固相萃取-氣相色譜質(zhì)譜法測定食品中9種大麻素

唐慶強，夏林兵，曹 丹，楊 方，吳春燈，薛昆鵬

（1.福州海關技術(shù)中心，福建 福州 350001；2.三明海關綜合技術(shù)服務中心，福建 三明 365001；3.杭州國際旅行衛(wèi)生保健中心（杭州海關口岸門診部），浙江 杭州 310016；4.金華海關綜合技術(shù)服務中心，浙江 金華 321001；5.浙江月旭材料科技有限公司，浙江 金華 321001）

大麻素是大麻植物中天然含有的一類萜酚類化合物[1]，其中Δ9-四氫大麻酚（Δ9-tetrahydrocannabinol，Δ9-THC）具有較強的精神活性和致幻成癮作用，被《麻醉品單一公約》[2]、《精神藥物公約》[3]和《聯(lián)合國禁止非法販運麻醉藥品和精神藥物公約》[4]等國際公約列為國際管制的毒品。合成大麻素是一類藥理、生理作用與Δ9-THC相似的化合物，最初由科學家以治療疾病的目的發(fā)明出來，但最終因其具有精神活性而被濫用[5]。合成大麻素在實驗室內(nèi)就能夠人工合成，因此也被稱為“策劃藥”或“實驗室毒品”，其吸食成癮效果是天然大麻的4～5 倍[6]，現(xiàn)已成為使用量最大的新精神活性物質(zhì)種類[7]。近年來，國際上對大麻管控的態(tài)度有所變化，大麻合法化運動在部分國家迅速蔓延[8]，世界衛(wèi)生組織也在2018年向聯(lián)合國麻醉藥品委員會提出解除對低THC含量的大麻及產(chǎn)品列管的建議[9]。但我國和世界上其他國家對大麻制品，特別是合成大麻素都采取嚴格管控的措施，我國《麻醉藥品品種目錄》、《精神藥品品種目錄》[10]、《非藥用麻醉藥品和精神藥品管制品種增補目錄》[11]和歷次增補公告[12-13]中，先后將48種合成大麻素和7種合成大麻素化學結(jié)構(gòu)通式列為管制品。但不法分子為逃避打擊，不斷修改化合物的結(jié)構(gòu)從而開發(fā)出新種類的合成大麻素，目前已從第一代的萘甲?；胚犷惏l(fā)展至第八代的吲哚酰胺類[14-15]。不僅如此，不法分子還將大麻素噴灑在香料或藥草上晾干，以減少被識別的概率，甚至還偽裝成奶茶、咖啡、餅干、開心果、飲料、酒或糖果等各種食品[16-19]，具有極強的隱蔽性和社會危害性。

當前檢測大麻素的方法大多針對毛發(fā)[20-21]、血液[22-23]、尿液[24-25]和疑似毒品[26-27]等基體，涉及食品基質(zhì)的研究往往集中在THC、大麻二酚（cannabidiol，CBD）和大麻酚（cannabinol，CBN）等天然大麻素上[28-30]，對少數(shù)特定食品中合成大麻素[31-32]結(jié)構(gòu)、種類的研究較少?，F(xiàn)有研究無法滿足當前已出現(xiàn)在多種食品中非法添加合成大麻素的現(xiàn)狀。

本研究結(jié)合已公布的非法添加報道，選擇有代表性的食品基質(zhì)，以9種常見的大麻素為分析對象，結(jié)構(gòu)上涵蓋了天然大麻素和萘甲?；胚帷h(huán)己基苯酚、苯酰基吲哚和吲哚酰胺類等多種類型的合成大麻素（表1），對操作條件進行優(yōu)化，建立適用于多種食品基質(zhì)中大麻素的固相萃取-氣相色譜質(zhì)譜分析方法。

