基于礦物元素指紋的地理標(biāo)志羊肉真實(shí)性鑒別

齊 婧，李瑩瑩，姜 銳，張 晨，張順亮，郭文萍，王守偉

（中國肉類食品綜合研究中心，肉類加工技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100068）

地域特色產(chǎn)品所具有的品質(zhì)特性主要取決于產(chǎn)地的自然因素。經(jīng)審核批準(zhǔn)以地理名稱進(jìn)行命名的產(chǎn)品，受到國家法律或國際條約的相關(guān)權(quán)利保護(hù)[1]。在中國，鹽池灘羊、蘇尼特羊、巴里坤哈薩克羊都是地理標(biāo)志羊種。這些羊肉因得天獨(dú)厚的地理環(huán)境培養(yǎng)的獨(dú)特品質(zhì)，備受消費(fèi)者推崇[2]，其價(jià)格明顯高于普通羊肉。錯(cuò)貼標(biāo)簽或者故意假冒的違法行為會給合法的生產(chǎn)者和消費(fèi)者帶來不利影響。要對地理標(biāo)志羊肉進(jìn)行法律保護(hù)、維護(hù)市場秩序、保障消費(fèi)者權(quán)益，需要一種真實(shí)性鑒別和判斷技術(shù)的支撐。

礦物元素指紋分析被認(rèn)為是食品產(chǎn)地溯源領(lǐng)域最可靠的技術(shù)之一[3-4]，不同地域特色羊肉體內(nèi)礦物元素的組成受到區(qū)域氣候條件、生物環(huán)境相互作用和生物代謝等的影響而存在指紋差異。目前大量文獻(xiàn)報(bào)道了應(yīng)用礦物元素分析進(jìn)行肉類產(chǎn)地溯源的研究[5-8]，礦物質(zhì)元素分析技術(shù)對于肉類產(chǎn)地溯源可靠，并具有廣泛應(yīng)用前景?；诘V物元素的食品產(chǎn)地溯源研究的思路比較統(tǒng)一：1）樣品收集；2）多元素分析法的開發(fā)；3）多元素分析數(shù)據(jù)的積累；4）化學(xué)計(jì)量學(xué)分析數(shù)據(jù)；5）驗(yàn)證構(gòu)建模型的有效性；6）實(shí)例驗(yàn)證[9]。其中數(shù)據(jù)分析與建模是關(guān)鍵技術(shù)之一，目前的研究都是采用監(jiān)督模式的判別分析方法和分類算法，例如線性判別分析、偏最小二乘法判別分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）等[10-16]。判別分析方法的局限性是只適用于收集到樣本的種類和范圍，更廣泛的應(yīng)用需要非常大的數(shù)據(jù)量構(gòu)建系統(tǒng)數(shù)據(jù)模型。例如，要驗(yàn)證地理標(biāo)志羊肉鹽池灘羊的真實(shí)性則需要收集所有的可能欺詐類型，這顯然是不現(xiàn)實(shí)的，因此該技術(shù)用于真實(shí)性鑒別的發(fā)展受到了限制。

針對某一種高值的地理標(biāo)志羊肉真實(shí)性而言，單分類建模方法具有非常大的應(yīng)用性能。單分類策略是將真實(shí)類視為目標(biāo)類，將其劃定邊界生成一個(gè)模型，建模時(shí)沒有其他非真實(shí)樣本的貢獻(xiàn)，在預(yù)測階段，如果未知樣本與目標(biāo)類匹配，則將其視為真實(shí)樣本，如果不匹配，則為非真實(shí)樣本[17]。單分類方法主要有類類比軟獨(dú)立建模（soft independent modeling of class analogy，SIMCA）、單分類支持向量機(jī)（One-Class SVM）和基于PLS方法等[18]。相較于目前常用的監(jiān)督分類方法，單分類建模最大的優(yōu)點(diǎn)是不需要包含所有可能形式的欺詐樣本，減少了樣本和數(shù)據(jù)收集的系統(tǒng)工作量，在真實(shí)性鑒別領(lǐng)域具有更廣泛的應(yīng)用性能[19]。目前單分類方法主要應(yīng)用于基于光譜數(shù)據(jù)的食品認(rèn)證、原產(chǎn)地確認(rèn)和真實(shí)性鑒別。比如解決基于近紅外光譜的橄欖油和蜂蜜的真實(shí)性問題[20]，Xu Lu等[21]應(yīng)用單分類建模手段，通過對近紅外光譜數(shù)據(jù)集的分析，用于安吉白茶的地理產(chǎn)地識別和純芝麻油的摻假鑒別，以及西湖藕粉的原產(chǎn)地分析[22]。Rodionova等[23]以基于近紅外數(shù)據(jù)鑒別牛至草真實(shí)性為實(shí)例，驗(yàn)證單分類模型的應(yīng)用性能，證明其可以成功地應(yīng)用于揭露各種類型的偽造食品。Meza-Márquez等[24]應(yīng)用SIMCA分析中紅外數(shù)據(jù)，研究肉糜參雜檢測。Vinciguerra等[25]將其應(yīng)用于基于三維熒光光譜數(shù)據(jù)的巴西紅酒的產(chǎn)地真實(shí)性鑒別。單分類建模被認(rèn)為是一種非常適用于非目標(biāo)分析的分類器[23]。盡管單分類方法更適合于解決許多實(shí)際問題，但是它的應(yīng)用仍然不多，主要原因之一是這些方法在目前的化學(xué)計(jì)量學(xué)包（包括商業(yè)的、免費(fèi)的和開源的）中缺乏[26]。目前也還沒有報(bào)道將單分類建模方法應(yīng)用于我國地理標(biāo)志羊肉的真實(shí)性鑒別中，我國研究還是普遍采用傳統(tǒng)的判別手段[27-30]，因此技術(shù)停留在只能對所搜集樣本種類進(jìn)行鑒別的瓶頸階段。

