楊元英

(廣西大學(xué)，南寧 530004)

牡蠣含有豐富的蛋白質(zhì)和微量元素，具有降血壓、抑菌、抗氧化等作用，以牡蠣為原材料進行深加工，制取生物活性肽成為當(dāng)前牡蠣深加工的重要方式[1-2]。牡蠣多肽一般采用酶水解的方式，過程中影響因素較多，因此對牡蠣多肽提取工藝進行優(yōu)化分析成為提高多肽提取率的重要措施[3-4]。本文通過酶水解的方式，對牡蠣多肽提取率影響因素進行綜合分析，確定最佳提取工藝條件，并對牡蠣多肽的抗氧化活性進行研究，為牡蠣的深加工提供借鑒。

1 樣品制備與實驗測定方法

將新鮮牡蠣肉瀝干處理后稱取200 g，加入5 000 mL蒸餾水，使用勻漿機對其進行攪拌處理，放置于50 ℃條件下進行振蕩搖勻，混合均勻后在90 ℃條件下進行水浴，水浴時間10 min，水浴完成后在5 000 r/min條件下進行離心處理，離心時間10 min，離心完成后收集上清液[5]。將收集好的牡蠣上清液進行超濾處理，使用1 000 Da的超濾膜進行過濾，收集牡蠣上清液過濾液，此時收集到的牡蠣多肽過濾液分子量小于1 000 Da；將超濾膜更換為360 Da，對收集到的過濾液再次進行過濾，此時收集到的牡蠣多肽過濾液分子量大于360 Da，小于1 000 Da。收集兩次過濾后的濾渣，放置于500 mL圓底蒸發(fā)瓶中，在40 ℃條件下進行干燥處理，獲取牡蠣淡黃色多肽粉末[6]。

2 牡蠣多肽提取工藝優(yōu)化分析

為了測定牡蠣多肽提取過程中加酶量對多肽酶水解度的影響，設(shè)定牡蠣肉混合溶液料液比為1∶3，設(shè)定酶解反應(yīng)時間為5 h，酶解反應(yīng)溫度為50 ℃，酶解反應(yīng)溶液pH值為7.5，酶的添加量分別設(shè)定為1%、2%、3%、4%、5%，酶解完成后測定牡蠣多肽酶水解度[7]。加酶量對牡蠣多肽酶水解度的影響見表1。

表1 加酶量對牡蠣多肽酶水解度的影響Table 1 Effect of enzyme addition amount on enzymatic hydrolysis degree of oyster polypeptides %

由表1可知，當(dāng)牡蠣肉混合溶液料液比一定時，隨著加酶量的升高，酶與牡蠣多肽分子的接觸機會增加，同一時間內(nèi)的牡蠣多肽分子水解數(shù)量增加，因此牡蠣多肽酶水解度不斷升高，當(dāng)加酶量高于3%時，牡蠣多肽酶水解度未發(fā)生明顯變化，主要原因是隨著加酶量的升高，牡蠣肉混合溶液中多肽分子已經(jīng)被酶充分水解，因此加酶量對牡蠣多肽酶水解度不會再帶來較大的影響。利用酶解法進行牡蠣多肽水解提取時，最佳加酶量為3%，此時牡蠣多肽酶水解度最大。

為了測定牡蠣多肽提取過程中酶解時間對多肽酶水解度的影響，設(shè)定牡蠣肉混合溶液料液比為1∶3，加酶量為3%，酶解反應(yīng)溫度為50 ℃，酶解反應(yīng)溶液pH值為7.5，酶解時間分別設(shè)定為3，4，5，6，7 h，酶解完后測定牡蠣多肽酶水解度[8]。酶解時間對牡蠣多肽酶水解度的影響見表2。

表2 時間對牡蠣多肽酶水解度的影響Table 2 Effect of time on enzymatic hydrolysis degree of oyster polypeptides

