李夢爍 劉瑩澤 魯 煥 強 勝

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南京 210095）

光合作用是植物最重要的生理過程，也是地球上生命能量的關(guān)鍵來源［1］。植物通過光合作用將太陽能轉(zhuǎn)化為其生長發(fā)育所需的化學(xué)能。光合作用的強弱不僅反映出植物本身的生長發(fā)育水平，而且直接關(guān)系到其產(chǎn)量與品質(zhì)［2］。植物的光合能力受環(huán)境條件的影響，其生長地的光照強度、溫度、水分、CO2濃度等均會影響光合效率。研究表明不同生存環(huán)境下，植物的光合能力呈現(xiàn)差異性。而同一環(huán)境條件下，不同植物的光合能力也有很大差異，其光合能力可相差幾十倍［3-4］。不同物種間呈現(xiàn)出的光合能力差異可能是由于葉片中光合酶的含量與活性、CO2的擴散、光合結(jié)構(gòu)中氮分配差異導(dǎo)致的［5］，主要受內(nèi)在遺傳差異和外在環(huán)境兩方面的影響。另外，在相同環(huán)境中，同種植物不同種群間也存在光合能力分化。張貴合等［6］研究發(fā)現(xiàn)在相同生態(tài)條件下，不同馬鈴薯（Solanum tuberosum）品種（系）間的光合性狀存在明顯差異。同樣，小麥（Triticum aestivum）、水稻（Oryza sativa）不同品種（系）間的光合能力也有明顯分化［7-9］。在同質(zhì)園條件下，排除環(huán)境因子對于不同種群光合能力的影響，同種植物表現(xiàn)出的光合能力分化可能是其不同種群內(nèi)在的遺傳多樣性導(dǎo)致的。

光合作用過程包括光反應(yīng)和暗反應(yīng)2個階段。有研究揭示了光合作用過程是由3 萬種不同的光合作用驅(qū)動蛋白共同協(xié)調(diào)進行的，這些蛋白質(zhì)由一整套核編碼基因組成［10］。這些基因編碼的大量蛋白酶用于調(diào)控2個最重要的光合作用步驟：光合電子傳遞（Electron transfer）和卡爾文循環(huán)（Calvin-Benson Cycle，CB Cycle）［11］。光合作用不同組分之間聯(lián)系緊密，改變其中1個基因的表達水平可能導(dǎo)致其他大量光合基因表達模式的同時改變，最終影響植物的光合效率［12］。擬南芥（Arabidopsis thaliana）中psa2基因編碼DNAJ-like 鋅指蛋白，其突變體嚴重抑制了植株生長，葉綠素含量也發(fā)生了明顯下降。psa2可能影響了下游一系列基因的表達，從而影響擬南芥的光同化和葉綠體發(fā)育［13］。核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶（Ribulose-1，5-bisphosphate carboxylase/oxygenase，Rubisco）是 限制暗反應(yīng)速率的最重要的酶之一，主要在CB 循環(huán)中對CO2進行固定。Yoon 等［14］發(fā)現(xiàn)在不同溫度下的擬南芥種群間Rubisco 小亞基編碼基因RbcS的相對表達量有很大差異，推斷Rubisco 對環(huán)境的適應(yīng)可能是由其小亞基編碼基因RbcS之間的相對表達水平?jīng)Q定。目前，光合作用的分子機理已較為清晰，調(diào)控各進程的基因也在多個物種中被發(fā)現(xiàn)并驗證。但是，何種基因調(diào)控了同質(zhì)園條件下同種植物呈現(xiàn)出的光合能力分化仍不清楚。本研究利用模式植物擬南芥為研究材料，首先對其在同質(zhì)園條件下的光合能力進行測定，揭示其光合能力分化規(guī)律。進一步利用熒光定量PCR 檢測光合相關(guān)基因的表達水平，以探究影響同質(zhì)園中擬南芥光合能力分化的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)機制。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗使用的23個擬南芥種群的種子購于擬南芥生物資源中心（ABRC，https：//abrc.osu.edu/researchers）。將23 個不同生態(tài)型的擬南芥種子消毒后春化處理3 d，移栽到泥炭土和蛭石按體積比1∶3 混合的培養(yǎng)土基質(zhì)中，在溫度22 ℃、相對濕度約70%、16 h光照/8 h黑暗條件下培養(yǎng)。所有試驗均在28～30 d植株完全展開的蓮座葉上進行。

