王 慧 吳志醫(yī) 張玉娥 喻德躍

應(yīng)用RNA重測序分析低硫條件下大豆基因表達(dá)譜

王 慧 吳志醫(yī) 張玉娥 喻德躍*

南京農(nóng)業(yè)大學(xué)/ 國家大豆改良中心/ 作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/ 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部大豆生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 江蘇南京 210095

大豆是重要的糧油兼用作物, 其硫利用的研究不足。本研究評價(jià)了云夢六月花葉和沁陽大豆對低硫的耐性, 以這2個(gè)品種為材料, 利用RNA重測序技術(shù)分析了對照(+S)和缺硫(–S)水平下根和葉中的表達(dá)譜。結(jié)果表明, 云夢六月花葉對低硫表現(xiàn)為耐性, 沁陽大豆對低硫表現(xiàn)為敏感。表達(dá)譜分析在云夢六月花葉和沁陽大豆的葉中分別鑒定到9064個(gè)和9795個(gè)低硫響應(yīng)的差異表達(dá)基因, 根中分別鑒定到3185個(gè)和5006個(gè)差異表達(dá)基因。KEGG富集分析發(fā)現(xiàn), 2個(gè)材料葉中有9個(gè)共有途徑, 僅植物MAPK信號途徑富集更多的上調(diào)表達(dá)基因。2個(gè)材料根中有18個(gè)共有途徑, 其中9個(gè)途徑在2個(gè)材料的中對低硫的響應(yīng)一致, 4個(gè)途徑包含更多的上調(diào)表達(dá)基因, 5個(gè)途徑包含更多的下調(diào)表達(dá)基因。在其余9個(gè)途徑中, 云夢六月花葉包含更多的上調(diào)表達(dá)基因。大豆硫酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因?qū)α蛩岣奈蘸娃D(zhuǎn)運(yùn)非常重要, 在表達(dá)譜中鑒定到27個(gè)硫酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因, 分屬4個(gè)亞組, 亞組1、2、4的基因多受低硫誘導(dǎo), 亞組3的基因?qū)Φ土虻捻憫?yīng)較為復(fù)雜?；诟患治鼋Y(jié)果, 本研究從植物MAPK信號途徑中克隆了一個(gè)受低硫誘導(dǎo)的基因, 通過轉(zhuǎn)化大豆毛狀根證明該基因參與大豆硫利用的調(diào)控。本研究結(jié)果為深入探索大豆硫利用效率的遺傳機(jī)理奠定了基礎(chǔ), 為大豆耐低硫育種提供了候選基因。

大豆; 低硫; RNA重測序; 硫酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白; EIN3/EIL

大豆是重要的糧油兼用作物, 為人類和其他動(dòng)物提供優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)和脂肪。硫是大豆生長和發(fā)育必須的營養(yǎng)元素, 是氨基酸、葉綠素、硫苷脂、維生素、輔酶等有機(jī)物的組成成分, 在多個(gè)生理過程中具有重要作用。和其他植物一樣, 大豆中的硫元素主要來自于土壤中的硫酸鹽, 與氮、磷、鉀相比, 大豆硫利用的遺傳研究較少。

在大豆上, 硫利用的遺傳研究集中在發(fā)掘和鑒定硫酸根吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和還原的蛋白編碼基因上。植物從土壤中吸收硫酸根依賴于硫酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[1], 大豆基因組中有28個(gè)硫酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因, 其中基因強(qiáng)烈響應(yīng)低硫誘導(dǎo), 在煙草中過量表達(dá)增加植株的生物量、千粒重、半胱氨酸含量、葉片中的可溶性總蛋白含量等[2]。進(jìn)入細(xì)胞的硫酸根不能被植物直接利用, 先活化為5'-磷酸腺苷硫酸(APS), 這個(gè)過程由三磷酸腺苷硫酸化酶(ATP sulfurylase, ATPS)催化[1]。大豆基因組中有4個(gè)ATPS編碼基因,基因與擬南芥、馬鈴薯的基因高度同源, 在根中表達(dá)量豐富, 在種子中隨著種子的發(fā)育過程表達(dá)量和酶活性降低[3]。隨后APS又在腺苷酰硫酸還原酶(adenosine 5’-phosphosulfate reductase, APSR)催化下產(chǎn)生亞硫酸鹽[1], 大豆APSR編碼基因有3個(gè), 其中基因在大豆的根、葉、花、種子和根瘤中都有表達(dá), 在種子發(fā)育早期基因表達(dá)量和酶活性都較高, 同樣隨著種子發(fā)育進(jìn)程逐漸降低, 在根中該基因的表達(dá)量受硫、磷饑餓的誘導(dǎo)[4]。亞硫酸鹽再在鐵鹽還原蛋白和亞硫酸鹽還原酶(sulfite reductase, SIR)的作用下進(jìn)一步還原成二階亞硫酸鹽, 在絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶(serine acetyltransferase, SATase/SERAT)和O-乙酰膽堿(硫醇)裂解酶(O-acetylserine sulfhydrylase, OASS/ OAS-TL)作用下, 硫酸鹽整合進(jìn)碳骨架生成第1個(gè)含硫有機(jī)物Cys[1]。大豆的SATase/SERAT和OASS/ OAS-TL編碼基因較多, 分別有8個(gè)和6個(gè)[5], 其中能拯救大腸桿菌基因突變體的表型, 在大豆種子發(fā)育過程中低水平表達(dá), 葉片和種子中酶活性較低[6]。6個(gè)不同的OASS基因在不同時(shí)期種子中高表達(dá)[7],能彌補(bǔ)大腸桿菌半胱氨酸營養(yǎng)突變體的功能[8], 在大豆中過表達(dá)基因增加含Cys蛋白質(zhì)的含量, 但造成植株矮化, 產(chǎn)量降低[5]。可見, 大豆硫利用的遺傳研究基礎(chǔ)是比較薄弱的, 單個(gè)基因的功能是有限的, 所以有必要開展全基因組水平上的遺傳研究, 探索大豆硫利用的調(diào)控網(wǎng)絡(luò), 發(fā)掘和鑒定更多的硫利用關(guān)鍵基因。