由表2可知，在前5 h的水解過程中，牡蠣多肽酶水解度快速上升，當(dāng)超過5 h后，牡蠣多肽酶水解度上升緩慢，主要原因是酶解反應(yīng)進行一段時間后，牡蠣肉混合溶液中多肽分子不斷減少，此時酶活力也開始下降，因此牡蠣多肽酶水解度趨于平緩狀態(tài)。利用酶解法進行牡蠣多肽水解提取時，最佳酶解時間為5 h，此時牡蠣多肽酶水解度最大。

為了測定牡蠣多肽提取過程中溶液料液比對多肽酶水解度的影響，設(shè)定酶解時間為5 h，加酶量為3%，酶解反應(yīng)溫度為50 ℃，酶解反應(yīng)溶液pH值為7.5，牡蠣肉混合溶液料液比為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5，酶解完后測定牡蠣多肽酶水解度[9]。牡蠣肉混合溶液料液比對牡蠣多肽酶水解度的影響見表3。

表3 料液比對牡蠣多肽酶水解度的影響Table 3 Effect of solid-liquid ratio on the enzymatic hydrolysis degree of oyster polypeptides

由表3可知，當(dāng)料液比大于1∶2時，隨著料液比的降低，牡蠣多肽酶水解度快速升高，當(dāng)料液比小于1∶2時，隨著料液比的降低，牡蠣多肽酶水解度快速降低，主要原因是隨著料液比的降低，酶解反應(yīng)物濃度降低，酶解產(chǎn)物濃度降低，因此酶活力的抑制作用降低，促進酶解反應(yīng)速度提升，隨著料液比的進一步降低，反應(yīng)物中的水分含量增加，酶與反應(yīng)物的接觸面積降低，同時酶活力開始降低。利用酶解法進行牡蠣多肽水解提取時，最佳料液比為1∶2，此時牡蠣多肽酶水解度最大。

為了測定牡蠣多肽提取過程中酶解反應(yīng)溫度對多肽酶水解度的影響，設(shè)定酶解時間為5 h，加酶量為3%，酶解反應(yīng)溶液pH值為7.5，牡蠣肉混合溶液料液比為1∶3，酶解反應(yīng)溫度為40，45，50，55，60 ℃，酶解完后測定牡蠣多肽酶水解度[10]。酶解反應(yīng)溫度對牡蠣多肽酶水解度的影響見表4。

表4 溫度對牡蠣多肽酶水解度的影響Table 4 Effect of temperature on enzymatic hydrolysis degree of oyster polypeptides

由表4可知，當(dāng)酶解反應(yīng)溫度低于50 ℃時，隨著溫度的上升，牡蠣多肽酶水解度逐漸上升，主要原因是隨著溫度的上升，反應(yīng)物的內(nèi)能不斷增加，酶與牡蠣多肽分子接觸機會增加，酶解反應(yīng)速度也不斷上升。酶是一種具有活性的蛋白類物質(zhì)，當(dāng)溫度超過一定的閾值時，酶的部分催化活性逐漸降低，酶活力也開始減弱，因此當(dāng)溫度高于50 ℃時，牡蠣多肽酶水解度開始降低。利用酶解法進行牡蠣多肽水解提取時，最佳酶解溫度為50 ℃，此時牡蠣多肽酶水解度最大。

為了測定牡蠣多肽提取過程中溶液pH對多肽酶水解度的影響，設(shè)定酶解時間為5 h，加酶量為3%，酶解反應(yīng)溫度為50 ℃，牡蠣肉混合溶液料液比為1∶3，酶解反應(yīng)溶液pH值為6.5，7，7.5，8，8.5，酶解完后測定牡蠣多肽酶水解度[11]。牡蠣肉混合溶液pH對牡蠣多肽酶水解度的影響見表5。

表5 pH對牡蠣多肽酶水解度的影響Table 5 Effect of pH on the enzymatic hydrolysis degree of oyster polypeptides

