基于刃天青微平板法檢測(cè)金黃色葡萄球菌對(duì)天然產(chǎn)物的敏感性

崔乃菠，馬境謙，余河水，3，李正，2，3，何永志，3，別松濤，3

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥制藥工程學(xué)院，天津 301617；2.組分中藥國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 301617；3.中藥制藥工程市級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，天津 301617）

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是革蘭氏陽(yáng)性菌（G+菌），在自然界中分布廣泛，不僅會(huì)導(dǎo)致皮膚和軟組織感染[1]，也是導(dǎo)致食物中毒的常見食源性細(xì)菌[2]。研究表明，由于抗生素的不合理使用導(dǎo)致金黃色葡萄球菌耐藥性增強(qiáng)[3]，影響了很多疾病的有效防治，逐漸成為了全球性的公共衛(wèi)生問(wèn)題[4]。從植物中分離出的天然產(chǎn)物具有不易產(chǎn)生耐藥性、毒副作用低、來(lái)源廣泛等特點(diǎn)，成為了國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的新熱點(diǎn)[5-7]。目前，有多種方法可用于金黃色葡萄球菌的藥敏性研究。傳統(tǒng)的微量肉湯法主要依賴于孔內(nèi)渾濁度判定藥物的抑菌效果，所用時(shí)間較長(zhǎng)且無(wú)法判斷細(xì)菌的存活狀態(tài)。其他顯色方法（例如MTT法）只能根據(jù)反應(yīng)終點(diǎn)判定藥物的最低抑菌濃度（MIC），不能動(dòng)態(tài)的反應(yīng)細(xì)菌的生長(zhǎng)狀態(tài)。鑒于此需要一種快速、高通量、低成本、易觀察的檢測(cè)方法篩選抗菌藥物。

刃天青（resazurin）是一種無(wú)毒的氧化還原染料，因其安全、經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn)已被廣泛用于真菌及細(xì)菌的藥敏實(shí)驗(yàn)[8-10]。在細(xì)胞質(zhì)中，刃天青可在多種還原酶的作用下由藍(lán)色態(tài)被還原為粉色、具有強(qiáng)熒光的試鹵靈（resorufin），見圖1，進(jìn)一步反應(yīng)會(huì)變成無(wú)色且無(wú)熒光的二氫試鹵靈（dihydroresorufin）[11]。反應(yīng)過(guò)程中，刃天青的減少與細(xì)菌數(shù)量的增加存在直接關(guān)系[12]。所以，可以通過(guò)顏色變化結(jié)合熒光法或分光光度法來(lái)判斷藥物的抑菌效果[13]。影響刃天青顯色的因素包括培養(yǎng)基的種類、刃天青濃度、菌懸液濃度和反應(yīng)時(shí)間等[14]。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑谟趦?yōu)化刃天青的工作條件，基于肉眼觀察和微孔板吸光度檢測(cè)考察五種天然產(chǎn)物對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC，求得毒力回歸方程、相關(guān)系數(shù)（R2）和半抑菌濃度（IC50）。計(jì)算Z值，判定刃天青顯色法對(duì)高通量篩選藥物的可行性，為抗金黃色葡萄球菌藥物的快速檢測(cè)提供了新思路。

圖1 刃天青顯色法原理

1 試劑與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株 金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，CMCC（B）26003）購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究所。

1.2 試劑與試藥 大黃酸（LOT：T06J10F92311）、鹽酸小檗堿（LOT：S01A10K94340）、槲皮素（LOT：C28J11Y116820）、蘭雪醌（LOT：Z30M7H12124）購(gòu)自上海源葉生物有限公司；棉子酚（LOT：028M4048V）購(gòu)自于 SIGMA；氯霉素（批號(hào)：3251476）購(gòu)自美國(guó) EMD Millipore公司；刃天青（LOT：No.415E035）、MH培養(yǎng)基、酵母浸出粉胨葡萄糖肉湯培養(yǎng)基（PDB）、胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（TSB）、磷酸鹽緩沖液（PBS）購(gòu)自于北京索萊寶科技有限公司；LB培養(yǎng)基、M63肉湯培養(yǎng)基購(gòu)自于生工生物工程（上海）股份有限公司；二甲基亞砜（DMSO）購(gòu)自于天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 智能恒溫培養(yǎng)振蕩器，天津歐諾儀器股份有限公司；生化培養(yǎng)箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；INFINITE F50全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，美國(guó)TECAN公司；SB-5200DTD型數(shù)控超聲波清洗機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；CP1003電子天平，奧豪斯儀器（常州）有限公司；AB135-S電子分析天平，瑞典Mettler Toledo公司；潔凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器，上海云泰儀器儀表有限公司。