在前期研究的基礎(chǔ)上, 本研究以2個(gè)大豆地方品種為材料, 通過室內(nèi)水培試驗(yàn)評價(jià)了低硫?qū)γ缙诖蠖沟挠绊? 利用RNA重測序(RNA-seq)分析了2個(gè)材料根和葉中的低硫響應(yīng)的基因表達(dá)譜, KEGG富集分析探索低硫調(diào)控的代謝途徑, 分析了不同的硫酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因低硫響應(yīng)的表達(dá)規(guī)律, 對植物MAPK信號途徑中基因進(jìn)行了功能的初步研究。本研究結(jié)果為深入探索大豆硫利用效率的遺傳機(jī)理奠定了基礎(chǔ), 也為大豆耐低硫育種提供了候選基因。

1 材料與方法

1.1 材料種植、表型測定和取樣

利用室內(nèi)水培試驗(yàn)評價(jià)云夢六月花葉和沁陽大豆對低硫的耐性。該試驗(yàn)在人工氣候室內(nèi)進(jìn)行, 光照時(shí)間為16 h, 溫度為26～28℃。設(shè)置缺硫和對照2個(gè)處理, 5個(gè)生物學(xué)重復(fù), 以1/2濃度的霍格蘭(Hoagland)完全營養(yǎng)液為對照(約1 mmol L–1SO42–), 以無硫酸根的霍格蘭營養(yǎng)液為缺硫處理, 即用MgCl2、ZnCl2、CuCl2分別代替1/2濃度霍格蘭完全營養(yǎng)液中的MgSO4、ZnSO4·7H2O、CuSO4·5H2O, 2種營養(yǎng)液的具體配方參見陳燕寧等[9]。經(jīng)過精心挑選的大豆種子播種在蛭石中育苗, 4 d后移苗至水培箱中培養(yǎng)4 d, 此時(shí)第1對真葉完全展開, 去掉子葉進(jìn)行低硫誘導(dǎo)處理, 營養(yǎng)液每2 d更換1次, 處理10 d后測量表型。用葉綠素儀(Soil and Plant Analyzer Development 502)測量倒一位完全展開葉的葉綠素含量(SPAD值), 測量子葉節(jié)到莖頂點(diǎn)的距離記為株高, 測量子葉節(jié)到根尖的距離記為根長。從子葉節(jié)把植株截?cái)喾譃榈厣喜亢偷叵虏?根), 分別稱量地上部和地下部(根)的鮮重(g), 然后裝入牛皮紙袋中, 放入預(yù)熱好的烘箱內(nèi)105℃殺青30 min, 75℃烘干至恒重, 稱量得到地上部干重(g)和地下部(根)干重(g)。

采用同樣方法處理云夢六月花葉和沁陽大豆10 d, 處理結(jié)束后根和葉分別取樣, 3個(gè)生物學(xué)重復(fù), 共24個(gè)樣品。樣品置于液氮中速凍, 用于后續(xù)RNA重測序、總RNA提取和cDNA反轉(zhuǎn)錄。

1.2 總RNA提取、cDNA反轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR

根據(jù)美國英杰生命技術(shù)有限公司的TRIzol RNA分離試劑盒說明書提取大豆根和葉的總RNA。利用南京諾唯贊生物科技股份有限公司的兩步法RT-PCR試劑盒(HiScript II Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA eraser))反轉(zhuǎn)錄cDNA。(GenBank登錄號為AY907703)作為內(nèi)參基因。參照ChamQ SYBR qPCR Master Mix (Low ROX Premixed) (諾唯贊)試劑盒說明書, 配制qRT-PCR反應(yīng)體系, 反應(yīng)過程在ABI 7500 實(shí)時(shí)定量PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems, 美國)中進(jìn)行。用2–ΔΔCT方法計(jì)算基因的相對表達(dá)量[10]。采用T測驗(yàn)進(jìn)行基因表達(dá)量的顯著性分析。利用Primer- Premier 5軟件(Premier Biosoft Interpairs,美國)設(shè)計(jì)所有引物, 由北京擎科生物科技有限公司合成, 引物序列見表1。

表1 引物序列

1.3 RNA重測序和數(shù)據(jù)分析

由北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司完成樣本RNA的重測序和組裝, 以大豆Williams 82 (Wm82.a2.v1)基因組序列為參考。StringTie軟件用于基因表達(dá)水平的定量和標(biāo)準(zhǔn)化, 標(biāo)準(zhǔn)化方法采用FPKM法(fragments per kilobases per million mapped reads)[11]。基因FPKM值為0時(shí)認(rèn)為該基因沒有被檢測到。DESeq2軟件包用于分析差異表達(dá)基因, 以不同硫水平下基因表達(dá)量改變倍數(shù)的超過2或小于0.5 (對數(shù)(log2)轉(zhuǎn)換值超過1或小于–1), 且值小于0.05的基因被認(rèn)定為差異表達(dá)基因(differentially expressed gene, DEG)。