1.2 試驗設(shè)計

1.2.1 氣體交換參數(shù)的測量

使用便攜式光合儀（Li-6400，美國）測定23 個擬南芥種群幼苗的氣體交換參數(shù)，包括凈光合速率（Pn）、蒸騰速率（Tr）和水分利用效率（WUE）。測定時間為09：30—11：30和14：00—16：00，幼苗在光合有效 輻 射（PAR）為500 μmol·m-2·s-1條 件 下 預(yù) 適 應(yīng)30 min。參考CO2摩爾分數(shù)為350 μmol·mol-1，PAR為500 μmol·m-2·s-1，葉溫22 ℃。每個種群設(shè)8次重復(fù)。

1.2.2 葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測定

使用Imaging-PAM（MAXI-version，德國）測定23個擬南芥種群幼苗的的葉綠素?zé)晒鈪?shù)。所有試驗材料在25 ℃的黑暗條件下適應(yīng)30 min，Imaging-PAM 的測量光、光化光和飽和脈沖光的強度分別為0.25、110、6 000 μmol·m-2·s-1。在測量光和飽和脈沖光下測得最小熒光產(chǎn)量（Fo）和最大熒光產(chǎn)量（Fm），40 s 后打開光化光進行熒光誘導(dǎo)，測得穩(wěn)態(tài)熒光（Fs）之后再進行飽和脈沖光處理，一個脈沖關(guān)閉后，得到光化光下的最大熒光（Fm′）。之后每隔20 s 進行1 次飽和脈沖光處理，持續(xù)時間為0.8 s，整個測量時間為315 s。通過Imaging-Win（Walz，德國）自動計算獲得其PSⅡ有效光量子效率（YⅡ）、電子傳遞效率（RET）、PSⅡ調(diào)節(jié)性能量耗散的量子產(chǎn)量（YNPQ）、PSⅡ非調(diào)節(jié)性能量耗散的量子產(chǎn)量（YNO）、非光化學(xué)猝滅（QNP）、非光化學(xué)淬滅系數(shù)（QN）、穩(wěn)態(tài)光適應(yīng)光化學(xué)淬滅系數(shù)（QP）及基于Lake model 的穩(wěn)態(tài)光適應(yīng)光化學(xué)淬滅系數(shù)（QL）等參數(shù)［13］。除YⅡ僅有一個值外，各參數(shù)均以最后3 次數(shù)值的平均值作為最終結(jié)果，每個種群設(shè)10次重復(fù)。

1.2.3 相對葉綠素含量的測定

使用葉綠素儀（Chlorophyll Meter SPAD-502，德國）測定葉綠素相對含量（SPAD），每個種群選取4株，每株選取3個葉片。

1.2.4 光合作用相關(guān)基因的RT-qPCR檢測

根據(jù)氣體交換參數(shù)的測定結(jié)果，選擇4個典型種群（En-D、Stw-0、Wa-1 和Per-1）進行實時定量PCR（RT-qPCR）測定。取4 周植物幼苗的葉片樣本，使用植物RNA 提取試劑盒（TaKaRa Bio Inc.，日本）進行RNA 提取。對RNA 樣品質(zhì)量及濃度進行檢測后，使用帶有g(shù)DNA Eraser 的PrimerScriptTMRT 試劑盒（TaKaRa）進行反轉(zhuǎn)錄。使用Mastercycler ep realplex Real-time PCR System（Eppendorf，Germany）進行RT-qPCR 試驗，體系為20 μL，包括10 μL SYBR Green（TaKaRa）、正向和反向引物各125 nmol·L-1（見表1）和10 ng cDNA。反應(yīng)步驟：95 ℃3 min，40 個循環(huán)（95 ℃15 s，60 ℃30 s）。熔解曲線（60～95 ℃）在PCR 反應(yīng)之后進行。Rubisco基因（RbcS1A、RbcS1B、RbcS2B和RbcS3B）的引物參考Izumi 等［15］。其余引物由在線引物設(shè)計工具（IDT PrimerQuest Tool，https：//sg.idtdna.com/PrimerQuest/）設(shè)計。所有引物對的擴增效率均為90%～110%。管家基因為actin基因，使用2-ΔΔCt法計算相對表達水平［16］。

