羅文琪, 謝益民,2*, 張功俠

(1.湖北工業(yè)大學(xué) 制漿造紙研究院,湖北 武漢 430068； 2.湖北工業(yè)大學(xué)綠色輕工材料湖北省重點實驗室,湖北 武漢 430068)

隨著我國造紙行業(yè)對紙漿需求的持續(xù)急速增長,以環(huán)境友好和節(jié)能的方式充分利用木材和其它纖維原料顯得日益迫切。近年來楊木堿性過氧化氫機械漿(APMP)制漿工藝在國內(nèi)外得到迅速發(fā)展[1-3]。楊木具有生長迅速、纖維素含量高、木片白度高且易被浸漬軟化等優(yōu)點,因此，越來越多的造紙企業(yè)選擇楊木作為生產(chǎn)原料,許多企業(yè)甚至使用來自人造板行業(yè)的楊木心材。楊木化學(xué)機械漿(CMP)得率較高,達80%～85%,但楊木高得率漿在磨漿過程中能耗高,另外,較低的物理強度在一定程度上限制了它的應(yīng)用。利用生物制漿技術(shù)可以降低噸漿電耗和化學(xué)藥品的消耗,減少環(huán)境污染,從而促進制漿造紙工業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[4-6]。在制漿造紙過程中,使用生物法對原料預(yù)處理,在蒸煮和磨漿環(huán)節(jié)都可以達到節(jié)約能源的效果[7],并且可使紙張性能提高[8-10],降低造紙廢水的污染負荷,提高廢水的可生化性[11-12]。屬于擔(dān)子菌綱的白腐真菌是最有效和最廣泛的木質(zhì)素降解菌種,白腐菌具備繁殖速度快、分解木質(zhì)素能力強等特點[13-15],它們通過分泌漆酶(Lac)、木質(zhì)素過氧化物酶(Li-P)、錳過氧化物酶(Mn-P)對植物體細胞壁中的木質(zhì)素進行降解,保留造紙工業(yè)所需要的纖維素和半纖維素組分[15]。其中,漆酶具有獨特的優(yōu)勢,它作為一種胞外酶,不需要依賴其他酶系或H2O2的輔助就可完成對底物的催化,并且能夠產(chǎn)生氧化能力極強的·OH,抑制其他微生物生長,這使得白腐菌有更廣的適用性,能夠降解大量結(jié)構(gòu)不同的化學(xué)物質(zhì)[16]。目前,已有研究者利用白腐菌預(yù)處理進行楊木機械法制漿,這種生物機械法制漿可以提高紙漿質(zhì)量和降低能耗[17-18]。作為人造板工業(yè)剩余物的楊木心材雖然在CMP行業(yè)被廣泛利用,但是由于楊木心材中木質(zhì)素和抽出物含量高,導(dǎo)致耗堿量大。另外,楊木心材由于長期存在于酸性環(huán)境中,纖維強度低、纖維長度小,使得CMP的成漿質(zhì)量較差。部分企業(yè)的生產(chǎn)實踐表明：增加楊木心材的堆放時間來促進其自然發(fā)酵可以顯著降低用堿量并提高紙張質(zhì)量。研究者對楊木邊材的CMP及生物化機漿(Bio-CMP)的研究比較多,但是對于白腐菌較難處理的楊木心材的Bio-CMP的制漿化學(xué)及成紙性能還未深入探討。利用磨木木質(zhì)素(MWL)可以研究天然木質(zhì)素的結(jié)構(gòu),有助于了解白腐菌降解楊木心材木質(zhì)素結(jié)構(gòu)的機理。本研究采用白腐菌Trametessp.48424對楊木心材進行了預(yù)處理,分析白腐菌在木片上生長時產(chǎn)漆酶的能力,并深入探討生物預(yù)處理過程中化學(xué)組分、纖維形態(tài)以及木質(zhì)素結(jié)構(gòu)的變化，并制備楊木Bio-CMP化機漿,以闡明白腐菌預(yù)處理對楊木CMP性能以及成紙強度的影響。

