植物多糖的提取、修飾及其糖代謝作用

賈朋賀，劉紅*，楊定國(guó)，趙偉杰

（1.海南師范大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院?？谑袩釒厣幨惩粗参镅芯颗c開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 海口 571158；2.海南科技職業(yè)大學(xué)海南省藥食同源資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?571126）

多糖是由糖苷鍵連接的長(zhǎng)鏈單糖單元組成的高分子碳水化合物[1]。高等植物、動(dòng)物、細(xì)菌以及微生物多糖具有廣泛的生物活性，如免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化和降血糖等。植物多糖能抑制葡萄糖的產(chǎn)生、促進(jìn)肝糖原合成，故在預(yù)防糖代謝相關(guān)疾?。ㄌ悄虿?、肥胖與營(yíng)養(yǎng)不良）中顯得極其重要。糖尿病是由于胰島功能減退進(jìn)而降低胰島素敏感性和糖原利用度，從而引起相關(guān)代謝酶活性、脂質(zhì)代謝紊亂等問題。目前，多糖通過抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、神經(jīng)調(diào)節(jié)、腸道微生物群以及糖代謝物等途徑治療糖代謝疾病[2]。糖尿病及其并發(fā)癥是漸變氧化應(yīng)激和抗氧化防御機(jī)制失衡，從而可能導(dǎo)致糖尿病人的細(xì)胞和組織損傷并且加速糖尿病并發(fā)癥的出現(xiàn)[3]，適當(dāng)?shù)目寡趸瘎┛梢栽谝欢ǔ潭壬项A(yù)防或延緩糖尿病并發(fā)癥的出現(xiàn)[4]。如牛膝多糖不僅能清除自由基，還能通過修復(fù)胰島β細(xì)胞，改善免疫系統(tǒng)來(lái)緩解高血糖的癥狀。麥冬多糖降低了由鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ）誘發(fā)糖尿病模型小鼠的血糖濃度，增加胰島素的水平，改善胰島素水平。多糖通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié)糖代謝，如黃芪多糖調(diào)節(jié)了糖尿病小鼠骨骼肌胰島素中的蛋白激酶 B（protein kinase B，PKB）/葡萄糖運(yùn)載體 4（glucose transporter 4，GLUT4）信號(hào)通路[5]，PKB 在脂肪細(xì)胞表達(dá)從而刺激葡萄糖的攝取和GLUT4向細(xì)胞膜的靠近。多糖通過調(diào)節(jié)神經(jīng)靶點(diǎn)海馬體，起到增強(qiáng)抗氧化性、改善記憶力、緩解高血壓的作用。天然多糖是由葡聚糖、果聚糖、木聚糖、甘露聚糖和半乳聚糖組成的聚合物（如半乳甘露聚糖、果膠）構(gòu)成，難消化、難發(fā)酵的桑椹多糖通過調(diào)節(jié)腸道微生物菌群，提高健康腸道微生物數(shù)量[6]和體系內(nèi)糖酶[7]活力來(lái)調(diào)節(jié)糖代謝紊亂。鑒于研究者已經(jīng)對(duì)黃芪、苦瓜、南瓜、麥冬、石斛、茶、桑葉等植物多糖的降糖活性及機(jī)制做了深入的研究，本文對(duì)國(guó)內(nèi)外植物多糖的提取技術(shù)（溶劑提取法、生物酶提取法、超聲波輔助提取法、微波輔助提取法）和分離純化技術(shù)（離子色譜法、親和色譜法、凝膠柱層析法、膜分離技術(shù)）以及硫酸化、乙?；?、羥丙基、羧甲基化修飾多糖以及降糖活性進(jìn)行綜述，為進(jìn)一步研究多糖的降糖機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 提取技術(shù)

