郭 超，陳 超，李慧晨，王 真，徐若琳，趙文濤，李瑩瑩，郭文萍,2,*，張朝暉

（1.中國(guó)肉類食品綜合研究中心，北京 100068；2.肉類加工技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100068；3.中國(guó)海關(guān)科學(xué)技術(shù)研究中心，北京 100026）

“注水肉”是指在生豬、牛、羊屠宰前或屠宰過程中，通過灌胃或向血管泵注等形式，將水摻入動(dòng)物體內(nèi)得到的生、鮮肉品[1]。注水肉是存在已久的行業(yè)亂象，目前“注水肉”不斷升級(jí)，“注膠肉”開始增多，注入“膠水”的肉品比“注水肉”更加難以識(shí)別，各種食用膠因具有強(qiáng)大的增稠性、保水性，被不法分子利用，各類媒體已多有報(bào)道[2-3]。膠水的成本低廉，制備“注膠肉”屬于欺詐行為，灌注的膠水中往往摻雜有防腐劑，可引入致病微生物、外來物質(zhì)污染、重金屬超標(biāo)等風(fēng)險(xiǎn)，危害食品安全[2]。

常見的食用膠有卡拉膠、黃原膠、瓜爾膠等[4-5]。其中瓜爾膠是一種具有較強(qiáng)增稠效果的親水性膠體，是由甘露糖通過β-1,4糖苷鍵連接而成的主鏈和α-1,6糖苷鍵連接的半乳糖側(cè)鏈構(gòu)成的半乳糖甘露聚糖，甘露糖與半乳糖物質(zhì)的量比約為2∶1，分子質(zhì)量2×106Da左右，自然或者微生物降解分子質(zhì)量仍可達(dá)8×105Da[6-12]。其結(jié)構(gòu)式如圖1所示。β-甘露聚糖酶是一類能夠酶解含有β-1,4-D-甘露糖苷鍵的甘露多糖的水解內(nèi)切酶。經(jīng)過β-甘露聚糖酶酶解后的瓜爾膠，只被切斷主鏈甘露糖的β-1,4糖苷鍵，而對(duì)通過α-1,6糖苷鍵相連的支鏈半乳糖沒有酶解作用，從而形成2～10 個(gè)單糖單元通過糖苷鍵連接的半乳甘露低聚糖[13-16]。

圖1 瓜爾膠的結(jié)構(gòu)式Fig. 1 Structure of guar gum

GB 2760—2014《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中將瓜爾膠列為“可在各類食品中按生產(chǎn)需要適量使用的食品添加劑”，僅在稀奶油及較大嬰兒和幼兒配方食品中有限量[17]，因此瓜爾膠應(yīng)用十分廣泛，被應(yīng)用于各類食品中，包括雞血豆腐、牛肉糜制品、香腸等[18-21]，但生鮮肉不允許使用添加劑，近年來劣質(zhì)肉類食材的不斷出現(xiàn)，“注水肉”、“注膠肉”等屢有報(bào)道，讓消費(fèi)者防不勝防。

目前“注膠肉”尚無相關(guān)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)或規(guī)范，僅可通過相關(guān)水分含量標(biāo)準(zhǔn)判斷。GB 18394—2020《畜禽肉水分限量》中規(guī)定的豬肉的水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)不得高于76%[22]，由于識(shí)別的有效性欠缺，對(duì)違法樣品打擊力度不足[23-24]。目前國(guó)內(nèi)外研究中采用最多檢測(cè)“注膠肉”的技術(shù)是低場(chǎng)核磁共振、近紅外、分子生物學(xué)等方法[25-31]。前2種方法均依賴于主成分分析、判別模型等化學(xué)計(jì)量學(xué)手段，不易推廣，而分子生物學(xué)方法基質(zhì)干擾較為復(fù)雜，因此上述方法的使用難度較大，并且無法進(jìn)行準(zhǔn)確的定量，難以作為執(zhí)法檢驗(yàn)的依據(jù)，限制了其應(yīng)用。