1 原料與方法

1.1 原料、菌種及儀器

1.1.1原料及試劑 楊木木片(心材和邊材)由湖北華海纖維科技股份有限公司提供。楊木木片自然風(fēng)干后存貯,水分約7%。實驗所用試劑均為市售分析純。

液體培養(yǎng)基(自制)：馬鈴薯提取液1.0 L,葡萄糖20.0 g,磷酸二氫鉀3.0 g,七水硫酸鎂1.5 g,維生素B1為8 mg,酒石酸氨0.94 g。馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基中加入20 g瓊脂,制成PDA培養(yǎng)基。

1.1.2菌種及培養(yǎng)方法 白腐菌菌株Trametessp.48424,由華中科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物研究所生化培養(yǎng)室贈予。白腐菌Trametessp.48424的培養(yǎng)參照吳香波[19]的方法，將白腐菌菌株在PDA培養(yǎng)基上采用連續(xù)劃線法進行無菌斜面接種,接種完畢后在30 ℃的生化培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)7 d，培養(yǎng)結(jié)束后將菌種置于4 ℃冰箱內(nèi)冷藏保存。

在研究生物預(yù)處理楊木木片時,用接種環(huán)將斜面上的菌種挑三環(huán)接種到液體培養(yǎng)基中,在轉(zhuǎn)速為180 r/min的水浴振蕩培養(yǎng)器上培養(yǎng)7 d左右,水浴溫度為28 ℃,在培養(yǎng)過程中白腐菌會生長成菌絲球體,培養(yǎng)結(jié)束后將裝有菌絲球的搖瓶置于4 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3儀器 SU8010場發(fā)射掃描電鏡(SEM),日本日立公司；DZF- 6020 型生化培養(yǎng)箱,上海躍進醫(yī)療器械；MO-1水冷式振動球磨,日本中央工業(yè)機械；6700型傅里葉紅外光譜(FT-IR)儀,美國Thermo Fisher Nicolet公司；AVANCE III 500MHz超導(dǎo)核磁共振譜(NMR)儀,德國Bruker公司；KRK2500-II高濃盤磨機,日本KRK公司；PFI型磨漿機,咸陽泰思特試驗設(shè)備有限公司；RK-3A凱塞抄片器,奧地利PTI-Flank公司；L&W纖維形態(tài)分析儀,瑞典L&W公司。

1.2 白腐菌生物預(yù)處理楊木

將1 kg絕干質(zhì)量的楊木木片用熱水浸泡12 h,取出后放入蒸煮鍋中,在固液比1 ∶4(kg ∶L)、蒸煮時間30 min、蒸煮溫度100 ℃條件下進行汽蒸,不加任何化學(xué)藥品。汽蒸結(jié)束后將木片送至單螺桿擠碾機進行擠壓,然后將擠壓后的木片置于高壓滅菌鍋中,121 ℃滅菌1 h。待木片冷卻后,將培養(yǎng)完畢的白腐菌菌絲球(絕干3 g)分散在木片上,混合均勻后,置于30 ℃的生化培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng),濕度保持在70%～80%。定期觀察木片上菌絲的生長情況,并測定白腐菌在木片上生長時所分泌的漆酶酶活。白腐菌生物預(yù)處理25 d后結(jié)束培養(yǎng),將木片上的白腐菌菌絲洗凈,進行后續(xù)制漿實驗。