表1 RT-qPCR的引物對信息Table 1 Information of primer pairs used for RT-qPCR experiments

1.3 統(tǒng)計分析

使用R軟件中的Vegan以歐氏距離進行聚類分析、光合作用和環(huán)境因素（地理信息、氣候因素和太陽能輻射）的冗余分析（RDA）以及主成分分析（PCA），其中氣候數(shù)據(jù)來自DIVA-GIS（http：//www.diva-gis.org/climate）、太陽能輻射來自WorldClim（https：//worldclim.org/data）。使用GraphPad Prism（version 9，USA）通過t檢驗分析組Ⅰ和Ⅱ之間氣體交換參數(shù)的顯著性差異。使用GraphPad Prism 的單因素方差分析（ANOVA，Duncan post-host）分析全部種群間氣體交換參數(shù)的顯著性差異和4 個擬南芥種群（En-D、Stw-0、Wa-1 和Per-1）中的基因表達水平的顯著性差異并作圖。用SPSS 22.0 軟件進行相關(guān)性分析（P＜0.05表示顯著相關(guān)）。

2 結(jié)果與分析

2.1 23個擬南芥種群的光合能力指標(biāo)

本試驗測定了23 個擬南芥種群的氣體交換參數(shù)和葉綠素?zé)晒鈪?shù)，種群詳細信息及測定結(jié)果如表2。凈光合速率為2～11 μmol·m-2·s-1，變異系數(shù)為40.30%。其中，凈光合速率最低的種群 是Aa-0，為2.38 μmol·m-2·s-1，最 高 的 種 群 是Hs-0，為11.03 μmol·m-2·s-1。水分利用效率變異幅度與凈光合速率相似，為40.61%。除此之外，各種群之間其他光合能力指標(biāo)變異系數(shù)較小，尤其是葉綠素?zé)晒鈪?shù)，變異幅度幾乎不超過10%，說明擬南芥光合能力的分化可能與電子傳遞的關(guān)系較小。Pn是反映植物光合能力的重要指標(biāo)，相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)凈光合速率與水分利用效率和葉綠素相對含量有顯著相關(guān)性（見表3），證明擬南芥光合能力可能與葉綠素含量和水分利用效率有關(guān)。

表2 23個擬南芥種群的氣體交換參數(shù)及經(jīng)緯度Table 2 Gas exchange parameters，longitude and latitude of the 23 Arabidopsis populations

表3 擬南芥種群各光合參數(shù)的相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis of photosynthetic parameters

進一步聚類分析結(jié)果（見圖1）表明23 個種群可分為兩組（組Ⅰ和組Ⅱ），其中組I 的Pn和WUE顯著高于組Ⅱ，Tr則在兩組間呈相反趨勢（見表4）。 組Ⅰ較 組Ⅱ的Pn高39.48%，WUE高46.01%。組Ⅰ平均Pn為7.37 μmol·m-2·s-1，種群多分布在西歐、中歐地區(qū)，在東歐零星分布；組Ⅱ平均Pn為4.46 μmol·m-2·s-1，種群更多分布于東歐、南歐等地。

表4 2組擬南芥種群氣體交換參數(shù)的差異Table 4 Comparison of gas exchange parameters between two groups of Arabidopsis populations

圖1 23個擬南芥種群光合參數(shù)的聚類分析Fig.1 Clustering analysis of photosynthesis parameters in the 23 Arabidopsis populations

另外，主成分分析（PCA）的結(jié)果（見圖2）與聚類結(jié)果相似，光合能力強弱的兩組可以明顯分開，第一主成分方差貢獻率43.5%，主成分2 方差貢獻率21.3%。主成分1 在QL、QNP、QN、QP上有較大載荷，主成分2則在Pn、WUE、RET、YNPQ上有較大載荷。