本實(shí)驗(yàn)采用電感耦合等離子體質(zhì)譜（inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS）儀測定鹽池灘羊、巴里坤哈薩克羊、蘇尼特羊3種地理標(biāo)志羊肉礦物元素，分析其礦物元素特征，應(yīng)用最常用的單分類建模方法SIMCA[19]分別對3種羊肉建模，研究基于礦物元素指紋結(jié)合單分類建模方法實(shí)現(xiàn)我國地理標(biāo)志羊肉真實(shí)性鑒別。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

所采集的寧夏灘羊樣本n=20，哈薩克羊樣本n=18，蘇尼特羊樣本n=15。鹽池灘羊采集自寧夏鹽池縣、巴里坤哈薩克羊采集自新疆巴里坤哈薩克自治縣、蘇尼特羊采集自內(nèi)蒙古錫林郭勒盟。采集樣品均為7～10 月齡健康羊的后腿肉。同時(shí)采集市售16 個(gè)普通羊肉樣品，用于地理標(biāo)志羊肉真實(shí)性模型驗(yàn)證。樣品為羊瘦肉樣品，樣品采集后，將樣品保存在-20 ℃條件下直至處理。

65%硝酸、30%過氧化氫（均為優(yōu)級純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；多元素標(biāo)準(zhǔn)品（B、Al、Ca、Ti、V、Mn、Fe、Co、Cu、Zn、As、Se、Rb、Sr、Ba、Tl、Na、Mg、K） 加拿大SCP Science公司；Rh、Re、In、Ge標(biāo)準(zhǔn)品 美國Inorganic Ventures公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HM100攪拌機(jī) 中國Grindertech公司；TOPEX+微波消解系統(tǒng) 中國PreeKem科學(xué)儀器有限公司；ICAP RQ ICP-MS聯(lián)用儀 美國Thermo Fisher公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

將樣品切成小塊，并在攪拌機(jī)中斬拌均勻。稱取約0.500 0 g斬拌均勻的樣品，加入6 mL的65%硝酸和2 mL的30%過氧化氫進(jìn)行微波消解。將消化后的溶液轉(zhuǎn)移到塑料樣品管中，并用超純水（18.2 MΩ·cm，20 ℃）定容至15 mL。每個(gè)樣品進(jìn)行2 次平行實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 樣品測定

用ICP-MS測定礦物元素含量（B、Al、Ca、Ti、V、Mn、Fe、Co、Cu、Zn、As、Se、Rb、Sr、Ba、Tl、Na、Mg、K）。

ICP-MS最佳操作條件如下：射頻功率1 550 W，氦氣流量4.35 mL/min，石英玻璃同心霧化器，采樣時(shí)間為0.1 s，重復(fù)2 次。Rh、Re、In和Ge的內(nèi)標(biāo)溶液用于消除基質(zhì)效應(yīng)和儀器偏差。內(nèi)標(biāo)溶液為單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液配制成質(zhì)量濃度為10 μg/L的混合溶液。采用外標(biāo)法進(jìn)行定量分析，標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸系數(shù)大于0.99。所有結(jié)果均為2 次平行測試結(jié)果的平均值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS（版本22.0，美國IBM）進(jìn)行方差分析（ANOVA）、多重比較分析，研究不同地理來源樣品中礦物元素?cái)?shù)據(jù)的差異。用安捷倫Mass Profiler Professional軟件進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA）并作三維PCA散點(diǎn)圖。使用SIMCA-P（版本14.0，Umetrics AB）對樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行單分類建模，以及測試集的真實(shí)性驗(yàn)證。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同地理標(biāo)志羊肉中礦物元素含量差異分析