2 方法

2.1 菌懸液配置 從金黃色葡萄球菌的固體培養(yǎng)基上挑取3～5個(gè)形態(tài)學(xué)相似的單菌落，置于5 mL培養(yǎng)基中，37℃、220 rpm培養(yǎng)18～22 h至細(xì)菌的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

2.2 藥液配置 刃天青母液配置：用無(wú)菌水配置刃天青母液濃度為5 mg/mL，過(guò)0.22 μm濾膜除菌，放置于-20℃冰箱避光保存，使用時(shí)用培養(yǎng)基稀釋至所需濃度?？咕幬锬敢旱呐渲茫篋MSO配置大黃酸母液濃度為12 800 μg/mL，蘭雪醌、棉子酚、槲皮素母液濃度為51 200 μg/mL。鹽酸小檗堿用PBS緩沖液（pH：7.2～7.4）配置母液濃度為 3 200 μg/mL。氯霉素母液根據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI2019）的要求配置為 1 600 μg/mL。

2.3 刃天青反應(yīng)條件的優(yōu)化

2.3.1 刃天青濃度對(duì)顯色法的影響 在96孔板中加入LB培養(yǎng)基80 μL和20 μL的刃天青，倍半稀釋刃天青的孔內(nèi)終濃度為160～0.625 μg/mL，每個(gè)濃度設(shè)置3組平行；用培養(yǎng)基稀釋菌懸液濃度為5×105CFU/mL，加100 μL于96孔板中。設(shè)置加20 μL刃天青和180 μL空白培養(yǎng)基的孔作為對(duì)照。37℃、120 rmp恒溫振蕩培養(yǎng)12 h，每小時(shí)觀察顏色變化，并用酶標(biāo)儀測(cè)定其吸光度值（OD570-OD600）。

2.3.2 菌懸液濃度對(duì)刃天青顯色法的影響 在96孔板中加入LB培養(yǎng)基80 μL和20 μL孔內(nèi)終濃度為20μg/mL的刃天青，培養(yǎng)基稀釋菌懸液濃度為5×108～5×102CFU/mL，加 100 μL 于 96 孔板中，每個(gè)濃度設(shè)置3組平行。對(duì)照設(shè)置和培養(yǎng)條件如2.3.1。

2.3.3 不同培養(yǎng)基對(duì)刃天青顯色法的影響 在96孔板中加入不同的培養(yǎng)基（LB、MH、TSB、M63、PDB）80 μL，孔內(nèi)終濃度為 20 μg/mL 的刃天青 20 μL 和濃度為5×105CFU/mL的菌懸液100 μL。每種培養(yǎng)基平行實(shí)驗(yàn)3次。對(duì)照設(shè)置和培養(yǎng)條件如2.3.1。

2.3.4 確定刃天青反應(yīng)時(shí)間 96孔板中加入LB培養(yǎng)基 80 μL，孔內(nèi)終濃度為 20 μg/mL 的刃天青 20 μL和濃度為5×105CFU/mL的菌懸液100 μL。對(duì)照設(shè)置和培養(yǎng)條件如2.3.1。刃天青顏色從氧化狀態(tài)的藍(lán)色變?yōu)檫€原狀態(tài)的粉色則說(shuō)明細(xì)菌生長(zhǎng)。

