秦明倩，馬嘉琦，黃巾凌，馮承謙，盧行安，趙紅陽，周巍，崔生輝，楊保偉*

（1 西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 陜西楊凌 7121002 漢中市漢臺區(qū)市場監(jiān)督管理局 過街樓蔬菜批發(fā)市場監(jiān)管所 陜西漢中723000 3 中國檢驗檢疫科學(xué)研究院 北京100176 4 河北省食品檢驗研究院 河北石家莊050000 5 中國食品藥品檢定研究院 北京 100050）

在眾多食品安全風(fēng)險中，微生物污染已成為全球性公共安全威脅[1]。據(jù)WHO 統(tǒng)計和發(fā)布，致病性微生物導(dǎo)致全世界70%食源性疾病的發(fā)生[2]，它們會在生產(chǎn)、加工和運(yùn)輸?shù)雀鱾€階段污染食品，造成食源性疾病爆發(fā)[3]。比較近些年來我國家庭中食源性致病菌引發(fā)的疾病暴發(fā)事件，了解到沙門氏菌占據(jù)食源性致病菌的首位[4-5]，使人們更加關(guān)注食品微生物風(fēng)險防控[6]。抗生素藥物使用是防控致病菌感染最直接、有效的手段[7-8]。β-內(nèi)酰胺類藥物抗菌譜廣，殺菌能力強(qiáng)，低毒，治療效果好[9]，然而，大量使用導(dǎo)致很多食源性致病菌對其產(chǎn)生耐藥性。研究者揭示其耐藥是由于致病菌產(chǎn)生的β-內(nèi)酰胺酶會與抗生素快速牢固結(jié)合，干擾抗生素進(jìn)入靶位發(fā)生作用，或者水解抗生素[10-11]，使其抗菌活性喪失[12]，以及β-內(nèi)酰胺酶相關(guān)編碼基因通常會頻繁地在不同細(xì)菌間轉(zhuǎn)移[13]，導(dǎo)致此類抗生素耐藥性傳播范圍擴(kuò)大。據(jù)統(tǒng)計，目前已有腸炎沙門氏菌、動物源致病性大腸桿菌、泛耐藥銅綠假單胞菌等對β-內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥率在逐年增加[14-17]。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)兼具均勻性強(qiáng)、穩(wěn)定性好，測量值精準(zhǔn)等特點(diǎn)[18-19]，可避免含復(fù)雜成分檢測背景的干擾。近年來，我國食源性細(xì)菌耐受β-內(nèi)酰胺類抗生素非常普遍，迫切需求準(zhǔn)確、快捷檢測食源性致病菌攜帶耐藥基因的方法，開展相關(guān)菌株的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制，利于更有效溯源和控制污染源的傳播[20]。同時，微生物檢測參考菌株的研究、驗證和使用可以實現(xiàn)具有自主知識產(chǎn)權(quán)菌種在食品微生物標(biāo)準(zhǔn)樣品領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，縮短抽檢、監(jiān)測機(jī)構(gòu)標(biāo)準(zhǔn)樣品采購周期，降低采購價格[21]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株 3 株供試菌均為沙門氏菌（Salmonella），來源于農(nóng)貿(mào)市場、超市零售食品和食源性疾病臨床樣本，保存于-80 ℃超低溫冰箱。供試菌已獲得中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏中心（National Center for Medical Culture Collections，CMCC）保藏號。標(biāo)準(zhǔn)菌株鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium LT2）由中國食品藥品檢定研究院惠贈。

1.1.2 培養(yǎng)基 LB 溶菌肉湯和LB 瓊脂培養(yǎng)基，北京陸橋技術(shù)股份有限責(zé)任公司。

1.1.3 試劑 Taq DNA 聚合酶、10×PCR Buffer（Mg2+free）、MgCl2、dNTP Mixture、DL2000 DNA Marker，寶生物工程有限公司（TaKaRa）；海藻糖、谷氨酸鈉等分析純化學(xué)試劑，廣東光華科技有限公司。

1.1.4 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain reaction，PCR）引物 blaTEM、blaOXA和blaCTX-M擴(kuò)增和測序用引物見表1。

表1 PCR 擴(kuò)增用引物序列和產(chǎn)物長度Table 1 Primer sequence used for PCR amplification and the size of corresponding PCR product

1.2 儀器與設(shè)備

基因擴(kuò)增儀（Mycircle），美國Bio-rad 公司；凝膠成像系統(tǒng)（GELDOCXR），美國Bio-rad 公司；電泳儀（Hema9600），北京六一生物科學(xué)儀器有限公司；-80 ℃超低溫冰箱（MDF-3286S），日本SANYO 公司；4 ℃冰箱（BCD-205TA），青島海爾股份有限公司；超凈工作臺（SW-CJ-1CU），蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；真空冷凍干燥機(jī)（SP SCIENTIFIC wizard 2.0），美國Virtis 公司。