2.1.1 元素含量

表1 不同地理標(biāo)志羊肉中元素含量水平Table 1 Concentration levels of elements in mutton from different sheep breeds under the protection of geographical indication

測定不同地理標(biāo)志羊肉樣品中B、Al、Ca、Ti、V、Mn、Fe、Co、Cu、Zn、As、Se、Rb、Sr、Ba、Tl、Na、Mg、K元素含量，有的痕量元素含量低于或接近檢出限（檢出限數(shù)據(jù)參照本課題組之前的研究數(shù)據(jù)[8]），不適用于元素含量的測定和分析，排除含量低于或接近檢出限的元素，篩選出Ca、Ti、Mn、Fe、Co、Cu、Zn、Se、Rb、Sr、Na、Mg、K共13 個(gè)元素進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果見表1。由表1可知，羊肉中K含量最高，Na與K相同，也是機(jī)體保持滲透壓并參與神經(jīng)興奮的關(guān)鍵元素，Na是含量第2高的元素，其次是常量元素Mg、Ca、Zn、Fe，其他元素含量較少，各元素的含量水平與文獻(xiàn)報(bào)道一定范圍內(nèi)存在差異，是由于地區(qū)、喂養(yǎng)系統(tǒng)和肉的部位差異引起。變異系數(shù)是通過測定同一來源樣本的元素含量相對標(biāo)準(zhǔn)偏差評估離散度。如果離散度過大，則意味著來自同一產(chǎn)地羊肉樣品含量差異較大，不適合用作溯源變量。從表1看出，篩選的元素離散度相對不大，可以作為溯源變量。

2.1.2 差異分析

圖1 各地理標(biāo)志羊肉元素含量（Z-score標(biāo)準(zhǔn)化）指紋圖譜Fig. 1 Fingerprint profile of characteristic elements (Z-score standardized) in geographical indication mutton

為探究不同地理標(biāo)志羊肉中礦物元素含量的差異，進(jìn)行方差分析、多重比較分析以及PCA。方差分析結(jié)果顯示（表1），樣品中Na、K、Ca、Fe、Cu、Zn、Se、Rb、Sr和Ti的P值均小于0.05，這表明這10種元素在地區(qū)之間具有顯著差異。通過多重比較分析比較來自不同產(chǎn)地羊肉樣品中元素的平均值，以發(fā)現(xiàn)差異來源。需要3種羊肉之間兩兩比較，方差齊性的元素，選擇拜佛倫尼多重比較，方差不齊的元素選擇塔姆黑尼多重比較。比較結(jié)果顯示：蘇尼特羊Ca和Ti含量顯著高于鹽池灘羊和巴里坤哈薩克羊，蘇尼特羊的Cu和K含量顯著低于鹽池灘羊和巴里坤哈薩克羊，巴里坤哈薩克羊中Fe、Zn和Se含量顯著高于鹽池灘羊和蘇尼特羊，鹽池灘羊的Na含量顯著低于巴里坤哈薩克羊和蘇尼特羊，3種羊肉之間的Sb和Sr含量均存在顯著差異，鹽池灘羊的Sb含量最高，其次是巴里坤哈薩克羊，蘇尼特羊最低，蘇尼特羊的Sr含量最高，其次是鹽池灘羊，巴里坤哈薩克羊Sr含量最低。Rb和Sr作為能顯示地球化學(xué)行為的元素，其含量因養(yǎng)殖地質(zhì)環(huán)境不同而變化，從而能提供更好的原產(chǎn)地信息。為了將多重比較分析的結(jié)果可視化，更直觀地看出不同地理標(biāo)志羊肉之間的礦物元素含量差異，繪制不同地理標(biāo)志羊肉礦物元素含量指紋圖，可見每種羊肉樣品都有特征元素含量分布（圖1）。因?yàn)椴煌睾繌摩蘥/kg到g/kg，含量數(shù)量級跨度較大，為了在同一量度范圍內(nèi)比較，對數(shù)據(jù)進(jìn)行Z-score標(biāo)準(zhǔn)化。

2.1.3 PCA結(jié)果

使用ANOVA選擇的具有顯著區(qū)域差異的10種元素進(jìn)行PCA。由于各個(gè)特征之間的數(shù)量級存在較大差異，就會使較小的數(shù)被淹沒，因此PCA前對數(shù)據(jù)進(jìn)行了log2轉(zhuǎn)化。前3 個(gè)PC的方差貢獻(xiàn)率分別為39.35%、21.5%、11.95%，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為72.8%，認(rèn)為可以足夠解釋原始數(shù)據(jù)信息。由圖2可以看出，3種羊肉區(qū)分明顯，由此可見3種羊肉中礦物元素變量之間存在可分類的差異。