瓜爾膠分子質(zhì)量大，因此常規(guī)手段難以檢測(cè)，有部分學(xué)者研究將瓜爾膠通過酸解或酶解等方式降解后再進(jìn)行檢測(cè)，如離子色譜法[32-33]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[34]。其中離子色譜法將瓜爾膠水解后測(cè)定單糖，但未能建立測(cè)定畜肉中瓜爾膠的定量方法。而將膠體經(jīng)過水解后，利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀對(duì)特定分子質(zhì)量的小分子進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)的方法更具有普適性，并且能夠避免假陽性判別的出現(xiàn)，但對(duì)于動(dòng)物源性食品尤其是畜肉中水溶性膠體的液相色譜-質(zhì)譜法檢測(cè)研究在國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)中鮮見報(bào)道。因此本方法將膠體經(jīng)過酶解后，利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀對(duì)特定分子質(zhì)量的小分子進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)。針對(duì)新鮮肉品中瓜爾膠主要來源為人為添加，該方法可作為打擊“注膠”畜肉的有效技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲酸、乙腈（均為色譜純） 德國(guó)CNW公司；磷酸氫二鈉、一水合檸檬酸（均為分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；β-甘露聚糖酶（CAS：37288-54-3，純度≥98%，10 000 U/g）、瓜爾膠（純度99%） 上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1290II-6470高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀 美國(guó)Agilent公司；HM100刀式研磨儀 北京格瑞德曼儀器設(shè)備有限公司；Milli-Q Reference c超純水機(jī) 美國(guó)Millipore公司；EFAA-HM-01多管旋渦混合儀 上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；LYNX 4000型高速冷凍離心機(jī)美國(guó)Thermo公司；3K15型高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Sigma公司；HILIC Plus色譜柱（4.6 mm×100 mm，3.5 μm）、HLB固相萃取柱（200 mg/6 mL） 美國(guó)Waters公司；C18固相萃取柱（200 mg/6 mL)、中性氧化鋁柱（500 mg/6 mL，200～300 目）、濾膜（PTFE，0.22 μm） 上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

緩沖溶液（pH 3.6）：磷酸氫二鈉溶液（0.2 mol/L）：稱取14.20 g Na2HPO4于燒杯中，用水溶解并轉(zhuǎn)移至500 mL容量瓶，定容；檸檬酸溶液（0.1 mol/L）：稱取21.01 g一水合檸檬酸于燒杯中，用水溶解并轉(zhuǎn)移至1 000 mL容量瓶，定容。量取678 mL 0.1 mol/L檸檬酸溶液于燒杯中，加入約322 mL磷酸氫二鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至3.6，混勻。

β-甘露聚糖酶溶液（0.2 mg/mL）：稱取0.01 gβ-甘露聚糖酶于具塞試管中，加入50 mL緩沖溶液，混勻。臨用現(xiàn)配。

0.1%甲酸溶液：移取甲酸1 mL至1 000 mL容量瓶中，用水定容，混勻。

1.3.2 樣品制備

稱取試樣2 g于50 mL離心管中，依次加入9 mL緩沖溶液（pH 3.6）和0.5 mLβ-甘露聚糖酶溶液（0.2 mg/mL），加蓋后渦旋10 min，放入（55±5）℃水浴振蕩器中酶解過夜（至少7 h），4 ℃、12 000 r/min離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移至玻璃試管中，沸水浴中加熱10 min，冷卻后轉(zhuǎn)移至比色管中，用水定容至10 mL，搖勻后取1 mL于離心管中，加入1 mL乙腈混合搖勻，4 ℃、4 500 r/min離心2 min，取上清液待凈化。

取1 mL待凈化液，通過中性氧化鋁柱（無需活化），用刻度管接收流出液，再用2 mL水洗脫，合并接收液。將接收液用乙腈補(bǔ)至4 mL，混勻后過0.22 μm濾膜，供測(cè)定。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制

標(biāo)準(zhǔn)基質(zhì)（2 g/kg）：準(zhǔn)確稱取瓜爾膠0.2 g（精確至0.000 1 g），置于200 mL燒杯中，加入10 g水，迅速攪拌均勻，然后邊攪拌邊加入空白試樣，補(bǔ)足至100 g，再次均質(zhì)，配制成2 g/kg的標(biāo)準(zhǔn)基質(zhì)，臨用現(xiàn)制。

分別稱取標(biāo)準(zhǔn)基質(zhì)：0、0.03、0.1、0.2、0.4、0.8、2 g（精確至0.000 1 g）于50 mL離心管中，不足2 g的，用空白試樣補(bǔ)足至2 g（精確至0.01 g），與樣品同時(shí)進(jìn)行酶解凈化，即上機(jī)質(zhì)量濃度為0、0.75、2.5、5、10、20、50 μg/mL。計(jì)算質(zhì)量濃度時(shí)，以標(biāo)準(zhǔn)基質(zhì)的實(shí)際稱量值計(jì)算。