1.1 溶劑提取法

溶劑提取法是提取植物多糖的常用方法，主要溶劑為水和乙醇[8]。PAKROKH[9]利用水提法來(lái)提取藥蜀葵根多糖，具有生產(chǎn)過程安全、提取效率高等優(yōu)點(diǎn)。為提取分子量大、分支度高的植物多糖，有時(shí)采用酸堿提取法。酸堿提取法是將植物浸泡在酸堿溶液中，酸堿能夠迅速破壞植物的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和改變細(xì)胞膜的通透性，縮短多糖的溶出時(shí)間，明顯提高多糖提取率[10]。Li等[11]利用酸堿提取法提取馬鈴薯皮中水不溶性膳食纖維，當(dāng)酸堿提取時(shí)間為35 min、酸提取濃度為1.5%、堿提取濃度為1.6%時(shí)，水不溶性膳食纖維的提取率為12.6%。Guidara等[12]采用酸溶法，用pH 3.0的檸檬酸提取薄荷多糖，結(jié)果表明該多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶有較強(qiáng)的抑制活性。Gu等[13]利用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液從番荔枝渣提取酸性多糖。Jiang等[14]利用堿溶法獲得裙帶菜硫酸多糖，提取率為（21.59±1.35）%。Vanavil B等[15]利用熱水浸提法和鹽酸提取法從褐藻中提取硫酸化多糖，鹽酸提取法得率為1.2%，熱水浸提法得率為3.6%，大于鹽酸提取法多糖得率。謝丹丹等[16]發(fā)現(xiàn)黃芪堿溶多糖最優(yōu)提取工藝條件為提取溫度70℃、提取時(shí)間 130 min、料液比 1∶20（g/mL），此條件下提取率為（15.63±0.36）%。由此可見，堿溶和水提法有利于溶解蛋白質(zhì)，所得多糖提取率較高。

1.2 新興提取技術(shù)

1.2.1 生物酶提取法

多糖內(nèi)嵌蛋白質(zhì)形成細(xì)胞外基質(zhì)，生物酶可水解植物細(xì)胞壁釋放多糖和蛋白質(zhì)，提高多糖提取速率。許多研究者利用酶法提取提高多糖產(chǎn)量，如糖酶（粘酶、纖維素酶等）和蛋白酶（堿性蛋白酶，中性蛋白酶等）均取得了較好的試驗(yàn)結(jié)果。Zhu等[17]利用復(fù)合酶于50℃條件下提取粗綠茶多糖30 min，提取率比熱水浸提法高4.52%。Jiang等[18]利用纖維素酶提取綠豆皮多糖，在55℃條件下提取綠豆皮粉末3 h，提取率為1.61%。Li等[19]利用酶提取法提取沙蒿多糖，確定了多糖含有抗糖尿病成分。Li等[20]利用酶提法提取菊三七多糖，發(fā)現(xiàn)纖維素酶量為150 mg/g時(shí)提取率最高。

1.2.2 超聲波輔助提取法

超聲輔助提取法是利用超聲波空化使植物的細(xì)胞壁以及植物整個(gè)身體加速破裂，讓細(xì)胞內(nèi)的有效物質(zhì)能夠更快地釋放到溶劑內(nèi)，大幅度提高多糖的提取效率。超聲波空化作用于介質(zhì)時(shí)，介質(zhì)與超聲波之間會(huì)產(chǎn)生十分巨大的瞬間壓力。Yang等[21]利用高壓超聲輔助提取枳椇多糖，在超聲功率330 W、提取溫度68℃、提取時(shí)間22 min條件下，得到提取率最高為（11.81±0.26）%，并且發(fā)現(xiàn)枳椇多糖具有明顯的降血糖作用。Guo等[22]利用超聲波輔助法提取酸漿花萼多糖，在90℃下以200 W的功率提取多糖35 min，發(fā)現(xiàn)多糖能夠保護(hù)和逆轉(zhuǎn)糖尿病小鼠中由于四氧嘧啶破壞引起的β細(xì)胞壞死，具有顯著的抗糖尿病活性。Jia等[23]利用超聲波輔助酶法提取羊棲菜多糖，用2 000 mL酶溶液（1%果膠酶和1%纖維素酶，調(diào)節(jié)酸堿度至4.5）在50℃下處理1 h，然后在400 W的超聲波功率下進(jìn)行30 min，隨后在90℃下提取2 h，提取率為（18.43±1.04）%。逆轉(zhuǎn)錄-定量聚合酶鏈反應(yīng)分析表明，羊棲菜多糖的抗糖尿病作用可能與加速肝臟和肌肉對(duì)血糖的吸收和利用以及抑制肝臟葡萄糖的產(chǎn)生密切相關(guān)。Chen等[24]采用超聲波輔助提取法從薏米中提取多糖，在超聲功率10 kW、回流溫度95℃、回流時(shí)間4 h的條件下，得到水溶性多糖，該多糖可以起到調(diào)節(jié)血糖的作用。Jia等[25]利用超聲波輔助法提取玉米須多糖，將玉米須殘?jiān)c去離子水混合，使用超聲波裝置于100℃提取3次，持續(xù)1 h，發(fā)現(xiàn)超聲波輔助提取法提取的玉米須多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活性最高。