2.2 光合性狀和環(huán)境因子間的RDA分析

冗余分析（RDA）結(jié)果（圖3）從整體上反映了擬南芥種群的光合能力分化與環(huán)境因子之間的關(guān)系。RDA 第1 排序軸解釋了環(huán)境因子對擬南芥光合能力影響程度的78.43%，第2 排序軸解釋了21.46%。RDA分析結(jié)果提取了能最大程度上代表所有指標(biāo)解釋能力的最小變量組合：海拔（alt）、坡度（slop）、等溫度（bio3）、季候性（bio4）、年溫差（bio7）、旱季平均溫（bio9）、冬季平均溫（bio11）、年降水量（bio12）和2 月降水量（prec2）。第1 排序軸中alt、slop、bio4 和bio7 與第1 軸關(guān)系最為密切，第1 排序軸與bio4（相關(guān)系數(shù)為0.340）、bio7（0.324）正相關(guān)，與alt（-0.662）、slop（-0.744）負相關(guān)。第2排序軸中的bio3、bio9、bio11、bio12、和prec2 與第2軸關(guān)系密切，第2 排序軸與bio3（相關(guān)系數(shù)為-0.475）、bio9（-0.653）、bio11（-0.534）、bio12（-0.475）、prec2（-0.526）負相關(guān)。其中，組Ⅰ（圖2中藍點）主要占據(jù)坐標(biāo)第二象限，組Ⅱ（圖2 中橙點）主要位于第一象限，兩組內(nèi)各種群相對分散。alt（負相關(guān)）、bio7（正相關(guān)）、bio9（負相關(guān)）、bio11（負相關(guān)）、bio12（負相關(guān)）和prec2（負相關(guān)）等環(huán)境因子對擬南芥光合能力分化產(chǎn)生較高影響。這些結(jié)果表明，擬南芥所在地的溫度和降水量是造成其光合能力差異的主要環(huán)境因素。

圖2 23個擬南芥種群光合參數(shù)的主成分分析Fig.2 Principal component analysis of photosynthesis parameters in the 23 Arabidopsis populations

圖3 23個擬南芥群體光合性狀與環(huán)境因子的RDA圖圖中點為擬南芥種群，黑點代表組Ⅰ，灰點代表組Ⅱ；Alt.海拔（m）；slop.坡度（%）；bio3.等溫性；bio4.季候性；bio7.年溫差（℃）；bio9.旱季平均溫（℃）；bio11.冬季平均溫（℃）；bio12.年降水量（mm）；prec2.2月降水量（mm）Fig.3 RDA plot of photosynthetic traits in the 23 Arabidopsis populations with environmental factors The dots in the figure are Arabidopsis populations，black dots represent group Ⅰand gray dots represent group Ⅱ；Alt.Indicates altitude（m）；slop.Indicates slope（%）；bio3.Isothermal；bio4.Seasonal；bio7.Annual temperature difference（℃）；bio9.Average dry season temperature（℃）；bio11.Average winter temperature（℃）；bio12.Annual precipitation（mm）；prec2.Indicates February precipitation（mm）

2.3 不同擬南芥種群光合作用相關(guān)基因表達

根據(jù)聚類分析的分類結(jié)果選擇4 個擬南芥種群（組Ⅰ中的En-D 和Stw-0，組Ⅱ中的Wa-1 和Per-1）作為典型種群來進一步研究光合作用相關(guān)基因的表達水平。本試驗選擇了光反應(yīng)和暗反應(yīng)共15個光合相關(guān)基因，包括PSⅡ、PSⅠ、Rubisco 以及CB 循環(huán)其他的關(guān)鍵基因（見表1）。結(jié)果表明，在4個種群中，所研究的大多數(shù)基因在En-D（凈光合速率最高的種群）中的表達水平要高于其余凈光合速率較低的種群。其中，PSII 相關(guān)基因（PsbP、CP22和CAB1）、PSI 相關(guān)基因（LHCA6）和Rubisco相關(guān)基因（RbcS1A、RbcS1B、RbcS2B和RbcS3B）的表達模式與4 個種群的凈光合速率相對應(yīng)（見表2），即從強光合能力到弱光合能力的種群中，各基因表達水平逐漸遞減（見圖4），并且組Ⅰ種群（En-D和Stw-0）中各基因的表達水平顯著高于組Ⅱ種群（Wa-1 和Per-1）（P＜0.05）。除此之外，SBP基因表達模式也呈現(xiàn)出類似規(guī)律。而其他涉及PSⅠ（如Pas2、CBR）和CB 循環(huán)（如FBP、RCA）的基因的表達水平?jīng)]有明顯趨勢。結(jié)果表明，PSⅡ和Rubisco相關(guān)基因可能與擬南芥種群光合能力的分化有關(guān)。