1.3 楊木磨木木質(zhì)素的提取

取經(jīng)過白腐菌Trametessp.48424預(yù)處理前后的楊木片,用Wiley磨粉碎成0.25～0.425 mm的木粉,再用苯/醇混合液(體積比1 ∶2)抽提木粉6～8 h。木粉風(fēng)干后進行熱水抽提,經(jīng)乙醇梯度脫水后,進行真空干燥。然后將楊木木粉放入水冷式振動球磨機中，球磨總時長72 h。球磨完畢,按照Bj?rkman[20]的提取過程制備楊木磨木木質(zhì)素(MWL)。取楊木粉5 g,加入200 mL二氧六環(huán)/水(體積比96 ∶4)抽提,抽提3次,離心分離,取上清液,蒸干,真空干燥得粗MWL,然后將其用醋酸-水(體積比9 ∶1)溶解,離心分離,取上清液,攪拌條件下加入其體積10倍的水,分離,溶液蒸干得到水溶性MWL。將沉淀真空干燥,溶解于二氯乙烷/乙醇(體積比2 ∶1),離心分離。取上清液,滴加到其體積10倍的無水乙醚中,離心分離,將沉淀用無水乙醚清洗3次,石油醚清洗1次,再真空干燥,得到MWL。

1.4 楊木生物化學(xué)機械法制漿

1.4.1預(yù)蒸煮 在蒸氣溫度130 ℃下蒸煮30 min,固液比1 ∶4(kg ∶L)。將1.2節(jié)預(yù)處理后的楊木木片,加入適量NaOH進行預(yù)蒸煮。

1.4.2制漿 采用KRK高濃盤磨機對木片進行磨漿,漿濃控制在20%左右,轉(zhuǎn)速3 000 r/min,磨漿間隙0.2～1.0 mm。篩漿后用PFI磨漿機進行打漿,使打漿度保持在40～45°SR,然后將漿料濃縮備用。預(yù)蒸煮過程中采用了不同NaOH的用量(6%,8%和10%)的楊木生物化學(xué)機械漿(Bio-CMP),還制備了楊木化學(xué)機械漿(CMP)作對比樣(堿處理過程相同,缺少白腐菌預(yù)處理)。楊木Bio-CMP的制備流程具體如下：

1.5 分析與測試

1.5.1粗酶液提取及漆酶的測定 在白腐菌預(yù)處理楊木木片的過程中,白腐菌會依附于木片生長,同時會分泌漆酶。為了測定白腐菌依附木片生長時所分泌的漆酶酶活,從生化培養(yǎng)箱中取適量預(yù)處理過的木片,測定其水分后用超純凈化水按1 ∶20(g ∶mL)稀釋,并用超聲波振動10 min,取出酶液,在8 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min,得到的上清液為粗酶液。取2 mL含有0.5 mmol/L ABTS的HAc-NaAc緩沖液(pH值4.5),加入一定量稀釋的粗酶液,在室溫下測定反應(yīng)體系在420 nm處的前3 min吸光度的變化[21]。

1.5.2SEM分析 取經(jīng)過白腐菌Trametessp.48424處理前后的楊木樣品,干燥后用刀片切出需要觀察的平面,經(jīng)過噴金處理后,在SEM下觀察纖維原料形態(tài)的變化。

1.5.3楊木化學(xué)成分的測定 測定楊木木片的化學(xué)成分,按照GB/T 2677.10—1995、GB/T 2677.8—1994、GB/T 2677.4—1993、GB/T 2677.5—1993、GB/T 2677.6—1994,分別測定綜纖維素、Klason木質(zhì)素、熱水抽出物、 1%氫氧化鈉抽出物、苯醇抽出物以及丙酮抽出物的含量。

Y=(m0-m1)/m0×100%

R=[w0-w1(1-Y)]/w0×100%

式中：Y—木片質(zhì)量損失率,%;m0—預(yù)處理前的木片質(zhì)量,kg;m1—預(yù)處理后的木片質(zhì)量,kg;R—綜纖維素(或Klason木質(zhì)素)降解率,%;w0—預(yù)處理前木片中綜纖維素(或Klason木質(zhì)素)的質(zhì)量分數(shù),%;w1—預(yù)處理后木片中綜纖維素(或Klason木質(zhì)素)的質(zhì)量分數(shù),%。