2.4 天然產(chǎn)物抑菌活性的測(cè)定 刃天青法：根據(jù)篩選出的刃天青工作的最優(yōu)氧化還原條件，利用刃天青顯色法進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)。加入80 μL不同濃度的含藥培養(yǎng)基于96孔板的1-10列，（大黃酸和蘭雪醌的孔內(nèi)終濃度為128～0.25 μg/mL；棉子酚和槲皮素的孔內(nèi)終濃度為1 024～2 μg/mL；鹽酸小檗堿的孔內(nèi)終濃度為128～0.25 μg/mL），選用氯霉素作為抗生素對(duì)照（孔內(nèi)終濃度為32～0.0625 μg/mL）。調(diào)節(jié)菌懸液濃度為 0.5麥?zhǔn)蠞岫龋?×108CFU/mL）[15]，用培養(yǎng)基1∶200稀釋菌液濃度為5×105CFU/mL，刃天青濃度為 200 μg/mL，加 100 μL 菌液和 20 μL 刃天青于96孔板中。11列加100 μL菌懸液、20 μL刃天青和80 μL空白培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照，12列加180 μL培養(yǎng)基和20 μL刃天青作為陽(yáng)性對(duì)照，放置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中，120 rpm培養(yǎng)9 h，通過(guò)測(cè)定吸光度和觀察顏色變化來(lái)判定藥物的抑菌效果。用以下公式計(jì)算抑菌率[16]。

微量肉湯法：96孔板的1-10列分別加入100μL不同濃度藥液和濃度為5×105CFU/mL的菌懸液，藥液的孔內(nèi)終濃度同刃天青法，11列加100 μL的空白培養(yǎng)基和菌懸液作為陽(yáng)性對(duì)照，12列加200 μL的空白培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照。并計(jì)算其抑菌率。

2.5 數(shù)據(jù)處理 用Origin 2019b軟件進(jìn)行繪圖，得到刃天青反應(yīng)最優(yōu)條件。根據(jù)幾率值表將藥物抑菌率轉(zhuǎn)化得到的幾率值作為縱坐標(biāo)（y），藥物濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)（x），得到五種藥物在兩種檢測(cè)方法下的毒力回歸方程、R2和IC50。并通過(guò)下列公式計(jì)算Z因子[17]，分析刃天青在高通量實(shí)驗(yàn)中的可行性。

其中，SD－，SD+分別表示陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組的標(biāo)準(zhǔn)偏差；Ave－，Ave＋分別表示陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組的平均值。

3 結(jié)果與分析

3.1 刃天青反應(yīng)條件的優(yōu)化

3.1.1 刃天青濃度的影響 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，刃天青濃度范圍在2.5～40 μg/mL時(shí)，刃天青濃度與吸光度值之間的線性關(guān)系良好（圖2），其線性關(guān)系為y=0.036 7x+0.003 2，R2=0.998 9。反應(yīng)過(guò)程中，當(dāng)刃天青濃度小于5 μg/mL時(shí)，吸光值較低，顏色變化不明顯，不利于觀察，即使在線性范圍內(nèi)，也不適合作為下一步的反應(yīng)條件；刃天青濃度大于40 μg/mL時(shí)，吸光值增加速率變慢；大于80 μg/mL時(shí)，吸光值開始下降，可能是因?yàn)槿刑烨酀舛冗^(guò)高會(huì)抑制細(xì)菌體內(nèi)還原酶的活性[18]。本研究選擇刃天青的孔內(nèi)反應(yīng)濃度為20 μg/mL進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

圖2 刃天青濃度對(duì)吸光值的影響

3.1.2 菌懸液濃度的影響 在反應(yīng)時(shí)間12h內(nèi)，20μg/mL的刃天青濃度下，菌懸液濃度為5×104CFU/mL～5×107CFU/mL時(shí)，刃天青的顏色變化明顯，初始態(tài)和終止態(tài)的吸光度值相差較大（圖3），適用于刃天青顯色法的檢測(cè)。若菌濃過(guò)高，刃天青變色所需時(shí)間過(guò)短，可能藥物還未與細(xì)菌作用，刃天青就已被還原，降低檢測(cè)方法的敏感性[19]；若菌濃過(guò)低，實(shí)驗(yàn)孔顏色和吸光度值都與刃天青對(duì)照組無(wú)明顯差異，不適用于刃天青顯色。故選用菌懸液濃度為5×105CFU/mL進(jìn)行藥物敏感性實(shí)驗(yàn)，該濃度刃天青顯色明顯，便于觀察。