1.3.4 儀器條件

液相色譜條件：HILIC Plus色譜柱（4.6 mm×100 mm，3.5 μm）；柱溫30 ℃；流速0.4 mL/min；進(jìn)樣量5 μL；流動(dòng)相A為0.1%甲酸溶液，B為乙腈；梯度洗脫程序：0.0 min，5% A，95% B；1.0～4.5 min，60% A，40% B；4.6～6.0 min，5% A，95% B。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源；采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple reaction monitoring，MRM）模式正掃描；電離電壓3 kV；輔助氣溫度300 ℃；鞘氣溫度300 ℃；干燥氣流量9 L/min；其他參數(shù)見表1。

表1 MRM的優(yōu)化條件Table 1 Optimal MRM MS parameters

2 結(jié)果與分析

2.1 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法建立

如圖2所示，質(zhì)譜峰分別為m/z365.105 16、527.158 45、689.211 36、851.264 83、1 013.317 93、1 175.370 85，共6 個(gè)主要峰。在半乳甘露低聚糖分子中，每個(gè)結(jié)構(gòu)單元是1 個(gè)單糖（甘露糖或半乳糖）殘基，其質(zhì)量數(shù)是162，因此，質(zhì)譜峰m/z=18+162×n+23，其中n表示單糖數(shù)目、23是與低聚糖結(jié)合的鈉離子。各峰之間相差162，與已知單元是一個(gè)單糖（甘露糖或半乳糖）殘基相符合[16]。

圖2 瓜爾膠酶解產(chǎn)物的高分辨質(zhì)譜圖Fig. 2 High-resolution mass spectra of enzymatic hydrolysate of guar gum

因酶解物三糖響應(yīng)較強(qiáng)，且為瓜爾膠的最小結(jié)構(gòu)單元，因此選用527.1（酶解物三糖）用于質(zhì)譜MRM檢測(cè)，其分子式為推斷其結(jié)構(gòu)如圖3所示[35]，推斷其可能的斷鍵機(jī)理如圖4所示。

圖3 用于質(zhì)譜MRM檢測(cè)的酶解物三糖的結(jié)構(gòu)信息Fig. 3 Structural information of the trisaccharide in the enzymatic hydrolysate used for mass spectral analysis

半乳甘露低聚糖親水性強(qiáng)，在ZORBAX Eclipseplus C18、Kinetex F5、ZORBAX SB等色譜柱中保留較弱，不能得到良好的峰形。使用HILIC親水柱對(duì)其進(jìn)行色譜分離，比較乙腈+水、乙腈+甲酸（0.1%）、甲醇+水、甲醇+甲酸（0.1%）4種流動(dòng)相體系對(duì)酶解物三糖的分離效果，乙腈+甲酸（0.1%）作為流動(dòng)相可以得到較好分離度及峰形，對(duì)瓜爾膠酶解產(chǎn)物的洗脫程序進(jìn)行優(yōu)化）。0～3 min設(shè)置為流向廢液部分，這一設(shè)定降低了復(fù)雜基質(zhì)的影響，4～4.5 min為酶解物三糖的出峰區(qū)間，4.6～6.0 min流動(dòng)相回到初始比例，并為下一次進(jìn)樣做準(zhǔn)備。

圖4 斷鍵機(jī)理推斷示意圖Fig. 4 Schematic diagram of the mechanism of bond breakage

在豬肉基質(zhì)中，使用外加標(biāo)方法加入瓜爾膠，經(jīng)提取凈化后上機(jī)檢測(cè)，如圖5所示，酶解物三糖在肉類基質(zhì)中得到有效分離且響應(yīng)值滿足實(shí)驗(yàn)要求。

圖5 豬肉的酶解物（a）和添加1 g/kg瓜爾膠的豬肉酶解物（b）三糖MRMFig. 5 MRM Mass spectra of enzymatic hydrolysate of pork without (a) and with 1 g/kg guar gum (b)