1.5.4楊木MWL的分析 取預(yù)處理前后的楊木MWL 1～1.5 mg,與300 mg溴化鉀粉末混合研磨后,在壓片機中制得透明樣品試片,采用FT-IR儀掃描，掃描范圍400～4 000 cm-1,數(shù)據(jù)間隔1.93 cm-1，掃描次數(shù)32次。

取預(yù)處理前后的楊木MWL 80 mg,分別溶解于DMSO-d6中,利用NMR儀對樣品進行掃描,得到13C NMR 圖。測試過程中馳豫時間為1.75 s,采樣時間為0.95 s,樣品掃描約7 000次。

1.5.5楊木Bio-CMP纖維形態(tài)的測定 使用L&W型纖維分析儀對每組磨漿后的樣品進行纖維形態(tài)測定,分析不同制漿工藝條件下楊木纖維的纖維長度、細小纖維含量和扭結(jié)指數(shù)等變化。

1.5.6手抄片的抄造和檢測 采用凱塞快速抄片器進行抄片,紙頁的定量為100 g/m2。干燥后平衡水分,紙頁的抗張強度、耐破指數(shù)、環(huán)壓強度、耐折次數(shù)分別按照GB/T 12914—2008、GB/T 454—2002、GB/T 2679.8—2016、QBT 457—2002進行測定和計算。

2 結(jié)果與討論

2.1 楊木的化學(xué)組成分析

對原料楊木進行了化學(xué)組分分析,結(jié)果如表1所示。楊木心材的Klason木質(zhì)素含量明顯高于邊材。楊木心材與邊材的有機溶劑抽出物含量差別較小,說明楊木心材中部分樹脂的極性比較大,用中性的有機溶劑很難抽提出來。楊木心材的1% NaOH抽出物含量和熱水抽出物含量遠高于邊材,說明該品種楊木心材中含有大量的極性比較強的抽出物,主要成分為心材長期處于酸性環(huán)境中半纖維素受降解后產(chǎn)生的大量脂肪酸[22]。

表1 楊木木材化學(xué)成分分析Table 1 Chemical composition analysis of poplar wood %

2.2 白腐菌預(yù)處理楊木心材的結(jié)果分析

2.2.1漆酶分泌 白腐菌經(jīng)過振蕩培養(yǎng),在液體培養(yǎng)基中生長成淡黃色的菌絲球,將菌絲球和少量酶液分散到楊木心材木片上,對楊木進行預(yù)處理后,菌絲球變成了白色絲狀真菌覆蓋在木片上生長,其生長狀態(tài)如圖1所示,預(yù)處理時間與白腐菌產(chǎn)漆酶酶活的關(guān)系見圖2。

圖1 白腐菌Trametes sp.48424在楊木心材木片表面的固態(tài)發(fā)酵 圖2 白腐菌預(yù)處理楊木心材的時間對其產(chǎn)漆酶酶活的影響Fig.1 Solid-state fermentation of white rot fungus Trametes sp. 48424 on the surface of poplar heartwood chips Fig.2 The effect of white rot fungus pretreatment time of poplar heartwood on its laccase activity

白腐菌在木片上生長時會分泌漆酶,隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加,酶活先增加后降低,培養(yǎng)13 d中,漆酶酶活在第8天時達到最大值,為1.3 IU/mL。楊木心材含有大量的脂肪酸,白腐菌依然能夠依附于此產(chǎn)大量的菌絲,并在楊木心材上分泌酶活,說明白腐菌受楊木心材中的脂肪酸的影響比較小。當(dāng)白腐菌所需要的營養(yǎng)物質(zhì)被耗盡時,不利于菌絲生長的代謝產(chǎn)物逐步積累增加,酶活也隨之降低。同時,當(dāng)酶液中本身的葡萄糖消耗完畢后,菌絲體依賴木質(zhì)素生長,這時木質(zhì)素降解開始[23],白腐菌在木材降解的過程中生長比較緩慢。