表1 9種大麻素信息Table 1 Information about nine cannabinoids tested in this study

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Δ9-THC、CBN、CBD、戊基-3-(4-乙基-1-萘甲?；?吲哚（JWH-210）、順式-5-(1,1-二甲基庚基)-2-[(1R,3S)-3-羥基環(huán)己基]苯酚（CP-47497）、1-(5-氟戊基)-3-(1-萘甲?；?-1H-吲哚（AM2201）、戊基-3-(4-甲氧基苯甲酰基)吲哚（RCS-4）、N-(1-氨甲酰基-2-甲基丙基)-1-(環(huán)己基甲基)吲唑-3-甲酰胺（AB-CHMINACA）和N-(1-氨甲?；?2,2-二甲基丙基)-1-戊基吲唑-3-甲酰胺（ADB-PINACA）標準溶液（質(zhì)量濃度均為1 mg/mL）天津阿爾塔科技有限公司；甲醇、乙腈（均為色譜純） 德國Merck公司；Captiva EMR-Lipid固相萃取柱（100 mg，3 mL） 美國安捷倫科技公司；Oasis二乙烯苯-N-乙烯基吡咯烷酮（HLB）固相萃取柱（60 mg，3 mL） 美國Waters公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純或優(yōu)級純；實驗用水符合GB/T 6682—2008《分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法》中規(guī)定的一級水。

橄欖油、豬肉、牛奶、蜂蜜、面包、茶葉、大豆、可樂和啤酒均購自當?shù)爻?。火麻仁、火麻籽、火麻茶、火麻糊、火麻油、火麻膏和火麻粉均購自廣西火麻食品專賣店。

1.2 儀器與設備

Trace1300/ISQ7000型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國賽默飛世爾科技公司；3-18K高速離心機 德國Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液的配制

混合標準溶液：移取適量9種大麻素標準溶液，用甲醇稀釋配制成1.0 μg/mL的混合標準工作液，于-20 ℃避光保存。

基質(zhì)標準曲線：選擇與被測樣品性質(zhì)相同或相似的空白樣品按照1.3.2節(jié)進行前處理，得到空白基質(zhì)溶液。精確吸取一定量的混合標準溶液，用空白基質(zhì)溶液逐級稀釋成質(zhì)量濃度為10、20、50、100、200 μg/L和500 μg/L的基質(zhì)標準曲線。

1.3.2 樣品前處理

1.3.2.1 樣品提取

橄欖油：稱樣1.00 g（精確至0.01 g）于50 mL離心管中，加入10 mL乙腈，渦旋混勻30 s，50 ℃超聲提取15 min，10 000 r/min離心5 min，取5 mL上清液待凈化。

大豆、豬肉、面包、蜂蜜、茶葉：稱樣1.00 g（精確至0.01 g）于50 mL離心管中，加入10 mL甲醇，渦旋混勻30 s，50 ℃超聲提取15 min，10 000 r/min離心5 min，取5 mL上清液；加入5 mL水稀釋后渦旋混勻，10 000 r/min離心5 min，取全部上清液待凈化。

牛奶：稱樣1.00 g（精確至0.01g）于50 mL離心管中，加入5 g氯化鈉和10 mL甲醇，渦旋混勻30 s，50 ℃超聲提取15 min，再加入1 g三氯乙酸，靜置15～20 min沉淀蛋白質(zhì)后，10 000 r/min離心5 min，取5 mL上清液；加5 mL水稀釋后渦旋混勻，10 000 r/min離心5 min，取全部上清液待凈化。

可樂、啤酒：稱樣1.00 g（精確至0.01 g）于50 mL離心管中，加入5 g氯化鈉和10 mL甲醇，渦旋混勻30 s，50 ℃超聲提取15 min，10 000 r/min離心5 min，取5 mL上清液，加5 mL水稀釋后渦旋混勻后待凈化。

1.3.2.2 樣品凈化

橄欖油：將待凈化液轉(zhuǎn)移至事先用2 mL乙腈活化過的EMR固相萃取柱中，自然重力流出后，用5 mL乙腈淋洗小柱，減壓抽干30 s。上樣和洗脫流速均應小于1 mL/min。收集全部流出液，在40 ℃下氮吹至干，加入1 mL甲醇溶液，渦旋混勻30 s，超聲3 min，過0.22 μm濾膜后待測定。

其他樣品：將待凈化液轉(zhuǎn)移至事先用5 mL甲醇和5 mL水活化過的HLB固相萃取柱中，自然重力流出后，用5 mL 50%甲醇溶液淋洗小柱，棄去全部淋洗液并減壓抽干30 s，用5 mL乙腈洗脫小柱。上樣和洗脫流速均應小于1 mL/min。收集全部洗脫液，在40 ℃下氮吹至干，加入1 mL甲醇溶液，渦旋混勻30 s，超聲3 min，過0.22 μm濾膜后待測定。