利用NCBI數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih. gov/)、GO數(shù)據(jù)庫(http://www.geneontology.org/)和KEGG數(shù)據(jù)庫(https://www.kegg.jp/)對基因功能進(jìn)行注釋。利用在線軟件KOBAS 3.0 (http://kobas.cbi. pku.edu.cn/index.php)對差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG富集分析[12]。KEGG富集分析的參考基因組為大豆, 以矯正值(FDR值)小于0.05為顯著富集。

MEGA 6.0 用于構(gòu)建基因家族的聚類樹[13], 在線軟件Morpheus (https://software.broadinstitute.org/ morpheus/)繪制基因表達(dá)的熱圖, R軟件的ggplot2數(shù)據(jù)包繪制KEGG途徑熱圖。

1.4 GmEIL1基因的克隆與組織表達(dá)分析

以的mRNA序列為模板, 設(shè)計(jì)特異引物(表1), 利用PCR反應(yīng)從大豆根的cDNA中克隆基因。取自然條件下種植的云夢六月花葉的根、莖、葉、花、莢和種子, 液氮速凍, 提取總RNA, 反轉(zhuǎn)錄cDNA, 利用qRT-PCR分析基因在不同組織中的表達(dá)水平。總RNA提取、cDNA反轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR分析同1.2。

1.5 GmEIL1基因轉(zhuǎn)化毛狀根創(chuàng)制與硫酸根含量測定

根據(jù)南京諾唯贊生物科技股份有限公司的ClonExpress一步法克隆試劑盒說明書把全長cDNA連入表達(dá)載體pMDC83, 構(gòu)建基因過表達(dá)重組載體OE-GmEIL1。設(shè)計(jì)引物克隆編碼區(qū)620 bp片段, 利用Gateway技術(shù)將該片段連入RNA干擾載體pB7GWIWG2 (II), 構(gòu)建基因RNA干擾重組載體Ri-GmEIL1。構(gòu)建過表達(dá)重組載體和RNA干擾重組載體的引物見表1?？蛰dpMDC83 (OE-EV)和pB7GWIWG2 (II) (Ri-EV)分別作為過表達(dá)和RNA干擾的對照。4個(gè)載體通過凍融法分別轉(zhuǎn)入發(fā)根農(nóng)桿菌K599菌株[14], 根據(jù)Kereszt等[15]描述的方法侵染大豆Jack子葉節(jié)誘發(fā)毛狀根。當(dāng)毛狀根長到5～10 cm時(shí), 從靠近毛狀根誘發(fā)處下端剪掉幼苗的根, 得到大豆嵌合體。

將嵌合體轉(zhuǎn)入完全營養(yǎng)液中適應(yīng)培養(yǎng)3 d, 再分別轉(zhuǎn)入低硫和對照營養(yǎng)液中處理, 營養(yǎng)液配方、處理方法、生長環(huán)境同1.1。處理結(jié)束后取樣, 從子葉節(jié)把大豆嵌合體的地上部和根分開, 少量的毛狀根用于總RNA的提取、cDNA反轉(zhuǎn)錄(同1.2)及qRT- PCR分析(同1.3), 驗(yàn)證陽性毛狀根。其余樣品烘干研磨成粉, 稱取0.1 g轉(zhuǎn)移到消煮管中, 加入5 mL HNO3, 在微波消解系統(tǒng)(Milestone Ethos)中150℃消煮30 min, 取出后冷卻到50℃以下開蓋, 用超純水定容至50 mL, 然后用等離子體發(fā)射光譜儀(Perkin Elmer Optima 2100DV ICP-OES system)測定樣品中的硫酸根含量(mg g–1)。

2 結(jié)果與分析

2.1 在不同硫水平條件下評價(jià)大豆對低硫的耐性

利用室內(nèi)水培試驗(yàn)鑒定云夢六月花葉和沁陽大豆2個(gè)大豆地方品種對低硫的表現(xiàn)發(fā)現(xiàn), 云夢六月花葉對低硫處理表現(xiàn)為耐性, 沁陽大豆對低硫處理表現(xiàn)為敏感(圖1-A)。在低硫條件下, 2個(gè)材料的葉綠素含量和地上部鮮重都比對照條件下顯著降低。在其他性狀上2個(gè)材料對低硫的反應(yīng)不同, 與對照相比, 沁陽大豆根長顯著增加, 根鮮重、地上部鮮重、根干重顯著降低, 而云夢六月花葉在這些性狀上與對照相比沒有顯著差異(圖1-B)。

圖1 云夢六月花葉和沁陽大豆的低硫表型鑒定

+S和-S分別表示對照和缺硫處理。YM: 云夢六月花葉; QY: 沁陽大豆; *、**、***分別表示在0.05、0.01、0.001水平顯著差異。

+S and-S represent the treatments of control and low sulfate, respectively. YM: Yunmengliuyuehuaye; QY: Qinyangdadou. *, **, and *** mean significant difference at the 0.05, 0.01, and 0.001 probability levels, respectively.