2.2.2預(yù)處理對楊木心材表面的影響 白腐菌未處理和處理后的楊木心材木片表面和橫截面的SEM觀察結(jié)果見圖3。白腐菌預(yù)處理木片時,其分泌的酶對木片進行降解,使其表面變成多孔,并出現(xiàn)凹槽,導(dǎo)致細胞壁變薄,表現(xiàn)出木片在受到白腐菌攻擊時細胞壁的松弛。這是因為白腐菌在降解楊木心材時,菌絲主要在紋孔處集中生長,沿著細胞腔蔓延,它可以從細胞腔到復(fù)合胞間層,逐漸降解木質(zhì)素及少量纖維素與半纖維素[24]。

處理前before pretreatment：a.表面surface(×1 000); b.截面cross section(×500)處理后after pretreatment：c.表面surface(×1 000); d.截面cross section(×500)圖3 楊木心材在白腐菌預(yù)處理前后的掃描電鏡觀察Fig.3 SEM observation of poplar heartwood chip before and after white-rot fungus pretreatment

2.2.3預(yù)處理對楊木心材化學(xué)成分的影響 在白腐菌處理木片的0～25 d時間里木片的質(zhì)量有明顯的損失,經(jīng)測定和計算,培養(yǎng)25 d后質(zhì)量損失為11.33%。木片經(jīng)過白腐菌預(yù)處理后,綜纖維素和Klason木質(zhì)素的含量顯著降低,降解率分別為10.98%和14.21%,Klason木質(zhì)素的降解速率比綜纖維素的降解速率快,說明白腐菌對木質(zhì)素的脫除具有一定的選擇性。

2.3 白腐菌預(yù)處理對楊木心材MWL的影響

2.3.1FT-IR分析 2 960～2 870 cm-1是甲基、亞甲基、次甲基的C—H伸縮振動吸收峰,以此峰為標(biāo)準(zhǔn),觀察各峰的變化(圖4)。經(jīng)過白腐菌預(yù)處理后,楊木心材MWL 3 500～3 300 cm-1處的吸收峰減弱,代表羥基減少,說明酚型木質(zhì)素結(jié)構(gòu)被降解的比例較高。1 662 cm-1是共軛羰基的吸收峰,該峰減弱說明經(jīng)過白腐菌的預(yù)處理,楊木MWL側(cè)鏈上的部分羰基被降解。1 600和1 510 cm-1是芳香環(huán)的骨架振動吸收峰,該峰變化不大,說明白腐菌處理對芳香環(huán)的影響比較小。

1.預(yù)處理前before pretreatment； 2.預(yù)處理后after pretreatment圖4 白腐菌預(yù)處理前后楊木心材的MWL的FT-IR光譜(a)和13C NMR波譜(b)Fig.4 FT-IR(a) and 13C NMR spectra(b) of poplar heartwood MWL before and after pretreatment by white rot fungus

2.3.213C NMR分析 對比白腐菌預(yù)處理前后楊木心材的MWL的13C NMR波譜(圖4(b)),在低場區(qū)域,δ162.5～172.0基本上來自羧酸的羰基[25],數(shù)量比較多,與原料組成分析的結(jié)果一致。經(jīng)白腐菌處理后,這些羧酸基本上沒有得到降解。在脂肪族區(qū)域,可以觀察到與木質(zhì)素β-O- 4結(jié)構(gòu)相關(guān)的峰均有顯著的減弱：δ72.7歸屬于β-O- 4結(jié)構(gòu)的側(cè)鏈Cα,δ60.6歸屬于β-O- 4結(jié)構(gòu)的側(cè)鏈Cγ[25],說明白腐菌降解木質(zhì)素的反應(yīng)主要發(fā)生在苯環(huán)側(cè)鏈,尤其對β-O- 4結(jié)構(gòu)的降解比較明顯。在δ100～160的芳香環(huán)區(qū)域,總體上沒有明顯的變化,說明處理過程中苯環(huán)是比較穩(wěn)定的。

