張鐵英,高 晶,方 堃,黃 顏

胃癌(GC)是最常見的消化道腫瘤之一，在我國癌癥發(fā)病率中位居第二位，死亡率排第三位，嚴(yán)重危害了人群健康[1]。胃癌起病隱匿,進(jìn)展迅速,早期診斷困難，確診時(shí)多處于中晚期，使多數(shù)病例失去了最佳手術(shù)時(shí)機(jī)[2]。除了經(jīng)典的手術(shù)和全身化療外，免疫療法也被證明具有根除癌癥的潛力[3],因此，確定新的免疫相關(guān)治療靶點(diǎn)，闡明胃癌-免疫相互作用的免疫表型，是目前胃癌免疫治療的重要研究方向。鐵氧還原蛋白是最早被鑒定的Fe-S蛋白之一，鐵氧還原蛋白1(FDX1)被認(rèn)為是一種多功能的電子傳遞蛋白，參與多種生理過程，如向細(xì)胞色素P450酶提供類固醇激素的生物合成和維生素D代謝[4]。FDX1基因的敲除會導(dǎo)致蛋白脂?；饔玫耐耆珕适Ш图?xì)胞呼吸作用的顯著減少[5]。本研究基于TCGA數(shù)據(jù)庫獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行一系列生物信息學(xué)分析,以挖掘FDX1在胃癌的臨床預(yù)測價(jià)值以及與免疫浸潤的相關(guān)性，并利用胃癌患者標(biāo)本進(jìn)行了表達(dá)驗(yàn)證，以期為胃癌的臨床診治提供新的靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 一般資料：FDX1表達(dá)譜和TCGA基因型組織表達(dá) (GTEx) 臨床泛癌數(shù)據(jù)從加州大學(xué)圣克魯斯分校 (UCSC) Xena 數(shù)據(jù)庫下載。為了評估FDX1的表達(dá)，腫瘤組織從TCGA獲得，正常組織從TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫獲得。

1.2 FDX1表達(dá)水平與患者臨床病理特征及預(yù)后相關(guān)性分析：根據(jù)下載整理的患者臨床病理信息，匹配FDX1表達(dá)水平，研究FDX1與年齡、性別、組織學(xué)分級、TNM 分期等的相關(guān)性。FDX1表達(dá)水平中位數(shù)為截?cái)嘀担瑢⒒颊叻譃楦弑磉_(dá)組和低表達(dá)組，比較2組間的生存差異，并用“survival”包繪制生存曲線。采用單因素和多因素Cox回歸分析判斷 FDX1在胃癌中的預(yù)后價(jià)值。

1.3 相關(guān)性和富集分析：使用TCGA STAD數(shù)據(jù)在胃癌中進(jìn)行FDX1-mRNA和其他mRNA的Pearson相關(guān)性分析。選擇與FDX1-mRNA最正相關(guān)的300個(gè)基因進(jìn)行富集分析以確定FDX1的功能。使用clusterProfiler中的gseKEGG和gsePathway函數(shù)進(jìn)行基因集富集分析，參數(shù)如下：nPerm=1 000，minGSSize= 10，maxGSSize= 1 000，pvalue-Cutoff=0.05。

1.4 FDX1和浸潤性免疫細(xì)胞的關(guān)系：使用cibersort工具計(jì)算免疫細(xì)胞的相對分?jǐn)?shù)，將數(shù)據(jù)上傳到cibersort Web網(wǎng)絡(luò)工具，設(shè)置默認(rèn)特征矩陣為1 000個(gè)排列，以計(jì)算每個(gè)樣品中22種浸潤性免疫細(xì)胞(包括B細(xì)胞、T細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞)的比例，并分析FDX1的表達(dá)及與其的關(guān)系。