1.3.3 固相萃取氣相色譜-質(zhì)譜分析

1.3.3.1 色譜條件

HP-5MS毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；進樣口溫度290 ℃；進樣量1.0 μL；不分流進樣；載氣為高純氦氣（99.999%）；流速為恒定流量1.5 mL/min；升溫程序：初始70 ℃，保持2 min；以10 ℃/min升至180 ℃；再以15 ℃/min升至300 ℃，保持9 min。

1.3.3.2 質(zhì)譜條件

電子電離源；電離能量70 eV；離子源溫度310 ℃；傳輸線溫度290 ℃；溶劑延遲時間7.5 min；檢測方式為選擇離子監(jiān)測。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件優(yōu)化

大麻素主要為非極性和弱極性化合物，本實驗比較了中等極性的DB-17MS色譜柱和非極性的HP-5MS色譜柱測定9種大麻素的效果。結(jié)果表明，兩種色譜柱均可實現(xiàn)9種大麻素的全部分離；但除JWH-210外，使用HP-5MS色譜柱測定的峰面積均高于DB-17MS，平均峰面積為后者的1.8 倍。這可能與HP-5MS色譜柱（固定相）對分離的目標物具有選擇寬泛的特點，對非極性和弱極性化合物的分離效果更佳有關?？紤]到同時分析多種目標物的需要，選擇HP-5MS色譜柱進行測定，選擇離子流色譜圖如圖1所示。

圖1 9種大麻素標準品的選擇離子流色譜圖Fig. 1 Selected ion monitoring chromatogram of mixed standard of nine cannabinoids

考察了250～310 ℃進樣口溫度下9種大麻素峰面積情況。如圖2所示，隨著進樣口溫度的升高，9種大麻素的峰面積呈現(xiàn)整體上升趨勢，在進樣口290～300 ℃下達到最高。為進一步明確最佳的進樣口溫度，在290 ℃和300 ℃的進樣口溫度下分別連續(xù)進樣6 次，比較精密度，結(jié)果顯示，290 ℃進樣口溫度下峰面積的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為2.5%～5.8%，300 ℃進樣口溫度下峰面積的RSD為1.8%～11.2%。因此，選擇290 ℃進樣口溫度作為實驗條件。

圖2 不同進樣口溫度下的峰面積Fig. 2 Peak areas at different inlet temperatures

2.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化

比較了質(zhì)譜中全掃描和選擇離子監(jiān)測模式同時分析9種大麻素的情況。先用單級質(zhì)譜的全掃描模式獲得9種目標物的總離子流色譜圖，確定每種大麻素的保留時間，再用選擇離子監(jiān)測模式建立5 組多通道時間段，每個時間段內(nèi)掃描1～3 個化合物，每種化合物選擇定量離子1 個，定性離子2～3 個，得到9種大麻素的離子信息，如表2所示。

表2 9種大麻素的保留時間和監(jiān)測離子Table 2 Retention times and monitoring ions of the nine cannabinoids

2.3 提取條件的優(yōu)化

考察了甲醇和乙腈這兩種文獻中檢測大麻最常用的提取溶劑[22-28]，使用空白樣品加標的方式比較兩種溶劑對大麻素的提取效果，結(jié)果表明，兩種溶液均有較好的提取效果，橄欖油基質(zhì)中乙腈對各種大麻素的平均提取回收率為93.7%，高于甲醇提取時的85.0%；而其他基質(zhì)中甲醇對各目標物的提取回收率均大于90%，高于乙腈的74.3%。為驗證這一結(jié)論，使用天然含有Δ9-THC、CBD、CBN的火麻油、火麻仁和火麻茶樣品，用峰面積比較兩種溶劑的提取效果。由圖3可知，實際樣品中的提取效果與上述空白樣品加標實驗結(jié)果一致。因此，選用乙腈作為油脂類樣品的提取溶劑，用甲醇作為其他樣品的提取溶劑。

圖3 不同提取溶劑對火麻油、火麻仁和火麻茶的提取效果比較Fig. 3 Comparison of extraction efficiencies of different extraction solvents for hemp oil, hemp seed and hemp tea