1.2.3 微波輔助提取法

微波是波長(zhǎng)為1mm～1000mm電磁波，頻率0.3GHz～300 GHz。微波加熱是通過被加熱體內(nèi)部偶極分子高頻往復(fù)運(yùn)動(dòng)，產(chǎn)生“內(nèi)摩擦熱”而使被加熱物料溫度升高，不須任何熱傳導(dǎo)過程，就能使物料內(nèi)外部同時(shí)加熱、同時(shí)升溫，加熱速度快且均勻。當(dāng)植物細(xì)胞吸收過多的能量，細(xì)胞內(nèi)部的能量與壓力成正比，內(nèi)部能量越高即細(xì)胞內(nèi)部壓力也越大，內(nèi)部壓力超過細(xì)胞壁承受的極限時(shí)細(xì)胞就會(huì)破裂，使細(xì)胞以及細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)溶解入溶液之中。研究者們發(fā)現(xiàn)微波作為使細(xì)胞內(nèi)增加能量的媒介，微波射線穿過溶劑并穿透細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞液以及溶劑都會(huì)吸收微波射線中的能量，進(jìn)而達(dá)到加速提取的目的。張萍等[26]研究表明黃芪多糖微波輔助提取的提取率比傳統(tǒng)提取法高。Chen等[27]采用微波輔助提取辣木多糖，提取條件為時(shí)間70 min，微波功率700 W、溫度 70℃、液固比 35∶1（mL/g）時(shí)，分離出對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制作用的組分。MA等[28]利用微波輔助復(fù)合酶提取甜玉米多糖，發(fā)現(xiàn)甜玉米多糖可顯著增加大鼠體重，并以劑量依賴的方式降低血糖水平。Cao等[29]采用微波輔助法提取蒼白馬尾藻多糖，發(fā)現(xiàn)最佳提取條件為21.0%乙醇和22.0%硫酸銨、料液比 1∶60（g/mL）、提取時(shí)間 15 min、微波功率830 W、提取溫度95℃，該多糖具有很強(qiáng)的α-葡萄糖苷酶抑制活性。張艷軍等[30]運(yùn)用微波輔助提取黃秋葵多糖，在緩凍時(shí)間 16 h，液料比 40 ∶1（mL/g）、浸提時(shí)間2.2 h、浸提溫度65℃、微波功率310 W條件下，提取率為17.17%。結(jié)果表明黃秋葵多糖能抑制α-葡萄糖苷酶，具有明顯的降血糖作用。Ren等[31]利用微波輔助提取鼠尾藻多糖，在提取時(shí)間23 min，微波功率547 W，提取溫度80℃，料水比1∶27（g/mL）條件下，提取率為（2.84±0.09）%。結(jié)果表明鼠尾藻多糖具有很強(qiáng)的抗氧化和α-葡萄糖苷酶抑制活性，并能提高胰島素抵抗的HepG2細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取。

2 分離純化技術(shù)

2.1 色譜法

2.1.1 離子色譜法

離子交換色譜法是利用分子電荷具有極性或離子的性質(zhì)，通常用陰離子（含-COOH）樹脂分離中性和酸性多糖。由于高糖醛酸多糖與離子交換樹脂之間存在強(qiáng)作用力，故可利用不同離子強(qiáng)度溶液洗脫制備中性和酸性多糖。陰離子交換劑包括二乙氨乙基（diethylaminoethyl，DEAE）-纖維素、DEAE-葡萄糖凝膠、DEAE-52和DEAE-Sepharose等。如使用純水和不同濃度的NaCl溶液作為流動(dòng)相，利用DEAE-52或DEAESepharose柱對(duì)玉米、桑黃等粗多糖進(jìn)行分離純化。

2.1.2 親和色譜法

親和色譜屬于選擇性液體吸附色譜法，適合植物多糖的小規(guī)模純化分離。然而很難找到特定多糖的適當(dāng)配體。金屬離子螯合樹脂去除多糖和蛋白質(zhì)的原理是金屬離子固定化親和色譜法。樹脂為載體吸附Zn2+，固定后的Zn2+與氨基酸形成絡(luò)合物殘基（如組氨酸的咪唑基團(tuán)）在蛋白質(zhì)表面實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的分離。金屬離子螯合樹脂方法的最佳吸附參數(shù)為香蒲粗多糖1.5 mg/mL、吸附時(shí)間30 min、初始pH 7.0、吸附溫度為30℃，、流量為1.5 BV/h、樹脂柱的徑高比為1∶15。該方法具有更高的脫蛋白率、脫色率、回收率和綜合吸附效果[32]。王海林等[33]利用Cu2+進(jìn)行螯合的親和層析法分離純化油茶籽多糖，吸附量為25.27 μg。DOGRA B等[34]利用10 mmol/L硫酸銅溶液預(yù)固定的固定化金屬親和柱色譜法（immobilized metal ion affinity chromatograph，IMAC）去除光合海洋微藻四倍體水溶性多糖中蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的雜質(zhì)。HAHN T等[35]利用染料親和層析法從巖藻聚糖中分離多糖，在pH 1和pH 6時(shí)，多糖純度分別提高了1.55倍和1.69倍，平均產(chǎn)量為5 g/100 g。此外在pH值為6時(shí)，純化的巖藻聚糖在分子量和硫含量方面超過市售巖藻聚糖（≥95%純度）的質(zhì)量。路垚[36]利用RCA-Sepharose 2B親和層析法分離純化金花茶多糖，RCA-Sepharose 2B與金花茶多糖的親和率為21.4%。