2.2 大豆響應(yīng)低硫的差異表達(dá)基因

采集低硫和對照處理的云夢六月花葉和沁陽大豆的葉和根, 3個(gè)生物學(xué)重復(fù), 構(gòu)建24個(gè)轉(zhuǎn)錄組重測序文庫, 進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析。測序數(shù)據(jù)經(jīng)過質(zhì)控過濾, 每個(gè)文庫包含約3.2億個(gè)高質(zhì)量片段(clean read), 測序片段在參考基因組上的平均圖譜定位率超過90%, 每個(gè)文庫鑒定的基因數(shù)超過40,000個(gè), 除個(gè)別樣本外, 同一樣本的3個(gè)生物學(xué)重復(fù)間基因表達(dá)量的相關(guān)性超過90%。用qRT-PCR方法對其中21個(gè)差異表達(dá)基因的表達(dá)量進(jìn)行分析, 結(jié)果與表達(dá)譜數(shù)據(jù)高度一致(附圖1)。這些結(jié)果說明該轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)質(zhì)量較高。

轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn), 2個(gè)材料葉中比根中鑒定到更多的差異表達(dá)基因。在云夢六月花葉和沁陽大豆的葉中分別鑒定到9064個(gè)和9795個(gè)差異表達(dá)基因, 根中分別鑒定到3185個(gè)和5006個(gè)差異表達(dá)基因(圖2)。盡管2個(gè)材料葉中差異表達(dá)基因數(shù)目接近, 但在上調(diào)和下調(diào)基因的數(shù)目上差別較大, 低硫敏感材料沁陽大豆葉中上調(diào)和下調(diào)基因的數(shù)目接近, 而低硫耐性材料云夢六月花葉的葉中上調(diào)表達(dá)的基因數(shù)目(3097個(gè))遠(yuǎn)低于下調(diào)表達(dá)的基因數(shù)(5968個(gè)), 也低于沁陽大豆葉中上調(diào)表達(dá)的基因數(shù)目(5175個(gè))。2個(gè)材料根中上調(diào)基因的數(shù)目都超過了下調(diào)基因的數(shù)目, 但與沁陽大豆相比, 云夢六月花葉的根中上調(diào)和下調(diào)基因的數(shù)目都較少。

圖2 云夢六月花葉和沁陽大豆的葉和根中的差異表達(dá)基因數(shù)

L和R分別表示葉和根。YM: 云夢六月花葉; QY: 沁陽大豆。

L and R represent leaves and roots, respectively. YM: Yunmengliuyuehuaye; QY: Qinyangdadou.

2.3 低硫重塑大豆的代謝網(wǎng)絡(luò)

KEGG富集分析顯示, 在云夢六月花葉的葉和根中分別富集到22個(gè)和23個(gè)途徑(圖3-A, B), 在沁陽大豆的葉和根中分別富集到18個(gè)和26個(gè)途徑(圖3-C, D), 2個(gè)材料葉中共同富集了9個(gè)途徑(圖3-A, C), 根中共同富集了18個(gè)途徑(圖3-B, D)。

在9個(gè)葉共同富集途徑中, 3個(gè)途徑與光合相關(guān), 分別是光合作用途徑(photosynthesis)、光合作用-外周捕光(天線)色素蛋白途徑(photosynthesis - antenna proteins)、卟啉-葉綠素代謝途徑(porphyrin and chlorophyll metabolism) (圖3-A, C)。分析各途徑富集基因?qū)Φ土虻捻憫?yīng)發(fā)現(xiàn), 幾乎所有富集在核糖體途徑、光合作用途徑、光合作用-外周捕光(天線)色素蛋白途徑的基因和超過80%的富集在卟啉-葉綠素代謝途徑的基因在低硫條件下都下調(diào)表達(dá)(圖4-A, B)。可見低硫脅迫對大豆光合作用的影響非常嚴(yán)重。除這3個(gè)途徑外, 2個(gè)材料在核糖體途徑(ribosome)、氧化磷酸化途徑(oxidative phosphorylation)、代謝途徑(metabolic pathways)和RNA聚合酶途徑(RNA polymerase pathways)也富集了更多的下調(diào)表達(dá)基因(圖4-A, B)。植物MAPK信號途徑(MAPK signaling pathway-plant)是唯一一個(gè)在2個(gè)材料中富集較多上調(diào)表達(dá)基因的途徑。在次生代謝途徑(biosynthesis of secondary metabolites)中, 2個(gè)材料的差異表達(dá)基因?qū)Φ土虻男?yīng)不同, 耐低硫材料云夢六月花葉富集了更多的下調(diào)表達(dá)基因(74%) (圖4-A), 低硫敏感材料沁陽大豆富集了更多的上調(diào)表達(dá)基因(53%) (圖4-B)。

與葉相比, 根中響應(yīng)的基因數(shù)目雖然較少, 但在2個(gè)材料根中共有的低硫響應(yīng)途徑卻較多(圖3-B, D和圖4-C, D), 其中9個(gè)途徑在2個(gè)材料中對低硫的響應(yīng)一致(圖4-C, D)。脂肪酸降解途徑(fatty acid degradation)、硫代謝途徑(sulfur metabolism)、光合途徑(photosynthesis)、角質(zhì)-木栓質(zhì)-蠟質(zhì)生物合成途徑(cutin, suberine and wax biosynthesis pathways)中富集了更多的上調(diào)差異表達(dá)基因, 而核糖體途徑(ribosome), 丙氨酸-精氨酸-谷氨酸代謝途徑(alanine, aspartate and glutamate metabolism)、氨基酸合成途徑(biosynthesis of amino acids)、糖酵解/糖原生成途徑(glycolysis/gluconeogenesis)、半胱氨酸和甲硫氨酸代謝途徑(cysteine and methionine metabolism pathways)富集了更多的下調(diào)差異表達(dá)基因(圖4-C, D)。其他9個(gè)共有途徑在2個(gè)材料中對低硫的響應(yīng)不同, 耐低硫材料云夢六月花葉在這些途徑中富集了更多的上調(diào)表達(dá)基因(圖4-C), 低硫敏感材料沁陽大豆在這些途徑中富集了更多的下調(diào)表達(dá)基因(圖4-D), 這些途徑包括苯丙烷生物合成途徑(phenylpropanoid biosynthesis)、光合生物的碳固定途徑(carbon fixation in photosynthetic organisms)、次生代謝途徑(biosynthesis of secondary metabolites)、碳代謝途徑(carbon metabolism)、磷酸戊糖途徑(pentose phosphate pathway)、甘氨酸-絲氨酸-蘇氨酸代謝途徑(glycine, serine and threonine metabolism)等(圖4-C, D)。