圖3 菌懸液濃度對(duì)吸光值的影響

3.1.3 不同培養(yǎng)基的影響 圖4為L(zhǎng)B、MH、TSB、YPD、M63五種培養(yǎng)基在刃天青濃度為20 μg/mL，菌懸液濃度為5×105CFU/mL的條件下，吸光值隨時(shí)間的變化曲線。數(shù)據(jù)表明，LB、MH、TSB 3種培養(yǎng)基的吸光值變化較大，顏色變化明顯，易用肉眼觀察，適用于刃天青顯色法檢測(cè)。M63培養(yǎng)基在加入刃天青后立即變?yōu)闇\粉色，YPD培養(yǎng)基顏色變化也不明顯。這可能與培養(yǎng)基滅菌后酸化有關(guān)[21]。培養(yǎng)基酸化后將刃天青轉(zhuǎn)化為淡粉色物質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)選用LB培養(yǎng)基進(jìn)行下一步操作。

圖4 培養(yǎng)基類型對(duì)吸光值的影響

3.1.4 刃天青反應(yīng)時(shí)間的確定 刃天青顯色依賴于細(xì)菌體內(nèi)還原酶將藍(lán)色的氧化態(tài)還原為粉色的還原態(tài)，但是若進(jìn)一步反應(yīng)，則會(huì)變?yōu)闊o(wú)色。所以選用刃天青濃度為20 μg/mL，菌懸液濃度為5×105CFU/mL時(shí)，孔內(nèi)顏色完全變?yōu)榉凵臅r(shí)間點(diǎn)作為反應(yīng)時(shí)間。選用9 h為藥敏實(shí)驗(yàn)的反應(yīng)時(shí)間，該時(shí)間點(diǎn)的目測(cè)結(jié)果與數(shù)據(jù)顯示（圖5）結(jié)果一致。

圖5 刃天青反應(yīng)時(shí)間的確定

3.2 天然產(chǎn)物對(duì)金黃色葡萄球菌抑制作用的測(cè)定 采用上述刃天青顯色法所確定的最優(yōu)條件，以氯霉素為抗生素對(duì)照，測(cè)定大黃酸、鹽酸小檗堿、蘭雪醌、槲皮素、棉子酚對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用。肉眼觀察得到五種藥物的MIC（以鹽酸小檗堿為例，圖6），求得毒力回歸方程、R2和IC50（表1）。結(jié)果表明刃天青顯色法觀察得到5種天然產(chǎn)物的MIC與微量肉湯法得到的結(jié)果一致。大黃酸、蘭雪醌、棉子酚、槲皮素、鹽酸小檗堿、氯霉素的MIC分別為 8、4、1 024、256、64 和 2 μg/mL。其中，大黃酸和蘭雪醌的抑菌活性突出，幾乎可以達(dá)到抗生素水平。刃天青顯色法所得的R2略高于或與微量肉湯法得到的R2相差不大，兩種方法所求得的IC50也較為接近，說(shuō)明刃天青顯色法的靈敏性和準(zhǔn)確性較好，適用于天然產(chǎn)物抑菌活性的判定。Z因子是評(píng)判高通量篩選方法穩(wěn)定性和可行性的標(biāo)準(zhǔn)，用來(lái)評(píng)價(jià)細(xì)菌在96孔板中的生長(zhǎng)是否具有一致性。若Z＜0，則說(shuō)明該方法無(wú)法區(qū)分陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，不適合高通量篩選；若0≤Z＜0．5，說(shuō)明該方法處于臨界狀態(tài)；若 0．5≤Z＜1，則說(shuō)明該方法穩(wěn)健性和靈敏性好，適用于高通量篩選藥物[16]。兩種方法的Z因子范圍均在0．5～1之間，且刃天青檢測(cè)法略高于微量肉湯法，說(shuō)明刃天青顯色法穩(wěn)健性和靈敏性良好，適用于高通量篩選抗金黃色葡萄球菌的藥物。