1.3 方法

1.3.1 參考菌株制備

1.3.1.1 菌種活化 首先將冷凍保藏的菌種恢復(fù)到室溫狀態(tài)，無菌劃線接種菌液于LB 瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃過夜培養(yǎng)。

1.3.1.2 參考菌株β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥性相關(guān)編碼基因驗證 用無菌牙簽挑取適量活化好的單菌落，于100 μL 無菌ddH2O 的PCR 管中分散均勻，裂解法制備菌株DNA 模板[23]。使用PCR 檢測耐藥性相關(guān)編碼基因，引物見表1。設(shè)置PCR 擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃變性1 min，退火1 min，72 ℃延 伸2 min，35 個循環(huán)；72 ℃延 伸10 min。根據(jù)不同基因的引物序列設(shè)置退火溫度。對PCR 產(chǎn)物進(jìn)行染色和電泳分析，于凝膠成像系統(tǒng)下拍攝擴(kuò)增產(chǎn)物條帶。陽性PCR 產(chǎn)物低溫送樣測序，將結(jié)果與原始序列通過BLAST 分析和比對，驗證基因類型及是否突變。

1.3.1.3 目標(biāo)基因遺傳穩(wěn)定性檢驗 對攜帶β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥性編碼基因的3 株沙門氏菌連續(xù)傳代培養(yǎng)，選取每株菌的第1，3，6，9，12，15 代檢測目標(biāo)基因的遺傳穩(wěn)定性（表2）。主要操作方法：接種凍存保藏的原代菌株，37 ℃培養(yǎng)18～24 h后獲得第1 代菌株；使用無菌接種環(huán)隨機(jī)挑取第1 代菌株中的單個菌落，劃線、分離、培養(yǎng)；連續(xù)重復(fù)傳代培養(yǎng)直至第15 代。分別從各代取菌的同一菌落挑取第1，3，6，9，12，15 代培養(yǎng)物，煮沸制備DNA 模板，擴(kuò)增目標(biāo)基因。PCR 擴(kuò)增條件和序列分析如1.3.1.2 節(jié)。根據(jù)擴(kuò)增片段大小確定傳代過程基因是否丟失。對測序擴(kuò)增產(chǎn)物、原代菌株的基因序列比對，驗證基因是否發(fā)生突變。

表2 真空冷凍干燥制備的3 株參考菌株信息Table 2 Information of the 3 reference strains prepared by vacuum freeze drying

1.3.1.4 冷凍干燥制備參考菌株 挑取LB 培養(yǎng)基活化培養(yǎng)的單菌落，劃線至LB 斜面，置37 ℃培養(yǎng)20～24 h。取少許菌體混散在含有無菌凍干保護(hù)劑的試管中制備菌懸液，然后，加入裝有凍干保護(hù)劑和轉(zhuǎn)子的錐形瓶中，輕度旋轉(zhuǎn)3～5 min，混勻，制得菌液濃度在106～107CFU/mL。分裝1 mL 預(yù)制備樣品于無菌西林瓶中，輕放瓶蓋，保證留有空隙，使瓶內(nèi)空氣排出，形成真空。將裝好樣品的西林瓶放入真空冷凍干燥機(jī)，設(shè)定程序并運(yùn)行約25～35 h。冷凍干燥完成后，將樣品壓蓋密封、編號，于4℃條件短期保存。制備過程及完成樣品如圖1 所示。

圖1 參考菌株標(biāo)準(zhǔn)樣品制備流程圖Fig.1 Procedure of reference strain preparation

試驗中，3 株參考菌株分別制備500 瓶，選用西林瓶真空包裝，內(nèi)蓋用橡膠塞，外層用鋁箔蓋加強(qiáng)密封。

1.3.2 參考菌株均勻性檢驗 分別從3 株菌制備的500 瓶樣品中隨機(jī)抽取12 瓶，各用60 mL 無菌水室溫下水化。樣品經(jīng)充分溶解、震蕩混勻后，梯度稀釋至檢驗所需濃度。吸取100 μL 待測樣品稀釋液，無菌均勻涂布培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)18～24 h，每個樣品做3 個平行。按照GB 4789.2-2016《食品微生物學(xué)檢驗》[26]完成菌落計數(shù)定量檢驗，對數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行處理和方差分析，評估樣品的均勻性。