2.2 前處理方法

2.2.1 水解方式的選擇

瓜爾膠的水解方式有酶解、酸解、熱解、微波、輻照與超聲等多種方式[36-38]。酶解、酸解的應(yīng)用最為廣泛，酸解瓜爾膠往往使用濃度大、酸性較強(qiáng)的酸，如鹽酸、硫酸等，酸解后的瓜爾膠直接進(jìn)入高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)，對(duì)色譜柱、質(zhì)譜損傷較大；而酶解條件較為溫和，一般采用弱酸-鹽的緩沖體系，且酶解可以選用具有選擇性的酶，如β-甘露聚糖酶可以酶切β-1,4-D-甘露糖苷鍵，α-半乳糖酶可以酶切α-1,6糖苷鍵。

2.2.2 緩沖溶液pH值

酶解過程主要受酶解溶液的pH值、酶濃度、酶解溫度、酶解時(shí)間4 個(gè)因素影響。以含有0.3%瓜爾膠的豬肉、羊肉、牛肉為底物，磷酸氫二鈉-檸檬酸為緩沖體系，在不同pH值條件進(jìn)行酶解實(shí)驗(yàn)，探索最佳酶解條件。雖然體系選用弱酸-鹽緩沖體系，但酶解過程中還存在酸水解的情況，因此實(shí)驗(yàn)中同時(shí)考察了酸水解的程度，結(jié)果如圖6所示，在pH 2.6～6.0范圍內(nèi)，酸水解程度相近，在pH 6.6～8.0范圍，酸水解程度下降。在pH 2.6～4.0范圍內(nèi)，酶水解程度最佳，pH 4.6～6.0范圍酶水解程度大幅度下降，在pH 6.6～8.0范圍，β-甘露聚糖酶失去活性，酶水解效率低于酸水解效率。因此，采用pH值為3.6的緩沖溶液。

圖6 緩沖溶液pH值對(duì)瓜爾膠水解的影響Fig. 6 Effect of buffer solution pH on the hydrolysis of guar gum

2.2.3 酶解時(shí)間

圖7 酶解時(shí)間對(duì)瓜爾膠水解的影響Fig. 7 Effect of hydrolysis time on the hydrolysis of guar gum

分別以含有0.3%瓜爾膠的豬肉、羊肉、牛肉為底物，考察酶解時(shí)間10 min至20 h的酶解效率，以探索最佳酶解條件。如圖7所示，在7 h前，瓜爾膠酶解速率較快，含有0.3%瓜爾膠的豬肉、羊肉、牛肉分別在6～7 h能夠達(dá)到酶解平衡，因此酶解時(shí)間選用不低于7 h。

2.2.4 加酶量

使用的β-甘露聚糖酶純度不小于98%，酶活力10 000 U/g。以含有0.3%瓜爾膠的豬肉、羊肉、牛肉為底物，考察加酶量對(duì)瓜爾膠酶解的影響，如圖8所示，在加酶量為30 μg時(shí)酶解過程即達(dá)到平衡，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，保證酶過量，選用加酶量為100 μg進(jìn)行酶解。

圖8 加酶量對(duì)瓜爾膠水解的影響Fig. 8 Effect of enzyme dosage on the hydrolysis of guar gum

2.2.5 酶解溫度

以含有0.3%瓜爾膠的豬肉、羊肉、牛肉為底物，考察酶解溫度為40～80 ℃范圍的瓜爾膠酶解效率，如圖9所示，在較低溫度時(shí)，酶解效率較低，酶解物三糖響應(yīng)較低；在50～60 ℃范圍，酶解效率較高，酶解物三糖響應(yīng)較高且較為穩(wěn)定；在65～80 ℃范圍，β-甘露聚糖酶的酶活力受到影響，酶解效率較低。因此，選用（55±5）℃為酶解溫度。

圖9 酶解溫度對(duì)瓜爾膠水解的影響Fig. 9 Effect of temperature on the hydrolysis of guar gum

2.2.6 凈化方式的選擇

樣品在提取過程中雖會(huì)去除大部分的脂肪、蛋白等干擾物質(zhì)，但提取溶液中仍含有大量的雜質(zhì)，會(huì)在后續(xù)的檢測(cè)過程中產(chǎn)生明顯的基質(zhì)效應(yīng)，對(duì)于基質(zhì)效應(yīng)嚴(yán)重的目標(biāo)化合物的檢測(cè)還需進(jìn)一步凈化。相較于液液萃取等凈化方式，固相萃取柱的凈化方式可以有效保留目標(biāo)物，除掉多余雜質(zhì)，而且操作快捷，因此選取固相萃取柱對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步富集、除雜。