(圖3)

L和R分別表示葉和根。YM: 云夢六月花葉; QY: 沁陽大豆。

A: L-YM; B: R-YM; C: L-QY; D: R-QY. L and R represent leaves and roots, respectively. YM: Yunmengliuyuehuaye; QY: Qinyangdadou.

(圖4)

富集在該途徑的差異表達(dá)基因數(shù)列在括號內(nèi)。L和R分別表示葉和根。YM: 云夢六月花葉; QY: 沁陽大豆。

The number of DEGs enriched in the pathway is list in bracket. L and R represent leaves and roots, respectively. YM: Yunmengliuyuehuaye; QY: Qinyangdadou.

2.4 不同的大豆硫酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對低硫的響應(yīng)不同

硫酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在植物硫吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)中起到重要作用。利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù), 本研究又分析了硫酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因的表達(dá), 共鑒定到27個(gè)硫酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因, 根據(jù)Ding等[2]報(bào)道, 這些硫酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因分屬4個(gè)亞組, 亞組1和2中分別鑒定到6個(gè)基因, 亞組 3中鑒定到13個(gè)基因, 是4個(gè)亞組中包含基因最多的一個(gè)亞組, 亞組 4中鑒定到2個(gè)(圖5)。從圖5可以看出, 不同亞組的硫酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因?qū)Φ土虻捻憫?yīng)是不同的, 亞組1、2、4中的基因多受低硫誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá), 其中()、()、()、()在根中受到低硫強(qiáng)烈誘導(dǎo)(圖6),()、()、()、()、()在葉中受到低硫強(qiáng)烈誘導(dǎo)(圖5)。亞組3中的基因?qū)Φ土虻捻憫?yīng)和其他3個(gè)亞組差別較大, 更加多變(圖5)。其中有7個(gè)基因僅在一個(gè)材料或一個(gè)組織中響應(yīng)低硫處理, 只有基因()在2個(gè)材料根和葉中都上調(diào)表達(dá),其余5個(gè)基因沒有響應(yīng)低硫處理, 而且該亞組幾乎包括了所有受低硫抑制的硫酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因。

進(jìn)一步分析27個(gè)硫酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因在兩個(gè)材料間的差異表達(dá)發(fā)現(xiàn), 12個(gè)基因表達(dá)量在2個(gè)材料的根或葉中存在差異, 其中一半來自亞組3 (附表1)。多數(shù)根中差異表達(dá)基因在耐性材料云夢六月花葉中的表達(dá)量低于其在低硫敏感材料沁陽大豆中的表達(dá)量,而葉中差異表達(dá)基因的表現(xiàn)與根中相反, 在云夢六月花葉中的表達(dá)量都高于在沁陽大豆中的表達(dá)量(附表1)。

2.5 GmEIL1基因參與調(diào)控大豆硫代謝

由KEGG富集分析發(fā)現(xiàn), 植物MAPK信號途徑是2個(gè)材料葉中唯一一個(gè)包含較多上調(diào)基因的途徑(圖4-A, B), 富集在該途徑的30%的差異表達(dá)基因?qū)儆谝蚁┬盘柾緩?云夢六月花葉: 21/70; 沁陽大豆: 24/86), 其中包括乙烯鈍感蛋白EIN3/EIL基因(圖6)。該基因家族較小, 大豆中有12個(gè)成員, 5個(gè)響應(yīng)低硫處理, 其中高度同源的基因和受低硫強(qiáng)烈誘導(dǎo)(圖6-B), 2個(gè)基因預(yù)測蛋白與煙草NtEIL2和擬南芥AtEIL1聚在一個(gè)分支(圖6-A)。qRT-PCR結(jié)果進(jìn)一步確認(rèn)和受低硫的誘導(dǎo)(附圖1)。本研究選擇了基因繼續(xù)進(jìn)行功能研究, 將其命名為。

組織分析表明,基因在大豆葉中的表達(dá)量最高, 在莖中的表達(dá)量最低, 在根、花和莢中的表達(dá)量相近(圖7)。從云夢六月花葉的根cDNA中克隆了基因, 其編碼區(qū)全長1866 bp, 編碼621個(gè)氨基酸, 假定蛋白序列含有EIN3保守結(jié)構(gòu)域。

圖5 硫酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)譜

數(shù)值為對照和處理間差異表達(dá)基因改變倍數(shù)的對數(shù)(log2)轉(zhuǎn)換值, 灰色空格表示沒有顯著差異。L和R分別表示葉和根。YM: 云夢六月花葉; QY: 沁陽大豆。

The number shows the log2-transformed fold change value of DEGs between the control and low-sulfur treatments. The gray blank represents no significant. L and R represent leaves and roots, respectively. YM: Yunmengliuyuehuaye; QY: Qinyangdadou.

