗結(jié)果

5)加樣回收率試驗

取已知含量1號柳蘭樣品1.0g,9份,分成3組,分別按藥材含量的80%,100%,120%添加對照品,按在選定色譜條件下測定,通過金絲桃苷峰面積,計算加標(biāo)后各組柳蘭樣品中金絲桃苷含量,得金絲桃苷平均回收率為100.06%(n=9),RSD 為1.12%.結(jié)果見表8.

表8 加標(biāo)回收率試驗結(jié)果

2.6.4 樣品含量測定

按上述含量測定方法,對13批樣品進(jìn)行含量測定,結(jié)果見表9.

表9 13個不同產(chǎn)地柳蘭中金絲桃苷含量

含量測定結(jié)果顯示:13批柳蘭藥材中金絲桃苷的含量平均值為1.950mg/g(0.1950%),按最低含量作為限度的制定幅度,建議柳蘭按干燥品計算,金絲桃苷(C21H20O12)不得少于0.10%.

3 討論

柳蘭系藏族習(xí)用藥材,為柳葉菜科植物柳蘭EpilobiumangustifoliumL.的干燥全草.夏、秋兩季采挖,洗凈陰干入藥.本文依據(jù)《中國藥典》2020年版四部通則,分別從性狀鑒別、顯微鑒別、薄層色譜鑒別對柳蘭藥材進(jìn)行了定性鑒別,從水分、總灰分、酸不溶性灰分、醇溶性浸出物對柳蘭藥材進(jìn)行了檢查,以金絲桃苷為對照品進(jìn)行了HPLC 含量測定,系統(tǒng)開展了藏藥材柳蘭的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究.綜合評價不同產(chǎn)地及批次的13批樣品結(jié)果,并考慮藥材產(chǎn)地、采集季節(jié)、采收加工等多方因素,建議柳蘭藥材各檢查指標(biāo)水分不得超過12.00%,總灰分不得超過10.00%,酸不溶性灰分不得超過2.00%,醇溶性浸出物不得少于25.00%;由于常見重金屬鉛、砷、鎘、汞、銅的含量測定結(jié)果均遠(yuǎn)低于國家限量標(biāo)準(zhǔn),故不做限量要求;按柳蘭藥材干燥品計算,含金絲桃苷(C21H20O12)不得少于0.10%.

本研究填補了柳蘭作為藏藥材入藥無相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的空白,所建立的定性鑒別和含量測定方法簡便可行,所制定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)可以用于柳蘭藥材的控制,為柳蘭藥材的質(zhì)量控制及應(yīng)用開發(fā)提供了參考依據(jù).