還比較了渦旋提取、均質(zhì)提取和超聲提取等方式的提取效率，結(jié)果表明，在相同的提取時間下，超聲提取對各種大麻素的提取效率均高于90%，優(yōu)于渦旋振蕩和均質(zhì)提取的效率。繼續(xù)對超聲提取的時間和溫度進行優(yōu)化，由圖4可知，超聲溫度對各大麻素的影響差別不大，整體上當超聲溫度高于50 ℃時，峰面積趨于穩(wěn)定；當超聲時間大于15 min時，目標物的峰面積基本不再增加。因此，最佳提取條件為：使用乙腈作為油脂類樣品的提取溶劑，用甲醇作為其他類別樣品的提取溶劑，并在50 ℃下超聲提取15 min。

圖4 不同超聲時間和超聲溫度對提取效果的影響Fig. 4 Effect of ultrasonic temperature and time on the recoveries of nine cannabinoids

2.4 凈化方法的優(yōu)化

根據(jù)基質(zhì)的特點和目標物的結(jié)構(gòu)特性結(jié)合參考相關文獻，使用空白樣品加標的方式，比較了中性氧化鋁小柱（Alumina-N）[33]、EMR固相萃取柱和凝膠滲透色譜（gel permeation chromatography，GPC）[34]對橄欖油樣品的凈化效果，還比較了HLB固相萃取柱和QuEChERS基質(zhì)分散萃取[29-32]對其他基質(zhì)樣品的凈化效果。

由圖5a可知，對于油類基質(zhì)樣品，Alumina-N回收率一般，EMR固相萃取柱和GPC凈化方法都能取得較好的回收率，但GPC凈化操作繁瑣、耗時長且需額外增加凝膠滲透色譜儀設備，所以選擇EMR固相萃取柱凈化油類樣品。由圖5b可知，對于其他基質(zhì)的樣品，HLB固相萃取柱的回收率優(yōu)于QuEChERS方法，所以選擇HLB固相萃取柱凈化其他基質(zhì)樣品。在此基礎上，進一步比較了BIOSIL、RayCure、Agela、BESEP等多個不同品牌的固相萃取柱和不同體積分數(shù)甲醇溶液和乙腈溶液作為淋洗液和洗脫液的結(jié)果，并結(jié)合基質(zhì)效應影響的評估方法，研究了不同淋洗液和洗脫液體積（3～7 mL）對凈化效果的影響。結(jié)果表明，使用5 mL乙腈淋洗Captiva EMR-Lipid固相萃取柱和使用5 mL 50%甲醇溶液洗脫Oasis HLB固相萃取柱時，能達到較好的回收率和凈化效果。

圖5 不同凈化方式對橄欖油樣品（a）和其他基質(zhì)樣品（b）的凈化效果Fig. 5 Effects of different purification methods on the recoveries of cannabinoids from olive oil samples (a) and samples of other matrices (b)

2.5 內(nèi)外標法選擇

比較了外標法和內(nèi)標法在定量上的差別。當使用外標法定量時，在各目標物1、2、10 倍定量限（limit of quantitation，LOQ）3 個添加濃度水平的平均回收率為65.2%～117.9%。當使用Δ9-THC-D3作為內(nèi)標定量時，各目標物的平均回收率為80.1%～142.7%，回收率普遍偏高。這可能是由于各種大麻素在結(jié)構(gòu)和性質(zhì)上存在差別，而只使用一種Δ9-THC的同位素內(nèi)標時，無法同時對多種大麻素進行結(jié)果校正。由于很難獲得每種大麻素的同位素內(nèi)標，外標法回收率的結(jié)果效果令人滿意，因此，最終采用外標法進行定量分析。

2.6 基質(zhì)效應考察

氣相色譜-質(zhì)譜分析時，由于待測成分的離子化效應被改變，導致目標化合物發(fā)生離子增強或抑制現(xiàn)象。本實驗涉及的食品基質(zhì)較多，不同基質(zhì)對目標物會產(chǎn)生不同的基質(zhì)效應。參考Gonzalez等[35]的方法，使用甲醇配制的標準曲線斜率（kA）和用空白基質(zhì)配制的相同濃度標準曲線斜率（kB）進行比較，按基質(zhì)效應/%＝（kB-kA）/kA×100式子計算各種樣品的基質(zhì)效應。|基質(zhì)效應|＜20%時為弱基質(zhì)效應；20%＜|基質(zhì)效應|＜50%時為中等強度基質(zhì)效應；|基質(zhì)效應|＞50%時為強基質(zhì)效應。結(jié)果表明，各種基質(zhì)食品中9種大麻素整體呈現(xiàn)出基質(zhì)增加，且面包、大豆、橄欖油樣品的基質(zhì)效應相對較高，這可能與其油脂含量高有關。對此，根據(jù)降低基質(zhì)效應的方法[36]，采取優(yōu)化凈化條件、改善稀釋過程和使用空白基質(zhì)配制標準曲線等方法減少和校正基質(zhì)效應的影響，如圖6所示，各種基質(zhì)的基質(zhì)效應值在-21.3%～48.0%之間，均處在中等強度或弱基質(zhì)效應范圍內(nèi)，可以滿足檢測方法的要求。