圖6 EILs蛋白序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(A)與大豆EIL基因的表達(dá)熱圖(B)

數(shù)字為對照和處理間差異表達(dá)基因改變倍數(shù)的對數(shù)(log2)轉(zhuǎn)換值, 灰色空格表示沒有顯著差異。L和R分別表示葉和根。YM: 云夢六月花葉; QY: 沁陽大豆。

The number shows the log2-transformed fold change value of DEGs between the control and low-sulfur treatments. The gray blank represents no significant. L and R represent leaves and roots, respectively. YM: Yunmengliuyuehuaye; QY: Qinyangdadou.

構(gòu)建基因過表達(dá)和干擾載體, 通過遺傳轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)基因毛狀根大豆嵌合體。與各自的對照(OE-EV, RI-EV)相比, 基因在過表達(dá)毛根(OE- GmEIL1)中上調(diào)表達(dá), 在干擾毛根(RI-GmEIL1)中下調(diào)表達(dá)(圖8-A)。本研究測定了4個(gè)轉(zhuǎn)化嵌合體株系地上部和毛根中硫酸根含量。結(jié)果表明, 基因過表達(dá)嵌合體地上部硫酸根含量在不同硫水平下與空載對照都沒有顯著差異, 基因RNA干擾嵌合體地上部的硫酸根含量在低硫條件下顯著低于空載對照, 在正常硫水平下與空載對照沒有顯著差異(圖8-B)。說明根中過表達(dá)基因?qū)Φ厣喜苛蛩岣繘]有影響, 但在低硫條件下降低根中該基因的表達(dá), 地上部硫酸根含量也降低(圖8-B)。過表達(dá)嵌合體毛根中硫酸根含量在正常硫水平下顯著高于對照, 在低硫條件下與對照沒有顯著差異, 干擾嵌合體毛根中硫酸根含量在2種硫水平下都顯著低于對照。說明在硫充足水平下, 根中過表達(dá)基因能增加毛根中硫酸根的含量, 在硫充足和缺失條件下, 毛根中的硫酸根含量都隨基因表達(dá)量的降低而顯著降低(圖8-C)。說明,基因參與調(diào)控大豆的硫代謝, 且對硫饑餓條件下大豆植株內(nèi)硫酸根的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)是必不可少的。

在乙烯信號途徑中,位于/的下游。在轉(zhuǎn)錄組中有5個(gè)ERF1基因被低硫脅迫強(qiáng)烈誘導(dǎo), 本研究進(jìn)一步檢測了這些基因在大豆轉(zhuǎn)基因毛根中的表達(dá)。5個(gè)基因中只有基因在低硫條件下的干擾毛根中下調(diào)表達(dá)(圖8-D)。說明基因()可能在介導(dǎo)的大豆硫饑餓反應(yīng)中發(fā)揮作用。

3 討論

本研究對2個(gè)低硫表現(xiàn)不同的大豆材料進(jìn)行了不同硫水平間的差異轉(zhuǎn)錄組分析, 鑒定到大量響應(yīng)低硫的基因(圖2), 與根相比, 2個(gè)材料葉中響應(yīng)的基因更多, 共同富集9個(gè)KEGG途徑, 3個(gè)途徑與光合作用相關(guān), 根中對低硫響應(yīng)的差異表達(dá)基因雖然較少, 但富集到更多共有KEGG途徑(圖3和圖4), 涉及光合作用相關(guān)、硫代謝相關(guān)、碳代謝相關(guān)、氨基酸代謝相關(guān)、脂肪酸代謝相關(guān)等途徑。根和葉共同富集到4個(gè)途徑, 分別是光合作用途徑、核糖體途徑、次生代謝途徑和代謝途徑, 其中光合作用途徑的基因在根和葉中的表現(xiàn)差別較大, 在葉中大部分差異表達(dá)基因在為下調(diào)表達(dá), 而根中的差異表達(dá)基因多為上調(diào)表達(dá)(圖4)。同樣, 低硫處理的擬南芥在葉中響應(yīng)的基因比根中更多, 涉及硫代謝、碳代謝和光合作用相關(guān)的基因[16]?？梢? 硫元素對植物的生長發(fā)育是非常重要的, 缺硫重塑了植物的代謝網(wǎng)絡(luò), 而且植物葉和根對低硫響應(yīng)的遺傳基礎(chǔ)是不同的。

圖7 GmNIL1的組織表達(dá)

圖8 大豆轉(zhuǎn)基因嵌合體中GmEIL1基因表達(dá)量(A)、地上部和毛根中硫酸根含量(B和C)和ERF1(Glyma.13G123100)基因的表達(dá)量(D)

+S: 對照;-S: 缺硫。OE-EV、OE-EIL1、RI-EV、RI-EIL1分別表示轉(zhuǎn)過表達(dá)空載、基因過表達(dá)、干擾空載、基因干擾的轉(zhuǎn)基因嵌合體。*、**、***分別表示在0.05、0.01、0.001水平顯著差異。

+S: control;-S: low sulfate. OE-EV, OE-EIL1, RI-EV, and RI-EIL1 stand fortransgenic soybean chimera containing gene expression empty vector of gene expression,gene overexpression vector, empty vector of RNAi, andgene RNAi vector, respectively. *, **, and *** mean significant difference at the 0.05, 0.01, and 0.001 probability levels, respectively.