圖10 固相萃取柱對(duì)瓜爾膠水解的影響Fig. 10 Effect of solid phase extraction column on the hydrolysis of guar gum

凈化過程中，不同固相萃取柱類型會(huì)對(duì)目標(biāo)化合物有不同程度的保留，在實(shí)驗(yàn)過程中，為了得到凈化、富集效果都比較好的結(jié)果，考察不同固相萃取柱對(duì)酶解物三糖的凈化效果?；诿附馕锶菢O性弱、易溶于水，不易溶于有機(jī)溶劑的性質(zhì)，實(shí)驗(yàn)選取HLB、C18、中性氧化鋁柱3種固相萃取柱進(jìn)行對(duì)比。分別取用含0.3%瓜爾膠的豬肉、羊肉、牛肉的酶解液，經(jīng)過3種固相萃取柱凈化，結(jié)果如圖10所示。結(jié)果表明：中性氧化鋁柱作為一種能夠有效去除樣品中脂肪和蛋白質(zhì)的SPE小柱，能夠明顯降低基質(zhì)效應(yīng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明其對(duì)酶解物三糖有較好的凈化效果，因此本方法選取中性氧化鋁固相萃取柱作為凈化小柱。

2.2.7 定容溶劑的選擇

定容溶劑的選擇會(huì)影響目標(biāo)化合物的峰形和離子化效率，因此對(duì)定容溶劑進(jìn)行優(yōu)化。經(jīng)過凈化后，溶液為水系，可以增加有機(jī)溶劑，以提高目標(biāo)物的離子化效率，本方法選用乙腈，乙腈不僅可以沉淀蛋白，增加凈化效果，且能與色譜流動(dòng)相保持一致，可以改善峰形。如圖11所示，分別向含0.3%瓜爾膠的豬肉酶解液中增加乙腈體積分?jǐn)?shù)，并折算相對(duì)含量，在乙腈體積分?jǐn)?shù)約為40%～60%之間時(shí)，離子化效率好，相對(duì)含量最高，且峰形良好。

圖11 定容溶劑對(duì)瓜爾膠水解的影響Fig. 11 Effect of amount of acetonitrile added to enzymatic hydrolysate of pork on the hydrolysis of guar gum

2.3 分析特征量

2.3.1 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)是由與被分析物一起流出的其他內(nèi)源性物質(zhì)造成的，例如鹽類、胺類、脂肪酸、甘油酸酯等，這些干擾物與目標(biāo)化合物共同流出，可影響待分析物的霧化、揮發(fā)、裂分、化學(xué)反應(yīng)及帶電過程，導(dǎo)致進(jìn)入質(zhì)譜的離子減少（離子抑制）或增多（離子增強(qiáng)），從而影響定量結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性。

通過繪制溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線和基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線，按照[（基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率-溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率）/溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率]×100評(píng)價(jià)畜肉的基質(zhì)效應(yīng)大小。結(jié)果為負(fù)表示基質(zhì)抑制效應(yīng)，結(jié)果為正表示基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)。當(dāng)基質(zhì)效應(yīng)為-20%～20%時(shí)為弱基質(zhì)效應(yīng)；基質(zhì)效應(yīng)為-50%～-20%或20%～50%時(shí)為中等基質(zhì)效應(yīng)；當(dāng)基質(zhì)效應(yīng)小于-50%或大于50%時(shí)為強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)。分別繪制質(zhì)量濃度范圍為0～50 μg/mL的溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線和豬肉、牛肉、羊肉基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線，酶解物三糖的基質(zhì)效應(yīng)由表2可見，3種基質(zhì)中基質(zhì)效應(yīng)在-96.04%～-97.17%之間，此結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)的基質(zhì)效應(yīng)會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響，需通過基質(zhì)曲線校正基質(zhì)效應(yīng)的影響。因此本實(shí)驗(yàn)通過配制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線扣除基質(zhì)帶來的影響。

表2 酶解物三糖的基質(zhì)效應(yīng)Table 2 Matrix effect of the trisaccharide

針對(duì)豬、牛、羊基質(zhì)中，評(píng)價(jià)基質(zhì)匹配曲線及基質(zhì)前加標(biāo)曲線中基質(zhì)效應(yīng)的影響，分別使用基質(zhì)匹配曲線、空白基質(zhì)加標(biāo)曲線繪制校正曲線，線性范圍約為0～50 μg/mL，曲線相關(guān)系數(shù)如圖12a～c所示，空白基質(zhì)加標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線與基質(zhì)匹配曲線相差較大，為能獲得良好的回收率，選用空白基質(zhì)加標(biāo)的方式制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。因瓜爾膠水溶液為懸濁液，采用懸濁液的方式加標(biāo)，線性不佳，因此本方法采用配制含瓜爾膠的基質(zhì)方式制作曲線。