圖4 擬南芥4個種群光合作用相關(guān)基因的相對表達水平不同字母代表4個種群基因表達水平差異顯著，P＜0.05Fig.4 The relative expression levels of photosynthesis-related genes in four Arabidopsis populations Different letters represent significant differences of the gene expression levels among the four populations，P＜0.05

3 討論與結(jié)論

本研究通過測定23個不同歐洲地理分布的擬南芥種群的氣體交換參數(shù)和葉綠素?zé)晒鈪?shù)，揭示了在同質(zhì)園條件下擬南芥不同地理種群光合能力的分化規(guī)律，強光合能力的種群大都分布于中歐、西歐，而弱光合能力的種群分布于東歐和南歐等地。這種光合能力的地理分化與各種群所在地溫度和降水量有著密切關(guān)系。進一步深入研究發(fā)現(xiàn)光合相關(guān)基因，特別是PSⅡ、Rubisco 相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平存在差異，暗示著這些基因的差異表達可能與同質(zhì)園條件下擬南芥種群光合能力的分化有關(guān)。

氣候條件會對植物的生理和分布產(chǎn)生影響［17］。植物在應(yīng)對環(huán)境變化時通常表現(xiàn)出表型可塑性，這意味著不同地區(qū)的植物在物種內(nèi)部或物種之間表現(xiàn)出不同的表型（表型多態(tài)性）［18］。光合速率是衡量綠色植物光合能力大小的一個重要指標(biāo)［19］，而凈光合速率是評估植物光合能力的重要參數(shù)，直接反應(yīng)了植物光合作用的強弱。本試驗結(jié)果顯示23個擬南芥種群之間的凈光合速率存在差異，表明在相同環(huán)境中，不同地理種群擬南芥的光合能力依舊存在差異，而光合能力的分化可能與植物體內(nèi)水分利用率以及葉綠素含量有關(guān)（表3）。RDA 結(jié)果表明，溫度和降水影響了擬南芥的光合能力，使各種群光合能力具有較大差異（圖2），年溫差（正相關(guān)）、旱季平均溫（負相關(guān)）、冬季平均溫（負相關(guān)）、年降水量（負相關(guān)）、2 月降水量（負相關(guān)）等環(huán)境因子均對擬南芥光合能力差異產(chǎn)生較大影響。溫度和水分是影響光合作用的2 個主要因素［20］。不利的溫度會影響光合色素的合成并損害PSⅡ，干旱脅迫不僅會通過降低氣孔導(dǎo)度而降低CO2同化速率，還會降低光合作用相關(guān)酶的含量和活性，包括Rubisco 和葉綠素［20-21］。不同生境下植物生理生態(tài)特性差異的產(chǎn)生主要是由于其所處環(huán)境條件的改變引起的［22］。而這種生理生態(tài)差異的產(chǎn)生往往是瞬時的，待環(huán)境恢復(fù)正常后，差異會逐漸消失［22-23］。本研究在同質(zhì)園條件下進行，整個處理過程中環(huán)境條件相對恒定，基本排除環(huán)境條件變化對不同擬南芥種群性狀的影響。但是結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同擬南芥的地理種群光合特性依然存在分化。這說明在長期的適應(yīng)性進化過程中，不同地理分布的擬南芥種群為適應(yīng)環(huán)境所發(fā)生的改變遺傳給了后代，因此呈現(xiàn)出同質(zhì)園條件下不同擬南芥種群光合能力的分化。這種可遺傳的改變可能與基因突變、基因轉(zhuǎn)錄模式和表觀遺傳等因素有關(guān)。