1.3.3 參考菌株穩(wěn)定性檢驗

1.3.3.1 運(yùn)輸穩(wěn)定性檢驗 因參考菌株于-80 ℃貯存，故不需要考慮極端低溫下的運(yùn)輸穩(wěn)定性。研究參考菌株在37 ℃存放13 d 的活菌數(shù)動態(tài)，模擬考察不加冰室溫運(yùn)輸中活菌數(shù)的變化和目標(biāo)基因的遺傳穩(wěn)定性。對保存在37 ℃的參考菌株每樣每次抽檢3 瓶，每瓶重復(fù)檢驗3 次。分別從制備完成第1，3，5，7，9，11，13 d 抽檢，共抽檢7 次。活菌數(shù)和目標(biāo)基因檢驗方法同1.3.1.2 節(jié)和1.3.2 節(jié)。

1.3.3.2 短期貯存穩(wěn)定性檢驗 對保存在4 ℃的參考菌株每樣每次抽檢3 瓶，每瓶重復(fù)檢驗3 次。從制備完成至第1，3，5，7，9，11 d 和13 d 每天抽檢1 次，之后，每月抽檢1 次，即21，30，60，90 d，共抽檢11 次，監(jiān)測活菌數(shù)是否變化，耐藥基因是否穩(wěn)定遺傳，檢驗方法同1.3.1.2 節(jié)和1.3.2 節(jié)。

1.3.3.3 長期貯存穩(wěn)定性檢驗 對保存在-80 ℃的參考菌株每樣每次抽檢3 瓶，每瓶重復(fù)檢驗3次。從制備完成至第3 個月每月1 次，即第30，60，90 天。后期視情況而定，若穩(wěn)定可2～3 個月抽檢1 次，于第150，210，300，360 天各抽檢1 次，共7 次。監(jiān)測活菌數(shù)是否變化，耐藥基因是否穩(wěn)定遺傳，檢驗方法同1.3.1.2 節(jié)和1.3.2 節(jié)。

1.3.4 參考菌株的聯(lián)合定值 為了保證參考菌株的特性值及研制過程的準(zhǔn)確性，委托全國7 家具有定值資質(zhì)和能力的實驗室對參考菌株RM_AST_SM 176 的特性值進(jìn)行聯(lián)合定值。每個參與定值的實驗室發(fā)放3 個樣品，每個樣品2 個平行。測試方法參考GB 4789.4-2016 和SN/T 1869-200T 進(jìn)行[27-28]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所得數(shù)據(jù)通過Excel 2019、SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行收集、統(tǒng)計學(xué)方差分析（Duncan 法，P＜0.05）和作圖，每組試驗數(shù)據(jù)均取得3 次平行。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試菌中目標(biāo)基因遺傳穩(wěn)定性

3 株菌攜帶的blaTEM、blaOXA和blaCTX-M基因擴(kuò)增條帶清晰單一、片段大小一致，表明目標(biāo)基因在15 代傳代中均可穩(wěn)定遺傳（圖2：以blaCTX-M-3為代表的電泳結(jié)果）。各代菌株目標(biāo)基因測序結(jié)果與初代菌株無差異，無基因突變（圖3：以blaC-TX-M-3為代表的基因序列比對結(jié)果）。3 株菌性質(zhì)穩(wěn)定，滿足制備β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥機(jī)制檢測用參考菌株的預(yù)期要求。

圖2 耐藥基因PCR 擴(kuò)增的電泳分析結(jié)果Fig.2 PCR amplification results of antibiotic-resistance encoding genes analyzed by agarose gel electrophoresis

圖3 不同代菌株中blaCTX-M-3 序列比對結(jié)果Fig.3 Results of blaCTX-M-3 sequence alignment in different generational strains

2.2 參考菌株均勻性檢驗結(jié)果

檢測到由每株參考菌株隨機(jī)抽取的12 瓶樣品菌落數(shù)均為×106CFU/瓶。由方差分析可知，隨機(jī)抽取的菌株樣品活菌數(shù)間不存在顯著差異（F 值＜F 臨界值，置信概率為95%，見表3），表明均勻性滿足標(biāo)準(zhǔn)樣品要求。

表3 參考菌株均勻性方差分析檢驗結(jié)果Table 3 Results of homogeneity variance analysis for reference strains

2.3 參考菌株穩(wěn)定性檢驗結(jié)果

2.3.1 運(yùn)輸穩(wěn)定性 參考菌株在37 ℃存放5 d后，瓶內(nèi)活菌數(shù)有微弱的降低趨勢，13 d 時降低10%～20%，而活菌數(shù)量均保持在104～105CFU/瓶的水平，總體情況穩(wěn)定，滿足定性標(biāo)準(zhǔn)樣品要求（圖4）。