由表5可知，當(dāng)酶解反應(yīng)溶液pH值小于8時，牡蠣多肽酶水解度逐漸上升，主要原因是溶液pH值維持了酶活性的穩(wěn)定性，促進酶與牡蠣多肽分子的結(jié)合，提高酶解反應(yīng)速度。當(dāng)酶解反應(yīng)溶液pH值大于8時，牡蠣多肽酶水解度逐漸下降，主要原因是溶液pH值破壞了酶活性的穩(wěn)定性，酶與牡蠣多肽分子的結(jié)合度降低，催化速度也開始降低。利用酶解法進行牡蠣多肽水解提取時，最佳pH值為8，此時牡蠣多肽酶水解度最大。

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，為保證牡蠣多肽提取過程效率，本文在進行提取工藝優(yōu)化時，設(shè)定加酶量為3%，料液比為1∶2，以酶解反應(yīng)時間(A)、酶解溫度(B)以及pH(C)為自變量，以牡蠣多肽酶水解度為因變量，設(shè)計響應(yīng)面實驗[12]。牡蠣多肽酶水解度響應(yīng)面實驗設(shè)計方案與實驗結(jié)果見表6。

表6 牡蠣多肽酶水解度響應(yīng)面實驗設(shè)計方案與結(jié)果Table 6 Design scheme and results of response surface experiment of enzymatic hydrolysis degree of oyster polypeptides

對牡蠣多肽酶水解度影響因素進行交互作用，得出牡蠣多肽酶水解度響應(yīng)面圖[13]。溫度和時間與牡蠣多肽酶水解度的關(guān)系響應(yīng)面圖見圖1，時間和pH與牡蠣多肽酶水解度的關(guān)系響應(yīng)面圖見圖2，溫度和pH與牡蠣多肽酶水解度的關(guān)系響應(yīng)面圖見圖3。響應(yīng)面的坡度陡峭程度表示影響因素對牡蠣多肽酶水解度交互時是否具有顯著性，坡度平緩表示交互關(guān)系不顯著，坡度陡峭表示交互關(guān)系顯著[14]。

圖1 溫度和時間與牡蠣多肽酶水解度的關(guān)系響應(yīng)面圖Fig.1 Response surface diagrams of relationship between temperature, time and enzymatic hydrolysis degree of oyster polypeptides

由圖1可知，隨著酶解溫度和酶解反應(yīng)時間的增加，牡蠣多肽酶水解度先上升后下降，在酶解反應(yīng)時間4 h和酶解溫度45 ℃的條件下，牡蠣多肽酶水解度達(dá)到最大值49.5%，從響應(yīng)面變化趨勢可以看出酶解反應(yīng)時間和酶解溫度對牡蠣多肽酶水解度交互時均具有顯著性影響。

圖2 時間和pH與牡蠣多肽酶水解度的關(guān)系響應(yīng)面圖Fig.2 Response surface diagrams of relationship between time, pH and enzymatic hydrolysis degree of oyster polypeptides

由圖2可知，酶解反應(yīng)時間與pH對牡蠣多肽酶水解度交互時，酶解反應(yīng)時間比pH對牡蠣多肽酶水解度的影響更加顯著，牡蠣多肽酶水解度隨著時間的變化呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢。

圖3 溫度和pH與牡蠣多肽酶水解度的關(guān)系響應(yīng)面圖Fig.3 Response surface diagrams of relationship between temperature, pH and enzymatic hydrolysis degree of oyster polypeptides

