劉林科，王占銘，李世杰，菅憶晨，陸佳偉，菅復(fù)春

(1. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450046 ； 2. 廣西大學(xué)動物科技學(xué)院，廣西 南寧 530004 ；3. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，江蘇 南京 210014)

有研究表明，至2025年畜禽養(yǎng)殖糞污排放始終對環(huán)境造成明顯污染[1]。為此，我國出臺《畜禽規(guī)模養(yǎng)殖污染防治條例》、《關(guān)于推進農(nóng)業(yè)廢棄物資源化利用試點的方案》等規(guī)劃和文件來嚴(yán)格規(guī)范和要求畜禽糞污處理和資源化利用。近年來，我國羊養(yǎng)殖數(shù)量快速增長[2]，但隨著該行業(yè)的快速發(fā)展，規(guī)?；驁黾S便污染問題日漸凸顯，受到養(yǎng)殖戶和當(dāng)?shù)卣闹匾暋?015 年規(guī)?；笄蒺B(yǎng)殖糞污產(chǎn)生量為3.834×109t，其中新鮮糞便 6.36×108t[3]。羊糞除了其本身的污染能力外還攜帶有各種病原微生物。羊糞處理不當(dāng)不僅會污染周圍的生產(chǎn)生活環(huán)境，同時還會對附近的人和動物造成一定的健康威脅。球蟲是舍飼羊場最常見的腸道寄生蟲之一，它雖然不是重要的人獸共患寄生蟲，但其對羔羊的危害極大，會嚴(yán)重影響羊場的經(jīng)濟效益[4]。球蟲卵囊隨糞便排出，在外界孢子化后具有感染力，動物可通過糞—口途徑感染球蟲。該病原對外界的抵抗力很強，在污染的天然牧場草地常年存在[5]。如果糞污中的球蟲不能完全殺滅，則可能造成環(huán)境和水源的污染，導(dǎo)致動物再次感染。因此，糞污中球蟲失活可作為發(fā)酵處理是否合格的參考指標(biāo)之一。傳統(tǒng)堆肥法發(fā)酵羊糞所需時間長，有機質(zhì)轉(zhuǎn)化率低，容易受外界因素影響，而加入適當(dāng)菌劑可加快發(fā)酵過程、提高糞肥質(zhì)量[6-7]。為了評價3種不同菌劑比例處理模式下羊糞發(fā)酵對艾美耳球蟲卵囊的殺滅作用，本研究對羊糞發(fā)酵過程中不同時間點的卵囊數(shù)量及活性變化進行了監(jiān)測，以期為動物糞污發(fā)酵處理提供參考。

1 材料與方法

1.1 發(fā)酵菌劑及有效活菌數(shù) 枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌的有效活菌數(shù)為1×1011CFU/g，綠色木霉、黑曲霉和酵母菌的有效活菌數(shù)為1×1010CFU/g，均購自山東和眾康源生物科技有限公司。發(fā)酵菌劑用量為每個堆肥處理1 kg菌劑。

1.2 糞樣堆積發(fā)酵 發(fā)酵糞樣共分為3個組，分別采用不同的微生物菌劑進行接種發(fā)酵(表1)，從發(fā)酵處理第1天開始連續(xù)進行60 d(2019年11月13日—2020年1月11日)的溫度監(jiān)測，參考《糞便無害化衛(wèi)生要求》(GB 7959—2012)[8]附錄A高溫堆肥溫度測定方法進行溫度監(jiān)測(每天上午、下午分別檢測上層、中層、下層以及環(huán)境溫度)和樣品采集。

以羊糞為主料，油菜秸稈為輔料，將混勻的物料運至發(fā)酵區(qū)，調(diào)節(jié)含水率為55%～65%，碳氮比(C/N)約為20。建成3堆長×寬×高=1.5 m×1 m×1.5 m的條垛式堆體，每堆1 t左右。由于冬天溫度低，發(fā)酵時升溫緩慢并且維持高溫時間短，試驗中用塑料薄膜覆蓋堆體，每堆均勻噴灑1 kg提前混合好的菌劑，使用翻拋機將每堆堆體翻拋，使物料均勻混合。前10天每3天翻拋1次，后50天每10天翻拋1次。

表1 3個試驗組中不同菌種的比例Table 1 Proportion of different strains in 3 experimental groups

1.3 糞樣采集 分別在堆積后第0、3、7、10、20、28、37、48天和第58天共9個時間點于糞堆中央抽取約50 g糞樣進行球蟲卵囊計數(shù)和孢子化培養(yǎng)。

1.4 球蟲卵囊計數(shù) 采用麥克馬斯特計數(shù)法[9]進行球蟲卵囊計數(shù)，計數(shù)板上2個計數(shù)室內(nèi)的卵囊數(shù)平均值乘以200，即為每克糞便中的卵囊數(shù)(Oocysts per gram of feces，OPG)。