2.1.3 凝膠柱層析法

凝膠色譜法的原理是根據(jù)凝膠孔徑的大小分離不同組分。用凝膠柱層析法分離多糖是以分子篩為基礎(chǔ)，與多糖的大小和形狀有關(guān)。凝膠填料的選擇取決于多糖的分子量分布。常用的凝膠主要包括葡聚糖凝膠、瓊脂糖、生物凝膠、聚丙烯酰胺葡聚糖、復(fù)合凝膠、凝膠介質(zhì)等。流動(dòng)相多為蒸餾水或者一定濃度的NaCl溶液。Guo等[37]利用凝膠柱層析法從山楂果實(shí)中分離純化出富含葡萄糖的雜多糖HAW1-2。Gu等[38]利用凝膠柱層析法從黃精中分離純化出黃精多糖。Fan等[39]利用葡聚糖凝膠層析純化藜麥粗多糖中可溶性非淀粉多糖組分。

2.2 膜分離技術(shù)

膜分離法是利用膜的選擇透過性，對(duì)膜施加一定的壓力使原料中的有效成分穿過膜。超濾技術(shù)是根據(jù)不同組分的分子大小而設(shè)計(jì)不同孔徑膜，在壓力作用下，使原料中的小分子物質(zhì)通過膜一側(cè)，同時(shí)將大分子物質(zhì)隔離在膜的另外一側(cè)，以此來(lái)分離不同的組分。宮春宇等[40]利用超濾法制備玉米須多糖，確立超濾的工藝參數(shù)。

3 多糖修飾

將其他功能基團(tuán)接入多糖分子進(jìn)行接技修飾，以此來(lái)增加功能基團(tuán)。經(jīng)過修飾后的多糖分子的結(jié)構(gòu)活性會(huì)有顯著提高。常用的多糖結(jié)構(gòu)修飾法有硫酸化、烷基化、乙酰化、羧甲基化、硒化修飾法。

3.1 硫酸化多糖

硫酸化修飾法的基礎(chǔ)原理是將硫酸基團(tuán)接入多糖的糖基，利用二甲基甲酰胺、三氧化二硫、吡啶得到硫酸多糖。枸杞多糖和乙胺-三氧化二硫、二甲基甲酰胺于50℃攪拌12 h制備硫酸枸杞多糖[41]。氯磺酸、吡啶、二甲基甲酰胺在85℃條件下反應(yīng)3 h可制備硫酸裙帶菜多糖。利用三氧化二硫吡啶制備的鼠尾藻硫酸多糖表現(xiàn)出較好的α-葡萄糖苷酶抑制活性和對(duì)胰島素抵抗（insulin resistance，IR）-肝癌細(xì)胞葡萄糖消耗的促進(jìn)作用。以微波輔助提取法得到褐海帶裙帶菜硫酸多糖的組分具有較強(qiáng)的α-葡萄糖苷酶抑制活性，提高胰島素抵抗的HepG2細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取。組織病理學(xué)觀察及肝糖原測(cè)定結(jié)果表明可減輕胰島細(xì)胞損傷，減輕肝臟脂肪變性，促進(jìn)胰島細(xì)胞凋亡以及肝糖原的合成[42]。