圖6 刃天青在鹽酸小檗堿藥敏性實(shí)驗(yàn)中的顏色變化

表1 天然產(chǎn)物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制活性

4 討論

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，刃天青在一定濃度范圍內(nèi)（2．5～40 μg/mL），吸光值變化與其呈正相關(guān)關(guān)系，顯色靈敏。這與唐靜等[12]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。當(dāng)刃天青濃度過(guò)低時(shí)（≤5 μg/mL），顏色變化不明顯；當(dāng)刃天青濃度過(guò)高時(shí)（≥40 μg/mL），兩者之間的線性關(guān)系不好，原因可能是刃天青濃度過(guò)高會(huì)抑制細(xì)菌體內(nèi)還原酶的活性[19]，還原得到試鹵靈的效率變低。所以，刃天青濃度范圍應(yīng)在10～40 μg/mL之間。在考察菌懸液濃度對(duì)吸光值的影響時(shí)，濃度為5×104CFU/mL～5×107CFU/mL的菌懸液對(duì)刃天青顯色反應(yīng)靈敏。若接種物濃度過(guò)高，會(huì)使刃天青顯色過(guò)快，降低實(shí)驗(yàn)靈敏性；若接種物濃度過(guò)低，細(xì)菌體內(nèi)的還原酶不足以將所有刃天青還原，顯色前后變化都不明顯。培養(yǎng)基結(jié)果表明，用LB、MH、TSB培養(yǎng)的菌懸液的吸光值隨著時(shí)間變化明顯，顏色變化易于觀察，適用于刃天青顯色法檢測(cè)。但M63、YPD培養(yǎng)的菌懸液在加入刃天青后就開始變色，原因是刃天青不僅是檢驗(yàn)氧化還原反應(yīng)的指標(biāo)，也是酸堿指示劑。M63和YPD培養(yǎng)基在滅菌后酸化，將刃天青還原為無(wú)色化合物。所以，在基于刃天青顯色的微量滴定法，培養(yǎng)基不僅需要提供足夠的營(yíng)養(yǎng)以確保細(xì)菌的生長(zhǎng)，還應(yīng)考慮培養(yǎng)基對(duì)刃天青顯色的影響，避免使用產(chǎn)生低pH的培養(yǎng)基。本次實(shí)驗(yàn)選擇拐點(diǎn)9 h作為藥敏實(shí)驗(yàn)的反應(yīng)時(shí)間，該時(shí)間點(diǎn)孔內(nèi)刃天青由藍(lán)色的氧化態(tài)變?yōu)榉凵倪€原態(tài)，且沒(méi)有進(jìn)一步被還原為無(wú)色。常用的微量肉湯法對(duì)反應(yīng)時(shí)間并沒(méi)有明確的規(guī)定，12、18、24 h均有被選用為反應(yīng)終點(diǎn)時(shí)間。終點(diǎn)時(shí)間選定的不同可能會(huì)引起測(cè)定結(jié)果出現(xiàn)偏差，反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可能會(huì)導(dǎo)致藥物活性降低從而造成測(cè)得的MIC偏高；反應(yīng)時(shí)間過(guò)短，可能會(huì)導(dǎo)致藥物未與細(xì)菌完全作用而致使測(cè)得的MIC偏低。相較于微量肉湯法，刃天青顯色法選用孔內(nèi)顏色變化的時(shí)間點(diǎn)作為終止反應(yīng)時(shí)間，不僅所用時(shí)間縮短而且結(jié)果較為準(zhǔn)確。

刃天青顯色法的藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，大黃酸、棉子酚、槲皮素、蘭雪醌、鹽酸小檗堿五種天然產(chǎn)物對(duì)金黃色葡萄球菌均具有一定的抑制作用。其中，大黃酸和蘭雪醌的抑菌活性幾乎與抗生素達(dá)到同一水平。刃天青法測(cè)得的MIC與微量肉湯法所得到的結(jié)果相同。參考袁高慶等[19]的方法求得毒力回歸方程，其R2略高于或與微量肉湯法相近，兩種方法求得的IC50相差不大。刃天青顯色法的Z值為0.91，在0.5～1之間，適用于高通量的藥敏實(shí)驗(yàn)。

本研究顯示，以刃天青為檢測(cè)試劑，在96孔板中進(jìn)行金黃色葡萄球菌的藥敏實(shí)驗(yàn)，更容易確定反應(yīng)時(shí)間且反應(yīng)時(shí)間較短，靈敏性和準(zhǔn)確度高，不影響細(xì)胞的正常代謝[12]，易于通過(guò)顏色變化動(dòng)態(tài)檢測(cè)細(xì)菌的代謝活性，從而判斷藥物的抑菌效果，為高通量篩選抗菌藥物提供了新思路。