圖4 參考菌株37 ℃條件下的貯存穩(wěn)定性結(jié)果Fig.4 Stability results of the reference strains stored at 37 ℃

貯存于37 ℃，不同時間取樣的參考菌株的特征基因均可檢出，出現(xiàn)的PCR 擴(kuò)增條帶清晰單一、整齊明亮、片段大小均勻一致（圖5：以blaCTX-M-3為代表的電泳結(jié)果）。參考菌株目標(biāo)基因運(yùn)輸穩(wěn)定性良好。

圖5 37 ℃保存參考菌株blaCTX-M-3 PCR 擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果Fig.5 Results of PCR amplification and agarose gel electrophoresis for blaCTX-M-3 in the reference strain stored at 37 ℃

圖6 參考菌株4 ℃條件下的貯存穩(wěn)定性結(jié)果Fig.6 Stability results of the reference strains stored at 4 ℃

2.3.2 短期穩(wěn)定性 參考菌株于4 ℃貯存90 d，不同時間的活菌數(shù)基本維持在8.53×105～5.57×106CFU/瓶的水平，活菌數(shù)下降幅度在27%左右，總體低于存放在37 ℃時活菌數(shù)的變化率，表明參考菌株在4 ℃短期儲存穩(wěn)定性良好。

4 ℃貯存時，不同時間取出的樣品中目標(biāo)基因均可檢出，得到的PCR 擴(kuò)增條帶清晰單一，整齊明亮，片段大小均勻一致（圖7：以blaCTX-M-3為代表的基因擴(kuò)增電泳結(jié)果），表明參考菌株在4 ℃貯存90 d 穩(wěn)定性良好。

圖7 4 ℃保存參考菌株blaCTX-M-3 PCR 擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果Fig.7 Results of PCR amplification and agarose gel electrophoresis for blaCTX-M-3 in the reference strain stored at 4 ℃

2.3.3 長期穩(wěn)定性 參考菌株于-80 ℃存放360 d，等時間間隔不同時間點(diǎn)取出的樣品中活菌數(shù)均落在合理范圍浮動（因第150 天和第180 天受到新型冠狀病毒疫情影響，監(jiān)測數(shù)據(jù)無法得到），菌落計數(shù)結(jié)果維持在106CFU/瓶的水平及以上（圖8），表明參考菌株在-80 ℃保存穩(wěn)定性良好。

圖8 參考菌株-80 ℃條件下的貯存穩(wěn)定性結(jié)果Fig.8 Stability results of the reference strains stored at -80 ℃

檢測儲存在-80 ℃的參考菌株特征性基因，目標(biāo)基因均可被檢出，PCR 產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖9所示?？蓴U(kuò)增出清晰單一的條帶，片段大小一致，表明參考菌株在-80 ℃長期穩(wěn)定性良好。

圖9 -80 ℃保存參考菌株blaCTX-M-3 PCR 擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果Fig.9 Results of PCR amplification and agarose gel electrophoresis for blaCTX-M-3 in the reference strain stored at -80 ℃

2.4 聯(lián)合定值

7 家實驗室的聯(lián)合定值結(jié)果表明，攜帶β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥基因blaCTX-M-3的參考菌株RM_AST_SM 176 特性值與預(yù)期結(jié)果一致，符合標(biāo)準(zhǔn)樣品要求，能夠滿足預(yù)期用途。

3 討論

沙門氏菌是非常普遍的食源性致病菌，在公共衛(wèi)生安全領(lǐng)域占有主導(dǎo)地位，是公眾健康研究的重點(diǎn)關(guān)注菌種[29]。其攜帶多種耐藥性編碼基因，是研制耐藥基因和耐藥機(jī)制檢測用參考菌株的合適材料[30]。食品微生物檢驗有力地支撐和保障了我國的食品安全體系[31]。雖然全基因組測序可以全面、準(zhǔn)確地捕獲和檢測食源性致病菌攜帶的耐藥基因，有效地掌握其介導(dǎo)的耐藥機(jī)制，但是耗時較長，專業(yè)性也很強(qiáng)，不易在基層推廣使用，比較難以實現(xiàn)耐藥機(jī)制和耐藥基因的臨檢和快檢[32]。PCR 技術(shù)相對簡單、快捷，利用PCR 對檢測食源性致病菌所用參考菌株很有必要，可切實保障檢測結(jié)果的可靠性。