圖6 9種不同基質(zhì)食品中的基質(zhì)效應情況Fig. 6 Matrix effect of the cannabinoids from nine different matrices

2.7 標準曲線、檢出限（limit of detection，LOD）和LOQ分析

精密吸取9種大麻素混合標準溶液，用甲醇稀釋成質(zhì)量濃度為10、20、50、100、200 μg/L和500 μg/L的系列混合標準工作溶液，按質(zhì)量濃度由低到高的順序進樣分析。以9種大麻素化合物的峰面積為縱坐標，質(zhì)量濃度為橫坐標，繪制標準曲線，獲得線性方程和相關系數(shù)（R2）。由表3可知，9種大麻素在10～500 μg/L范圍內(nèi)呈良好線性相關，R2均在0.999 2以上，能滿足測試工作的需求。在各陰性基質(zhì)的樣品中分別添加1～100 μg/L的9種大麻素標準溶液，按優(yōu)化后前處理方法和儀器條件測定，以定量離子信噪比為3和10時響應定義方法的LOD和LOQ。根據(jù)信噪比的結(jié)果，部分種類基質(zhì)樣品的LOD和LOQ可以更低，但考慮到操作便捷和使用方便，基于最不靈敏化合物的LOD和LOQ進行了統(tǒng)一，各種基質(zhì)中大麻素的LOD和LOQ分別為1～15 μg/kg和2.5～50 μg/kg。

表3 9種大麻素的回歸方程、R2、LOD和LOQTable 3 Regression equations, correlation coefficients (R2), LODs and LOQs of the nine cannabinoids

2.8 準確度和精密度分析

為驗證方法的準確度和精密度，用空白的橄欖油、大豆等9種食品進行加標回收實驗，分別添加相當于1、2、10 倍LOQ的9種大麻素標準品，每個水平測定6 次，計算方法的回收率和精密度。由表4可知，9種大麻素在各種食品基質(zhì)中的平均回收率為65.2%～117.9%，RSD為2.0%～12.7%，說明該方法準確度高、重復性好，能夠滿足多種食品基質(zhì)中9種大麻素的定量分析要求。

2.9 實際樣品分析

應用建立的方法對市場購買的16種火麻食品進行測定，包括火麻茶、火麻油、火麻膏、火麻糊、火麻粉、火麻仁和火麻籽等。由表5可知，所有火麻食品均未檢出合成大麻素，但均不同程度地檢出CBD、Δ9-THC和CBN等天然大麻素，其中火麻油中大麻素的整體含量最高；不同品牌火麻油或火麻茶中3種大麻素含量差別較大，這可能與原料、產(chǎn)地、大麻籽用量等有關。

表4 9種大麻素在不同食品中添加回收率和RSD（n＝6）Table 4 Recoveries and RSDs of the nine cannabinoids spiked into different foods (n = 6)

表5 實際樣品中大麻素類化合物的檢測結(jié)果Table 5 Results of determination of cannabinoids in real samples μg/kg

3 結(jié) 論

通過優(yōu)化色譜、質(zhì)譜條件，建立了固相萃取氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法對多種食品基質(zhì)中9種大麻素的檢測方法，涵蓋了多種國內(nèi)外關注的食品種類。結(jié)果表明，該方法操作簡單、快速，針對的大麻素種類包括了多種類型的合成大麻素，各種食品中的LOQ為2.5～50 μg/kg，加標的平均回收率為65.2%～117.9%，精密度（RSD）在2.0%～12.7%范圍內(nèi)，均滿足國內(nèi)外限量的要求，具有較好的實用性和適用性，為監(jiān)控食品中非法添加的大麻素提供了技術(shù)支持和監(jiān)測手段。