3.2 乙?；嗵?/h3>

乙?；揎椃ǖ幕驹硎菍⒁阴；尤攵嗵侵ф溨?，使多糖支鏈出現(xiàn)伸展作用，進(jìn)而發(fā)生一定的變化，最終多糖的烴基移動(dòng)暴露在最外側(cè)。例如馬齒莧多糖乙酰化條件為馬齒莧多糖0.5 g，加入15 mL蒸餾水充分溶解，用NaOH（40 mg/mL）調(diào)節(jié)pH 9.0。邊攪拌邊滴加乙酸酐，30℃反應(yīng)4 h后，濃鹽酸調(diào)節(jié)pH 7.0。離心后取上清液透析48 h，濃縮、冷凍干燥后得到乙?；R齒莧多糖。李銀莉等[43]發(fā)現(xiàn)馬齒莧多糖經(jīng)過乙?；揎椇罂寡趸钚蕴岣?。Zhao等[44]將青錢柳多糖（cyclocarya paliurus polysaccharide，CPP）0.2 g溶解在10 mL蒸餾水中，緩慢加入0.8 mL乙酸酐，并加入5 mL氫氧化鈉，將酸堿度控制在8.0～8.5，反應(yīng)混合物在40℃下保持2 h，然后加入10 mL鹽酸終止反應(yīng)（溶液酸堿度為7），發(fā)現(xiàn)乙酰化青錢柳多糖有較好的抗氧化能力。MATOSO等[45]將胖大海（0.5 g）懸浮在50℃的20 mL甲酰胺中，劇烈攪拌1 h。加入吡啶（1.5 mL）和乙酸酐，溶液在磁力攪拌（100 r/min）下保持24 h，制得乙?；嗵?。

3.3 羧甲基化多糖

羧甲基化多糖是指多糖大分子鏈中單糖分子上的某一個(gè)或幾個(gè)羥基被羧甲基基團(tuán)取代而形成的一類化學(xué)結(jié)構(gòu)復(fù)雜、生物活性多樣、構(gòu)效鮮明的陰離子多糖衍生物。白家峰等[46]表明羧甲基化修飾能夠改變羅漢果多糖的生物活性，提高羅漢果多糖的抗氧化性能。Zheng等[47]研究表明羧甲基化對(duì)棕櫚仁膨化膳食纖維α-淀粉酶活性抑制率變強(qiáng)。Cheng等[48]以氯乙酸為原料制備羧甲基化-硫酸化大蒜多糖。

3.4 羥丙基化多糖

羥丙基化多糖是使多糖在堿性溶液中形成醇鈉，再與環(huán)丙烷制備羥丙基多糖。Chen等[49]將多糖或膳食纖維或水解淀粉漿5 g～10 g加入10 mL5%～6%NaOH溶液，在35℃下攪拌堿化30 min，再加入2 mL的環(huán)丙烷，控制反應(yīng)溫度為40℃～60℃和時(shí)間4 h～24 h。反應(yīng)結(jié)束后，用乙酸將反應(yīng)產(chǎn)物調(diào)節(jié)至中性，經(jīng)過濾后將沉淀于60℃真空干燥，粉碎，制得羥基化多糖。Nagata等[50]研究表明，喂食羥丙基-正常玉米淀粉組或羥丙基-糯玉米淀粉組的大鼠盲腸微生物組成發(fā)生改變，厚壁菌門和擬桿菌門的相對(duì)豐度升高；短鏈脂肪酸（short chain fatty acid，SCFA）含量增高，盲腸 pH 值和腸系膜脂肪細(xì)胞面積降低，血漿胰高血糖素樣肽-1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）水平和盲腸黏蛋白含量升高。因此，羥丙基-玉米淀粉具有促進(jìn)腸道發(fā)酵和脂質(zhì)代謝的有益生理特性。

3.5 硒化多糖

硒化修飾是指硒元素與多糖中單糖上2個(gè)順式相鄰羥基形成五元環(huán)的亞硒酸酯[51]。目前，主要的硒多糖有硒化卡拉膠、SeOCl2試劑合成的黃芪多糖、亞硒酸和甘草多糖合成的甘草硒多糖等。通過硒化修飾可將多糖與硒元素有機(jī)結(jié)合成硒多糖，是一種增強(qiáng)多糖生物活性的有效方法。如桔梗硒多糖對(duì)α-糖苷酶抑制作用強(qiáng)于桔梗多糖。

4 結(jié)語(yǔ)

目前植物多糖的提取方法主要為溶劑提取法、生物酶提取法、超聲波輔助提取法、微波輔助提取法，植物多糖的分離純化方法主要為離子色譜法、親和色譜法、凝膠柱層析法、膜分離技術(shù)，植物多糖修飾方法主要為硫酸化修飾、乙?；揎椃?、羥丙基修飾、羧甲基化修飾。近年來(lái)植物多糖的高效提取、分離純化以及化學(xué)修飾被研究得越來(lái)越深入，化學(xué)修飾植物多糖在降糖活性上的價(jià)值越來(lái)越高。相信隨著對(duì)植物多糖話化學(xué)修飾研究的進(jìn)一步深入，化學(xué)修飾植物多糖的結(jié)構(gòu)及其降糖活性機(jī)制可以進(jìn)一步闡明。