2.4 白腐菌預(yù)處理對漿料纖維形態(tài)的影響

白腐菌未處理和處理后的CMP的纖維質(zhì)量分析結(jié)果見表2。與未預(yù)處理CMP纖維相比,Bio-CMP的纖維長度略有增加,細小纖維含量顯著減少,纖維扭結(jié)度增加。由于白腐菌預(yù)處理使木片軟化、松弛,紙漿的長度和柔韌性得到改善,后續(xù)CMP制漿的過程中,可以使纖維分離變?nèi)菀?減少磨漿過程中盤磨對纖維的切斷,使得細小纖維含量減少,同時纖維長度增加,有利于提高成紙的物理性能。

表2 楊木心材CMP和Bio-CMP的纖維特性Table 2 Fiber characteristics of poplar heartwood CMP and Bio-CMP

2.5 白腐菌預(yù)處理對成紙物理性能的影響

白腐菌預(yù)處理對成紙物理性能的影響見表3。與CMP相比,Bio-CMP的物理性能得到顯著改善。在相同的打漿度條件下,緊度、抗張指數(shù)、環(huán)壓指數(shù)、耐破指數(shù)和耐折次數(shù)均得到顯著提升。由于白腐真菌優(yōu)先降解木材細胞壁中的木質(zhì)素,使制漿原料更加多孔[26],從而促進化學(xué)蒸煮液更容易滲透,NaOH在木材纖維中能更好地擴散,磨漿效果得到改善。此外,白腐菌預(yù)處理使楊木心材細胞壁軟化,局部細胞壁變薄,增加纖維柔韌性和溶脹性,從而增加了紙張內(nèi)纖維間的結(jié)合,使緊度提高,并增加了紙張強度特性。尤其是NaOH用量為8%時，Bio-CMP的抗張指數(shù)為38.2 N·m/g，較CMP(32.9 N·m/g)提高了16.1%，耐破指數(shù)為2.04 kPa·m2/g較CMP(1.82 kPa·m2/g)提高了12.1%。

表3 楊木心材CMP和Bio-CMP的手抄片強度性能對比Table 3 Mechanical strength comparison of handsheet from poplar heartwood CMP and Bio-CMP

3 結(jié) 論

3.1利用白腐菌Trametessp.48424預(yù)處理楊木心材木片,并對預(yù)處理楊木木片進行生物化學(xué)機械法制漿,研究白腐菌預(yù)處理對楊木生物化學(xué)機械漿(Bio-CMP)性能的影響。結(jié)果顯示：白腐菌能很好地在木片上進行固態(tài)發(fā)酵,并在預(yù)處理第8天時分泌產(chǎn)的漆酶酶活達到最大值1.3 IU/mL。SEM結(jié)果顯示：白腐菌使木片表面出現(xiàn)孔洞和凹槽,細胞壁變薄。這使得楊木木片在蒸煮時利于藥液的滲透?；瘜W(xué)組分分析結(jié)果表明：白腐菌對Klason木質(zhì)素的降解速率高于對綜纖維素的降解速率。

3.2楊木心材木片經(jīng)過白腐菌Trametessp.48424預(yù)處理后,其磨木木質(zhì)素(MWL)的FT-IR和13C NMR譜圖顯示：白腐菌對木質(zhì)素結(jié)構(gòu)具有降解作用,尤其對β-O- 4結(jié)構(gòu)的側(cè)鏈(δ60.6和72.7)降解較為明顯,而對木質(zhì)素的芳香核影響比較小,說明白腐菌對木質(zhì)素的降解主要發(fā)生在木質(zhì)素側(cè)鏈。

3.3楊木心材木片經(jīng)過白腐菌Trametessp.48424預(yù)處理后,Bio-CMP紙漿的纖維長度略有增加,而細小纖維含量顯著減少,纖維扭結(jié)指數(shù)增加。與未預(yù)處理的CMP相比,白腐菌預(yù)處理后的紙漿纖維更柔軟,使纖維結(jié)合更緊密,成紙緊度和強度明顯提高。