基質(zhì)前加標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線能夠?qū)η疤幚磉^程的影響進(jìn)行校正，但是由于在實(shí)際檢測(cè)過程中無法針對(duì)每一個(gè)基質(zhì)均制備基質(zhì)前加標(biāo)校正曲線，因此其無法完全校正基質(zhì)效應(yīng)對(duì)目標(biāo)物的干擾。為考察豬牛羊基質(zhì)曲線的基質(zhì)效應(yīng)影響，選取多種空白基質(zhì)，配制含瓜爾膠的基質(zhì)配置標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖12d所示，不同基質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線相差較小，在檢測(cè)過程中，可選用某一種基質(zhì)制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖12 不同基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 12 Standard curves of different substrates

2.3.2 線性、檢出限和定量限結(jié)果

基質(zhì)加標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別稱取含2 g/kg瓜爾膠的基質(zhì)0、0.03、0.1、0.2、0.4、0.8、2 g于50 mL試管中，不足2 g的用空白試樣補(bǔ)足至2 g，與樣品共同酶解凈化，即上機(jī)質(zhì)量濃度為0、0.75、2.5、5、10、20、50 μg/mL，得到酶解物三糖在7 個(gè)質(zhì)量濃度水平下繪制的線性方程及相關(guān)系數(shù)R2。以3 倍信噪比及10 倍信噪比確定檢出限及定量限，結(jié)果如表3所示。

表3 酶解物三糖的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限Table 3 Linear equations, correlation coefficients, LODs and LOQs of the trisaccharide in pork, beef and mutton

2.3.3 回收率及精密度結(jié)果

瓜爾膠添加水平設(shè)定為0.100、0.200、1.00 g/kg。選取3種不同空白基質(zhì)樣品，分別添加不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，然后按照本檢測(cè)方法進(jìn)行實(shí)際檢測(cè)，結(jié)果如表4所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明瓜爾膠在0.100～1.00 g/kg添加水平回收率范圍為85.4%～109.8%。相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（變異系數(shù)）均小于10%。

表4 瓜爾膠在3種基質(zhì)中加標(biāo)回收結(jié)果Table 4 The recovery rate results of guar gum in three matrices

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)建立豬、牛、羊等畜肉中瓜爾膠測(cè)定的高效液相色譜-質(zhì)譜法，樣品經(jīng)β-甘露聚糖酶酶解，加入乙腈沉淀蛋白后離心，上清液經(jīng)過中性氧化鋁柱凈化，用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定，外標(biāo)法定量。該法前處理過程簡(jiǎn)單，且方法線性范圍、精密度及檢出限均滿足相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的要求，該方法可作為打擊“注膠”畜肉中瓜爾膠的有效技術(shù)手段。該方法的建立彌補(bǔ)了當(dāng)前針對(duì)畜肉中瓜爾膠檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的缺失，為打擊“畜肉非法注膠”的不法現(xiàn)象提供了有效的監(jiān)測(cè)手段。

瓜爾膠是甘露糖與半乳糖物質(zhì)的量比約為2∶1的半乳糖甘露聚糖，但半乳甘露聚糖不僅包括瓜爾膠，還包括甘露糖、半乳糖比例與瓜爾膠相同或不同的膠；甘露糖、半乳糖比例與瓜爾膠相近的有田菁膠、胡蘆巴膠、刺槐豆膠等，這幾種半乳甘露聚糖在β-甘露聚糖酶的作用下同樣可以產(chǎn)生相似的酶解物三糖，但由于畜肉中不允許添加半乳甘露聚糖膠，因此檢出酶解物三糖就有添加半乳甘露聚糖膠的風(fēng)險(xiǎn)，可以用以打擊非法添加；本實(shí)驗(yàn)可以解決已知添加某種膠（如瓜爾膠）時(shí)添加量的測(cè)定，當(dāng)添加2種或2種以上半乳甘露聚糖膠時(shí)只能計(jì)算總量（以某一種膠計(jì)算）。