光合作用途徑和核糖體途徑是2個(gè)材料根和葉共有的途徑, 包含較多差異表達(dá)基因(圖4和圖5)。核糖體途徑的差異表達(dá)基因編碼核糖體大、小亞基。在其他植物上, 核糖體基因不僅參與蛋白質(zhì)的合成, 而且在植物生長發(fā)育、應(yīng)答非生物脅迫、營養(yǎng)平衡等方面都發(fā)揮作用[17-21]。本課題組已報(bào)道過大豆核糖體大亞基編碼基因參與調(diào)控大豆的硫利用, 在低硫環(huán)境下促進(jìn)大豆對硫元素的吸收, 增加大豆地上部和地下部的干物質(zhì)積累[9]。在本研究中該基因響應(yīng)低硫處理(結(jié)果未給出), 這也暗示了其他響應(yīng)低硫處理的核糖體基因可能在大豆硫元素利用中發(fā)揮作用, 值得進(jìn)一步研究。光合作用途徑的差異表達(dá)基因編碼光系統(tǒng)I (PSI)、II (PSII)的蛋白、細(xì)胞色素b6/f復(fù)合體亞基、光合作用電子傳遞過程的蛋白、ATP酶等。與核糖體編碼亞基基因一樣, 光合作用途徑基因在多種植物中也參與非生物脅迫的調(diào)控, 比如在馬鈴薯中, PSII外周蛋白PsbO基因突變體對非生物脅迫表現(xiàn)出較高的耐性, 在高鹽、重金屬、干旱環(huán)境下, 突變體的葉綠素含量、株高、葉片數(shù)目、塊莖產(chǎn)量均高于對照, 突變體內(nèi)H2O2積累較少, 活性氧清除酶的活性增強(qiáng)[22]。在甘薯中, PSII外周蛋白IbPsbP受非生物脅迫誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá), 與調(diào)控環(huán)境脅迫蛋白IbOr (Ipomoea batatas Orange protein)互作, 保護(hù)其不被熱脅迫變性[23]。在擬南芥中, NADPH脫氫酶調(diào)控植物對生物脅迫和非生物脅迫的防御, 而植株體內(nèi)NADPH脫氫酶的水平依賴于PSII外周蛋白PQL (PsbQ-like proteins, PQL)基因的正常表達(dá)[24]。本研究中這些響應(yīng)低硫處理的光合作用途徑基因有可能和其他植物中的基因一樣參與調(diào)控大豆對非生物脅迫的反應(yīng), 特別是對低硫的脅迫反應(yīng), 可以作為候選基因進(jìn)一步研究。

植物MAPK信號途徑是2個(gè)材料葉中唯一一個(gè)包含較多上調(diào)表達(dá)基因的共有途徑(圖4-A, B), 該途徑在植物應(yīng)答各種脅迫中有重要作用, 其中EIN3/EIL是一個(gè)較小的乙烯鈍感轉(zhuǎn)錄因子家族, 在多種植物中都有鑒定。擬南芥中有6個(gè)成員, 其中和在硫酸根吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮作用, 參與調(diào)控硫饑餓反應(yīng),不受低硫誘導(dǎo), 但突變體喪失硫饑餓反應(yīng)[25-26]。煙草中有5個(gè)成員, 其中在硫饑餓條件下激活硫饑餓響應(yīng)基因的表達(dá)[27]。本研究從大豆轉(zhuǎn)錄組中鑒定到12個(gè)EIL基因, 對基因進(jìn)行功能研究發(fā)現(xiàn),基因?qū)α蝠囸I條件下大豆硫代謝調(diào)控是必須的(圖8), 該基因可作為候選基因進(jìn)行育種利用研究。除基因外, 還有4個(gè)大豆基因響應(yīng)低硫處理,與擬南芥同源,與擬南芥、、及煙草同源(圖6), 此外, 植物MAPK信號途徑中還有很多響應(yīng)低硫誘導(dǎo)的基因(圖4), 這些基因有可能和基因一樣在大豆應(yīng)答低硫脅迫反應(yīng)中發(fā)揮作用, 有待作為候選基因進(jìn)行深入研究。

植物硫酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對于硫酸根的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)非常重要, 到目前為止對大豆硫酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的研究十分有限。本研究利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析了27個(gè)硫酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因低硫響應(yīng)的表達(dá)譜, 亞組1、2、4的基因多受低硫誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)(圖5), 其中基因已進(jìn)行功能研究, 該基因在根中強(qiáng)烈響應(yīng)低硫誘導(dǎo), 在煙草中過量表達(dá)可以提高不同硫水平下轉(zhuǎn)基因植株的生物量、硫酸根吸收、硫元素含量等[2]。除基因外,、、、在根中同樣受到低硫的強(qiáng)烈誘導(dǎo), 上調(diào)水平都高于基因(圖5), 這些基因可能在大豆硫酸根吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮作用, 可以作為候選基因進(jìn)一步研究其功能和利用潛力。在4個(gè)亞組中, 亞組3包含的硫酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因最多, 但該組基因?qū)Φ土蝽憫?yīng)與其他亞組基因不同, 僅有少數(shù)基因受低硫誘導(dǎo), 多數(shù)基因受低硫抑制或者沒有響應(yīng)低硫處理(圖5)。大豆亞組3基因的功能研究未見報(bào)道, 但其他植物上該亞組基因功能研究的報(bào)道較多。擬南芥的在發(fā)育的種子中尤其是胚的周圍表達(dá), 可能與硫酸根向胚中轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)[28],基因定位在葉綠體中, 負(fù)責(zé)把硫酸根運(yùn)輸?shù)饺~綠體[29],增強(qiáng)從土壤中吸收硫酸鹽的功能,基因發(fā)生突變會(huì)限制低硫條件下硫酸鹽從根部向地上部的運(yùn)輸[30]。水稻中的表達(dá)與硫饑餓條件下總硫含量負(fù)相關(guān)[31],無論在缺硫還在硫充足的環(huán)境下都與植株的硫元素含量無關(guān), 而是作為關(guān)鍵基因控制磷的吸收[32]。這些結(jié)果都說明亞組3基因的功能復(fù)雜, 在大豆中該亞組的基因是否參與以及如何參與硫酸根運(yùn)輸與再分配有待研究。