1.5 蛋白印記法檢測胃癌中FDX1的蛋白表達(dá)：將獲得樣本勻漿后，使用強(qiáng)效RIPA裂解液(北京索萊寶公司)、提取總蛋白BCA試劑盒(上海碧云天公司)檢測蛋白質(zhì)濃度后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，然后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜(Millipore)上。使用含5%脫脂奶粉的TBST封閉液在室溫下封閉1 h。將內(nèi)參和目的條帶分離后，分別置于ELK3(SantaCruz)和GAPDH(Proteintech)一抗中4 ℃孵育過夜，吸凈一抗并清洗后加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔lgG和山羊抗鼠lgG二抗(北京康為世紀(jì)公司)稀釋比例為1∶10 000，室溫孵育1 h,吸凈二抗并清洗。用超敏ECL發(fā)光試劑盒(蘇州宇恒公司)和化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(BioRad)進(jìn)行曝光分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)算Spearman相關(guān)系數(shù)以檢查連續(xù)變量之間的關(guān)聯(lián)，分類變量之間的關(guān)系采用卡方檢驗(yàn)。對Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型進(jìn)行 Kaplan-Meier 單變量和多變量預(yù)后分析，以評估每個(gè)變量對生存的影響，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FDX1在胃癌中的表達(dá):評估TCGA和GTEx泛癌數(shù)據(jù)庫中FDX1的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，與相應(yīng)的正常組織相比，F(xiàn)DX1在結(jié)腸癌、胰腺癌、直腸腺癌、卵巢漿液性囊腺癌、胃癌等組織中呈顯著高表達(dá),見圖1D(封二)。特別是TCGA 數(shù)據(jù)庫中，F(xiàn)DX1在胃癌組織中表達(dá)水平明顯高于正常組織(P<0.05)，見圖1A(封二)。TCGA隊(duì)列在胃癌中觀察到FDX1高表達(dá)，Western blot 方法分別檢測了胃癌與正常組織中FDX1表達(dá)差異，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1B至圖1C(封二)，表明FDX1可能參與了胃癌的發(fā)病。

2.2 FDX1在胃癌中的預(yù)后價(jià)值:Kaplan-Meier分析證明，F(xiàn)DX1表達(dá)下降與胃癌患者預(yù)后較好相關(guān)。單因素和多因素Cox回歸分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)DX1低表達(dá)、年齡>65歲、M分期(遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移)是胃癌患者獨(dú)立預(yù)后因素,見表1。

表1 FDX1表達(dá)與胃癌臨床病理學(xué)特征相關(guān)性

2.3 FDX1相關(guān)性基因潛在功能及途徑:為了進(jìn)一步探索受FDX1影響的功能和途徑，使用TCGA數(shù)據(jù)進(jìn)行FDX1與胃癌中所有其他mRNA之間的相關(guān)性分析，選擇與FDX1最正相關(guān)的基因進(jìn)行富集分析，使用R軟件clusterProfiler包進(jìn)一步探索基于前300個(gè)基因的潛在功能途徑?；蚋患治鼍┒蓟蚝突蚪M百科全書(KEGG)和Reactome通路數(shù)據(jù)庫，KEGG分析結(jié)果顯示細(xì)胞因子受體相互作用顯著富集。Reactome 分析揭示了細(xì)胞外基質(zhì)途徑、G蛋白耦聯(lián)家族顯著富集，表明FDX1的低表達(dá)與胃癌中多種致癌途徑的過度激活有關(guān)。

2.4 FDX1表達(dá)與22種胃癌免疫細(xì)胞浸潤的相關(guān)性:分析375例胃癌樣本中的浸潤性免疫細(xì)胞分布，并分析FDX1表達(dá)與22種免疫細(xì)胞的關(guān)系，結(jié)果顯示FDX1表達(dá)與Th2 、Th17、輔助性Th細(xì)胞呈正相關(guān)，而與漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞、NK細(xì)胞及CD8+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等呈負(fù)相關(guān)。

3 討論

胃癌具有嚴(yán)重不良預(yù)后及高死亡率等特點(diǎn)，預(yù)計(jì)在2035年仍將在全球范圍內(nèi)具有較高的發(fā)病率[6]，因此探索新的生物學(xué)分子標(biāo)記物有利于胃癌的早期篩查、診斷及治療。FDX1是人類線粒體中的一種鐵氧還原蛋白，F(xiàn)DX1是一種多功能電子介體參與了多種生理過程，例如向細(xì)胞色素P450酶提供電子作為類固醇激素生物合成和維生素D代謝的一部分[4]。有研究發(fā)現(xiàn)FDX1對Fe-S簇的生物發(fā)生很重要，參與了類固醇激素的產(chǎn)生[7-8]。最近，F(xiàn)DX1已成為銅死亡關(guān)鍵調(diào)節(jié)基因。ZHANG等人發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)DX1的下調(diào)對LUAD細(xì)胞的生長、凋亡和細(xì)胞周期分布沒有明顯影響，但可能會影響細(xì)胞的代謝。敲除FDX1主要促進(jìn)糖酵解和脂肪酸氧化，并改變氨基酸代謝[5]。目前對FDX1的研究層出不窮，但對FDX1在癌癥中的研究特別是胃癌中的研究仍然缺乏。因此，我們通過在胃癌中探索FDX1差異表達(dá)、預(yù)后以及免疫浸潤，以期發(fā)現(xiàn)其在胃癌中的潛在價(jià)值。