我國多個領(lǐng)域已初步研發(fā)出參考物質(zhì)，并且建立用于研發(fā)技術(shù)交流、質(zhì)量評價的國家參考物質(zhì)資源共享平臺[33]。然而，在該平臺上乃至全球范圍內(nèi)都缺乏適用于食品微生物檢驗的參考物質(zhì)，主要?dú)w因于微生物易變異，易發(fā)生污染，代謝機(jī)制復(fù)雜等，純菌種也大多數(shù)由菌種保藏機(jī)構(gòu)來提供。目前，我國市場上對標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的需求量和需求品種增長迅速，然而，我國微生物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研發(fā)基礎(chǔ)和進(jìn)度整體性不夠。雖然駱海朋等[36]研制出阪崎克羅諾桿菌標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，夏丹丹等[37]制備了大腸桿菌DNA 定性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，王深壘[38]研制了沙門氏菌質(zhì)粒DNA 定性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，含有食品基質(zhì)的微生物參考物質(zhì)在國內(nèi)個別機(jī)構(gòu)展開研究和推行，但是目前國內(nèi)尚無用于介導(dǎo)β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥機(jī)制及耐藥基因檢測用定性標(biāo)準(zhǔn)樣品。

通常將食源性致病菌攜帶的特定編碼基因作為研究目標(biāo)，方便于對菌株特性進(jìn)行追蹤和檢測[39]。因此，要求標(biāo)準(zhǔn)菌株中攜帶特定的編碼基因，在菌株的不同代、不同運(yùn)輸和貯藏環(huán)境中都可以穩(wěn)定存在。本研究制備的β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥機(jī)制檢測用參考菌株特性基因在15 代內(nèi)均可穩(wěn)定遺傳，無突變，可用作標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和參考菌株制備的供試菌。

真空冷凍干燥技術(shù)可以很好地維持和穩(wěn)定生物材料在貯藏過程中數(shù)量和特性值隨溫度、時間的變化[41]。冷凍干燥操作時，會將微生物與保護(hù)劑混合，使微生物細(xì)胞形成玻璃化狀態(tài)，盡可能地消除或減弱冰晶對微生物細(xì)胞的傷害，更好地保證微生物活性[42]。本研究經(jīng)真空冷凍干燥技術(shù)制備的參考菌株標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性良好。制備完成后，對參考菌株標(biāo)準(zhǔn)樣品的穩(wěn)定性檢驗主要集中在溫度對其活性、存活率以及目標(biāo)基因遺傳穩(wěn)定性的影響。37 ℃貯存13 d，前5 d 菌落數(shù)的變化最明顯，可能是由于瓶中原始活菌數(shù)多，氣溫較高導(dǎo)致微生物死亡，然而，目標(biāo)基因穩(wěn)定性保持良好。參考菌株標(biāo)準(zhǔn)樣品最好采用冷鏈運(yùn)輸，若沒有冷鏈條件則需要加冰處理，可在一定程度上減少微生物活菌數(shù)的減少。4 ℃貯存90 d 后，參考菌株菌落數(shù)總體呈下降趨勢，部分參考菌株標(biāo)準(zhǔn)樣品的活菌數(shù)波動幅度較大，可能是由于瓶間原始活菌數(shù)存在差異?？傮w來看，使用過程中將參考菌株短期存放于4 ℃冰箱，可使溫度對活菌數(shù)的影響控制在一定范圍內(nèi)。-80 ℃貯存360 d，每瓶標(biāo)準(zhǔn)樣品內(nèi)的活菌數(shù)在貯藏過程隨時間的延長雖有一定量的減少，但在一定范圍內(nèi)波動，屬于正常情況，活菌數(shù)含量一直保持在×104CFU/瓶以上，參考菌株穩(wěn)定性良好，符合標(biāo)準(zhǔn)樣品要求。

為切實保證參考菌株特性值的準(zhǔn)確性和可靠性，7 家具有食品安全檢測資質(zhì)的承檢單位對其聯(lián)合定值，研制參考菌株標(biāo)準(zhǔn)樣品的特性值與聯(lián)合定值結(jié)果是相吻合的，符合參考物質(zhì)要求。

4 結(jié)論

本研究研制出3 株攜帶β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥機(jī)制編碼基因的參考菌株，其均勻性、貯藏性和目的基因遺傳穩(wěn)定性皆良好，可直接用于食品、臨床及環(huán)境領(lǐng)域β-內(nèi)酰胺類抗生素相關(guān)基因介導(dǎo)的耐藥機(jī)制的快檢和臨檢，豐富了我國在耐藥微生物及其耐藥機(jī)制檢測標(biāo)準(zhǔn)中的參考物質(zhì)資源。