環(huán)境因素往往通過調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄水平來影響植物表型的變化，因此本試驗研究了光合作用相關(guān)基因的表達水平。根據(jù)聚類結(jié)果，本研究挑選了2 個強光合能力種群（En-D、Stw-0）以及2 個弱光合能力種群（Wa-1、Per-1）作為典型種群進行基因轉(zhuǎn)錄水平檢測。結(jié)果表明，在4個挑選的擬南芥種群中，PSⅡ和Rubisco 相關(guān)基因的表達模式與凈光合速率相對應(yīng)（從En-D 到Per-1 有下降的趨勢）。PSⅡ是1 種復(fù)雜的多蛋白組裝體，位于類囊體膜上［24］。PsbP 蛋白的功能在于優(yōu)化PSⅡ中的氧氣釋放［25］。CP22基因編碼1種PSⅡ-S色素結(jié)合蛋白，負責(zé)調(diào)節(jié)QNP活性，從而參與維持PSII 的穩(wěn)定性和活性［26］。CAB基因是光捕獲復(fù)合物Ⅱ（Light-harvesting Complex Ⅱ，LHCII）的亞基，編碼葉綠素A/B 結(jié)合蛋白，在光吸收和能量轉(zhuǎn)移到PSⅡ反應(yīng)中心的過程中發(fā)揮作用。因此CAB表達量的增加促進了葉綠素的積累和類囊體膜的穩(wěn)定性［27-28］。本研究發(fā)現(xiàn)En-D 和Stw-0 的CAB轉(zhuǎn)錄水平顯著高于Wa-1和Per-1，表明CAB表達水平可能對擬南芥光合能力有著正調(diào)節(jié)作用，這與凈光合速率和SPAD 的顯著相關(guān)性相對應(yīng)（見表3）。此外，Rubisco 是植物中含量最豐富的蛋白質(zhì)，不僅催化光合作用暗反應(yīng)中的碳固定，還可以催化光呼吸的碳氧化，從而影響植物的光合能力［29］。該酶處在2 個方向相反但又相互關(guān)聯(lián)的循環(huán)交叉點上，其對植物凈光合速率起著決定性的影響。改變Rubisco 性能的研究已經(jīng)證明了Rubisco 與植物光合作用和生長之間的直接關(guān)系［29-30］，Rubisco 含量的增加可導(dǎo)致植物葉片光合速率和產(chǎn)量的提高。Rubisco 是1個動態(tài)催化酶，由多個基因編碼，其相關(guān)基因單獨受抑制均可導(dǎo)致Rubisco 含量的減少，影響植物光合能力［31］。因此Rubisco 基因的相對高表達可保證Rubisco 的羧化效率并維持暗反應(yīng)的進行。在本研究結(jié)果中，PSⅡ和Rubisco 相關(guān)基因在4個典型種群中的表達存在顯著差異（見圖3），高凈光合速率的種群（En-D和Stw-0）的轉(zhuǎn)錄水平明顯高于弱凈光合速率的種群（Wa-1 和Per-1）（見圖3，表1）。這暗示著擬南芥光合能力的分化可能主要由PSⅡ和Rubisco 相關(guān)基因表達差異的調(diào)控。除了PSⅡ和Rubisco 相關(guān)基因外，SBP基因也有類似的結(jié)果（見圖3）。與野生型相比，SBPase 活性的增加導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因煙草（Nicotiana tabacum）的光合速率提高，主要是由于RuBP再生能力的增強［32］。因此，表明SBP也可能參與擬南芥分化的調(diào)節(jié)。

綜上所述，歐洲不同地理分布的擬南芥種群的光合能力在同質(zhì)園條件下發(fā)生了地理分化，強、弱光合能力的種群有著不同的地理分布。這種差異可能是由于環(huán)境因子影響的PSⅡ和Rubisco 等相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄差異所導(dǎo)致的。然而，這些基因的表達模式為何會出現(xiàn)以上的差異，其更深入的調(diào)控機理仍需進一步探索。