由圖3可知，酶解溫度與pH對牡蠣多肽酶水解度交互時，二者對水解度均不具有顯著性影響。

經(jīng)過牡蠣多肽酶水解度影響因素交互實驗，預(yù)測最佳提取工藝條件為酶解溫度49.29 ℃、酶解反應(yīng)時間4.38 h、pH 8、料液比1∶2、加酶量3%，預(yù)測牡蠣多肽酶水解度可達(dá)50.8%。對牡蠣多肽酶水解工藝條件進行3次實驗驗證，得出牡蠣多肽酶水解度為49.7%～50.2%，與預(yù)測值具有較高的吻合度。將獲取到的牡蠣多肽水解液用1 000 Da過濾膜進行過濾，將濾液用360 Da過濾膜進行過濾，將兩次得到的濾液進行烘干，稱取多肽重量。牡蠣多肽3次驗證實驗結(jié)果見表7。

表7 牡蠣多肽3次驗證實驗結(jié)果Table 7 Results of three validation experiments of oyster polypeptides

由表7可知，使用200 g牡蠣肉水解后，按照優(yōu)化后的工藝條件，提取到的牡蠣多肽平均值為1.28 g，平均提取率為0.64%。

3 牡蠣多肽抗氧化活性分析

牡蠣多肽抗氧化活性可通過牡蠣多肽對鐵離子還原能力和羥基自由基清除率兩個指標(biāo)進行反饋[15]。牡蠣多肽對鐵離子還原能力測定過程中，稱取提取完成的牡蠣多肽0.5 g，加入250 mL蒸餾水定容，混合均勻后，將溶液稀釋至濃度為0.5，1，1.5，2 mg/mL的牡蠣多肽溶液，分別加入濃度為0.1 mol/L的磷酸緩沖溶液1 mL，混合均勻后加入濃度為1%的FeSO4溶液，混合均勻后在50 ℃條件下進行水浴，保溫20 min，冷卻后，在700 nm波長處進行比色對照，測定牡蠣多肽對鐵離子還原能力。牡蠣多肽對鐵離子還原能力測定數(shù)據(jù)見表8。

表8 牡蠣多肽對鐵離子還原能力測定數(shù)據(jù)Table 8 Determination data of reduction ability of oyster polypeptides to iron ion

由表8可知，隨著牡蠣多肽溶液濃度的上升，對鐵離子的還原能力逐漸增強，當(dāng)溶液濃度為2 mg/mL時，牡蠣多肽溶液對鐵離子的還原能力可達(dá)0.84，數(shù)據(jù)表明牡蠣多肽具有較強的鐵離子還原能力。

牡蠣多肽對羥基自由基清除率測定時，取濃度為0.5，1，1.5，2 mg/mL的牡蠣多肽溶液各2 mL，加入2 mL蒸餾水，在波長510 nm處測定溶液吸光值，作為空白樣品吸光值。測定牡蠣多肽對羥基自由基清除能力時，取濃度為0.5，1，1.5，2 mg/mL的牡蠣多肽溶液各2 mL，加入2 mL濃度為0.09 mol/L的水楊酸乙醇溶液，混合均勻后加入濃度為0.08 mol/L的雙氧水，靜置混合均勻后，在波長510 nm處測定溶液吸光值，作為待檢測樣品吸光值，最后計算牡蠣多肽對羥基自由基清除率。牡蠣多肽對羥基自由基清除率測定數(shù)據(jù)見表9。

表9 牡蠣多肽對羥基自由基清除率測定數(shù)據(jù)Table 9 Determination data of hydroxyl radical scavenging rate of oyster polypeptides

由表9可知，隨著牡蠣多肽溶液濃度的上升，對羥基自由基的清除率逐漸上升，當(dāng)溶液濃度為2 mg/mL時，牡蠣多肽溶液對羥基自由基的清除率可達(dá)59%，數(shù)據(jù)表明牡蠣多肽具有較強的羥基自由基清除能力。

4 結(jié)論

本文以牡蠣多肽提取率為目標(biāo)，對牡蠣多肽提取工藝影響因素進行優(yōu)化，確定提取過程最佳提取工藝。通過實驗測定的方式對牡蠣多肽的鐵離子還原能力和羥基自由基清除率進行分析，表明牡蠣多肽具有較強的抗氧化活性。