本研究利用生物信息學(xué)發(fā)現(xiàn)FDX1 在多種腫瘤組織中普遍失調(diào)，在胃癌腫瘤組織中上調(diào)，而通過胃癌與正常組織中FDX1蛋白表達(dá)驗(yàn)證也證實(shí)了胃癌組織中FDX1顯著表達(dá)高于正常組織，表明FDX1可能與胃癌的發(fā)生有密切關(guān)系。通過 Kaplan-Meier plotter 數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)DX1高表達(dá)患者的預(yù)后要優(yōu)于低表達(dá)者，進(jìn)一步進(jìn)行Cox回歸分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)DX1低表達(dá)與高齡(年齡>65歲)、更深的組織學(xué)浸潤(T分期)、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度(N分期)、發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(M分期)程度相關(guān)，均為胃癌預(yù)后影響因素。而FDX1低表達(dá)與高齡(年齡>65歲)、M分期是胃癌患者的獨(dú)立預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)因素，且FDX1這種預(yù)后差異獨(dú)立于其他臨床病理因素。表明FDX1有望成為胃癌潛在的生物標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)。

GSEA富集分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)DX1的低表達(dá)與胃癌細(xì)胞外基質(zhì)途徑(ECM)顯著相關(guān)，而細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)是胃腫瘤微環(huán)境的關(guān)鍵組成部分[9]。事實(shí)上，ECM為癌細(xì)胞提供持續(xù)的增殖信號，例如生長因子和趨化因子，并保護(hù)它們免受生長抑制物的影響，充當(dāng)拮抗常規(guī)化療藥物的擴(kuò)散屏障[10]。此外，ECM受體的上調(diào)會影響細(xì)胞死亡、血管生成、癌癥化學(xué)抗性的下游信號通路細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移[8]。因此我們推測，F(xiàn)DX1下調(diào)可能通過與細(xì)胞外基質(zhì)串?dāng)_，從而影響胃癌細(xì)胞對細(xì)胞死亡、血管生成、癌癥化學(xué)抗性的下游信號通路的激活而促進(jìn)侵襲和轉(zhuǎn)移，這也是為什么通過生存分析發(fā)現(xiàn)FDX1低表達(dá)預(yù)后更差的原因，但其潛在機(jī)制仍需要深入研究。

腫瘤微環(huán)境中的基質(zhì)細(xì)胞，尤其是免疫細(xì)胞，是調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞惡性行為的重要因素,越來越多的證據(jù)闡明了它們在預(yù)測癌癥患者的結(jié)果和治療效果方面的臨床病理學(xué)意義。據(jù)報(bào)道，CD8+T細(xì)胞和腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的浸潤促進(jìn)了上皮性胃癌的進(jìn)展[11]。本研究中FDX1低表達(dá)的胃癌組CD8+T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的浸潤水平顯著升高。此外，F(xiàn)DX1的表達(dá)與CD8+T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的浸潤水平呈正相關(guān)，表明FDX1在調(diào)節(jié)腫瘤免疫學(xué)中具有關(guān)鍵作用，提示FDX1可能參與腫瘤免疫微環(huán)境調(diào)節(jié)，F(xiàn)DX1低表達(dá)可能促進(jìn)胃癌中的免疫調(diào)節(jié)，從而促進(jìn)胃癌進(jìn)展及免疫逃逸。

總之，F(xiàn)DX1與胃癌免疫浸潤水平相關(guān)，其可能通過影響巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞，進(jìn)而導(dǎo)致胃癌免疫抑制狀態(tài)及腫瘤進(jìn)展。FDX1可以視為免疫治療的相關(guān)靶點(diǎn)，并可以作為預(yù)測患者預(yù)后的標(biāo)志物。本研究的不足之處是僅在表達(dá)水平方面利用胃癌細(xì)胞進(jìn)行了驗(yàn)證。后續(xù)將進(jìn)一步開展功能驗(yàn)證來探索FDX1對胃癌細(xì)胞的影響。本研究首次將銅死亡關(guān)鍵基因FDX1作為胃癌潛在標(biāo)志物，也提示銅死亡與胃癌免疫及預(yù)后的潛在關(guān)系，為進(jìn)一步開展靶向治療開辟了新的方向。