圖2 前3 個(gè)PC 3D得分散點(diǎn)圖Fig. 2 3D score scatter plot of first three principal components PC1,PC2 and PC3

2.2 SIMCA單分類模型的建立與地理標(biāo)志羊肉樣品真實(shí)性鑒別

所采集的鹽池灘羊15 個(gè)樣本用于訓(xùn)練集，5 個(gè)樣本用于測試集，巴里坤哈薩克羊15 個(gè)樣本用于訓(xùn)練集，3 個(gè)樣本用于測試集，蘇尼特羊12 個(gè)樣本用于訓(xùn)練集，3 個(gè)樣本用于測試集。同時(shí)采集市售16 個(gè)普通羊肉樣品，用于地理標(biāo)志羊肉真實(shí)性模型驗(yàn)證。用每種羊肉訓(xùn)練集樣本分別建立SIMCA的PCA-Class模型，使用ANOVA選擇的具有顯著差異的10種元素進(jìn)行建模，模型PC的個(gè)數(shù)由Q2（cum）值決定，Q2（cum）表明的是當(dāng)前主成分?jǐn)?shù)量時(shí)總的模型預(yù)測能力，當(dāng)增加的1 個(gè)PC不能提升交叉驗(yàn)證的數(shù)據(jù)質(zhì)量時(shí)，Q2（cum）會下降，因此當(dāng)Q2（cum）達(dá)到最高值時(shí)對應(yīng)的PC個(gè)數(shù)為最有效PC個(gè)數(shù)。巴里坤哈薩克羊模型2 個(gè)PC，蘇尼特羊模型1 個(gè)PC，鹽池灘羊模型1 個(gè)PC。ROC曲線圖可反映敏感性與特異性之間關(guān)系，其中X軸為特異性，Y軸為敏感度，X越小Y越大，準(zhǔn)確率越高。ROC曲線下面積值越接近1，說明預(yù)測準(zhǔn)確率越高。從圖3、4結(jié)果看，建立的模型性能優(yōu)良。圖4a、d是以哈薩克羊建立的SIMCA模型，圖4b、e是以蘇尼特羊建立的SIMCA模型，圖4c、f是以灘羊建立的SIMCA模型，其中，紅線為95%置信區(qū)間臨界距離，處于紅線下方的樣本被認(rèn)為是建模的羊種，3 個(gè)模型中3種羊肉都被準(zhǔn)確判別。將測試集帶入每種羊肉模型中（圖4d、e、f），可以看出每種羊肉的模型均能將真實(shí)樣品成功鑒別出，其他不屬于所驗(yàn)證的地域特色羊肉（欺詐樣本）也均被識別。所以地理標(biāo)志羊肉的礦物元素含量具有明顯的特征差異，作為SIMCA模型變量，能夠?qū)崿F(xiàn)地理標(biāo)志羊肉真實(shí)性的100%鑒別準(zhǔn)確率。

圖3 3 個(gè)分類模型的ROC曲線及曲線下面積Fig. 3 Area under the receiver operating characteristic (ROC) curve (AUC)

圖4 3種地理標(biāo)志羊種分類模型預(yù)測DModX圖Fig. 4 DModX charts for the prediction performance of classification models for three geographical indication sheep breeds

3 結(jié) 論

測定3種地理標(biāo)志羊肉中多種礦物元素含量，篩選出13 個(gè)元素作為真實(shí)性鑒別分析變量。通過方差分析、多重比較分析以及PCA分析3種羊肉中礦物元素含量之間差異，探究地理標(biāo)志羊肉中礦物元素指紋特征。用特征礦物元素變量（Na、K、Ca、Fe、Cu、Zn、Se、Rb、Sr和Ti）針對每種地理標(biāo)志羊肉建立SIMCA模型，研究表明模型性能優(yōu)良，模型能夠從多種欺詐樣本中識別真實(shí)樣本，達(dá)到100%鑒別準(zhǔn)確率。

本研究探索了基于礦物元素指紋結(jié)合單分類建模策略的地理標(biāo)志羊肉真實(shí)性鑒別技術(shù)。該技術(shù)突破了目前我國研究羊肉產(chǎn)地溯源領(lǐng)域傳統(tǒng)判別手段只能針對所收集樣本范圍內(nèi)的產(chǎn)地真實(shí)性鑒別的瓶頸。實(shí)現(xiàn)了只需要收集一類目標(biāo)樣品，就可以從所有欺詐樣本中鑒別真實(shí)本，減少了樣本和數(shù)據(jù)收集的系統(tǒng)工作量，在真實(shí)性鑒別領(lǐng)域具有更廣泛的應(yīng)用性能。