4 結(jié)論

本研究通過RNA重測序技術(shù)分析2個(gè)大豆材料不同水平下的轉(zhuǎn)錄組發(fā)現(xiàn), 大豆根和葉對低硫的響應(yīng)不同, 葉中鑒定到更多的低硫響應(yīng)基因, 而根中富集到更多的KEGG途徑。KEGG富集分析發(fā)現(xiàn), 缺硫重塑了大豆多個(gè)代謝途徑, 包括硫代謝相關(guān)、氨基酸代謝相關(guān)、光合作用相關(guān)、碳代謝相關(guān)、脂肪酸代謝相關(guān)等途徑。對27個(gè)大豆硫酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn), 亞組1、2、4的基因多受低硫誘導(dǎo), 亞組3的基因?qū)Φ土虻捻憫?yīng)多變。通過轉(zhuǎn)化大豆毛狀根證明低硫誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)基因參與大豆硫利用的調(diào)控。總之, 本研究揭示了全基因組水平上大豆應(yīng)答低硫脅迫的轉(zhuǎn)錄組, 發(fā)掘大量的硫利用候選基因, 初步證明基因參與大豆硫利用的調(diào)控, 為深入探索大豆硫利用效率的遺傳機(jī)理奠定基礎(chǔ), 為大豆耐低硫育種提供了候選基因。

附圖1 21個(gè)差異表達(dá)基因的qRT-PCR與轉(zhuǎn)錄組重測序結(jié)果

Fig. S1 qRT-PCR and RNA-seq results of 21 DEGs

log2(FC): YM和QY間差異表達(dá)基因改變倍數(shù)的對數(shù)(log2)轉(zhuǎn)換值。L和R分別表示葉和根。YM: 云夢六月花葉; QY: 沁陽大豆。

log2(FC): log2-transformed fold change value of DEGs between the control and low-sulfur treatments. L and R represent leaves and roots, respectively. YM: Yunmengliuyuehuaye; QY: Qinyangdadou.

附表1 2個(gè)大豆材料間差異表達(dá)的硫酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因

數(shù)值表示YM和QY間差異表達(dá)基因改變倍數(shù)的對數(shù)(log2)轉(zhuǎn)換值, 正、負(fù)值分別代表上調(diào)和下調(diào)?！? 沒有差異。L和R分別表示葉和根。YM: 云夢六月花葉; QY: 沁陽大豆。

The numbers show the log2-transformed fold change value of DEGs between YM and QY. The positive and negative values represent up and down, respectively. —: no different. L and R represent leaves and roots. YM: Yunmengliuyuehuaye; QY: Qinyangdadou.

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Transcriptional expression profiling of soybean genes under sulfur-starved conditions by RNA-seq

WANG Hui, WU Zhi-Yi, ZHANG Yu-E, and YU De-Yue*

National Center for Soybean Improvement / National Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement / Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Soybean, Ministry of Agriculture and Rural Affairs / Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, Jiangsu, China

Soybean is an important grain and oil crop. Few researches focused on soybean sulfur utilization. Here, the tolerance of Yunmengliuyuehuaye (YM) and Qinyangdadou (QY) to low sulfur were evaluated. The gene expression profiles of roots and leaves of the two materials under the control (+S) and sulfur deficiency (-S) environments were analyzedRNA resequencing. The results showed that YM was tolerance to low sulfur and QY was susceptibility to low sulfur. 9064 and 9795 differentially expressed genes (DEGs) were identified in leaves of YM and QY, and 3185 and 5006 DEGs were identified in roots of YM and QY, respectively. KEGG enrichment revealed that nine pathways were common in the two material leaves, of which MAPK signaling pathway—plant specially enriched more upregulated expressed genes. There were 18 common pathways in both roots. Nine of them responded consistently to low sulfur in YM and QY, of which four contained more up-regulated genes and five contained more downregulated genes. In the remaining nine pathways, YM contained more upregulated expressed genes.Soybean sulfate transporter genes were important for the absorption and transportation of sulfate. In the transcriptome, 27 soybean sulfate transporter genes were identified. These genes belonged to 4 subgroups respectively. Most of the genes in subgroups 1, 2, and 4 were induced by low sulfur, and the genes in subgroup 3 responded to low sulfur in a complex way. KEGG showed that the upregulated gene of(ethylene-insensitive 3-like) in the MAPK signaling pathway-plant was clone. The gene was involved in the regulation of soybean sulfur utilization in the soybean chimeras with transgenic hairy root. These results provide a basis for deeply exploring the genetic mechanism of soybean sulfur utilization efficiency and candidate genes for soybean tolerance to low sulfate breeding in the future.

soybean; low sulfur; RNA-seq; sulfate transporter; EIN3/EIL

10.3724/SP.J.1006.2023.24004

本研究由國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(32072080)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (32072080).

通信作者(Corresponding author):喻德躍, E-mail: dyyu@njau.edu.cn

E-mail: wanghui0@njau.edu.cn

2022-01-04;

2022-03-25;

(網(wǎng)絡(luò)出版日期): 2022-04-20.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20220418.1423.016.html