1.5 球蟲卵囊孢子化培養(yǎng)和形態(tài)觀察 在所采集的不同批次樣品中加入適量2.5%的重鉻酸鉀溶液，并置于恒溫培養(yǎng)箱中，在28 ℃進行孢子化培養(yǎng)，期間進行數(shù)次吹打以使球蟲卵囊更好地進行孢子化[10]。在孢子化培養(yǎng)前、后采用飽和蔗糖溶液漂浮法對球蟲卵囊進行處理并通過顯微鏡觀察其形態(tài)[4]。孢子化是球蟲卵囊隨糞便排出動物體外孢子生殖的現(xiàn)象。能夠孢子化是球蟲卵囊具有活力的象征，而且，只有孢子化的卵囊才對動物具有感染能力。本研究將球蟲卵囊是否孢子化作為球蟲是否存活的主要判定指標(biāo)。球蟲的完整性和活性參考《糞便無害化衛(wèi)生要求》(GB 7959—2012)[8]附錄H蠕蟲卵死活鑒別方法進行。

2 結(jié)果

2.1 堆肥過程中溫度變化 經(jīng)檢測堆肥內(nèi)部溫度最高可達70 ℃，在13 d開始降溫，在22 d溫度出現(xiàn)回升，在50 ℃維持?jǐn)?shù)天后溫度繼續(xù)下降。在后期又有階段性的溫度回升，但總體溫度呈下降趨勢，直至接近環(huán)境溫度(圖1)。

2.2 發(fā)酵過程中球蟲卵囊數(shù)量變化 在9個不同時間點采樣的9批(每批3份)27份糞樣中，球蟲卵囊檢出率為77.78%(21/27)，分別在第1、2、3、4、5批(分別對應(yīng)發(fā)酵的第0、3、7、10天和第20天)各檢出3份，第6批(發(fā)酵第28天)檢出2份，第7批(發(fā)酵第37天)檢出1份、第8批(發(fā)酵第48天)檢出2份、第9批(發(fā)酵第58天)檢出1份。麥克馬斯特計數(shù)后計算OPG，3個組中球蟲卵囊定量檢測結(jié)果如圖2所示，從第1批到第9批，3個組OPG均呈現(xiàn)出遞減趨勢。結(jié)果表明，羊糞發(fā)酵對球蟲卵囊的滅活和降解有顯著作用。

圖1 發(fā)酵過程中的溫度變化Fig.1 Temperature changes during fermentation

圖2 發(fā)酵過程檢出球蟲卵囊數(shù)量的變化Fig.2 Changes in the number of Eimeria oocysts during fermentation

2.3 發(fā)酵過程中球蟲卵囊活性變化 在球蟲孢子化培養(yǎng)前于顯微鏡下觀察，有一部分球蟲形態(tài)完好，另一部分球蟲不規(guī)則或不完整，同時也存在孢子化球蟲卵囊。在球蟲孢子化培養(yǎng)后于顯微鏡下觀察，除了受損的球蟲卵囊，還有部分形態(tài)完好的球蟲卵囊也未能完成孢子化發(fā)育(圖3)，說明在發(fā)酵處理后，部分球蟲卵囊即使形態(tài)完整但實際已經(jīng)失去活性，不能繼續(xù)發(fā)育。顯微鏡觀察各批樣品并計算孢子化率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3個組發(fā)酵0、3 d和7 d后糞樣中的球蟲卵囊經(jīng)28 ℃孵育后，孢子化率比孵育前都呈上升趨勢，表明此時發(fā)酵處理并未讓卵囊失活，而此后繼續(xù)發(fā)酵的樣品中球蟲卵囊數(shù)量逐漸減少，3個組分別在發(fā)酵20、28 d和37 d后未能檢出卵囊。不同發(fā)酵時間孢子化培養(yǎng)前后各組球蟲孢子化率分別見圖4和圖5。第1組的發(fā)酵處理在最短的時間內(nèi)使球蟲失活，為較優(yōu)菌種配比。

3 討論

添加合適的菌劑能提高糞污發(fā)酵的效率。本研究中，3個組枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、綠色木霉、黑曲霉和酵母菌的比例分別為1∶1∶1∶1∶2、2∶2∶1∶1∶2和3∶3∶1∶1∶2，其中第1組發(fā)酵20 d后未能查到球蟲卵囊，比第2組和第3組分別少用8 d和17 d，是發(fā)酵效率最高的組合，這個配比可縮短高肥料生產(chǎn)周期，提高生產(chǎn)效率和經(jīng)濟效益。

堆體的溫度可直接反映堆肥反應(yīng)的進程。代黎等[11]研究發(fā)現(xiàn)，堆肥腐熟過程溫度變化有兩升兩降的現(xiàn)象，溫度先快速增加后降低，再進入第2次升溫和降溫階段，漸漸進入后腐熟階段，最終趨于穩(wěn)定，與環(huán)境溫度趨于一致。這與本研究中溫度變化情況基本一致，說明本研究中堆肥發(fā)酵是合理有效的。

圖3 發(fā)酵處理后不同形態(tài)的球蟲卵囊Fig.3 Different morphology of Eimeria oocysts after fermentation treatmentA～C：正常未孢子化球蟲卵囊； D：孢子化球蟲卵囊； E～H：受損球蟲卵囊A-C:Normal unsporulated oocysts; D:Sporulated oocyst; E-H:Injured oocysts

圖4 不同發(fā)酵時間球蟲孢子化培養(yǎng)前卵囊孢子化率Fig.4 Sporulation rate of Eimeria oocysts before incubation in different fermentation time

林琳等[12]研究發(fā)現(xiàn)，在8—10月份的夏秋季節(jié)里，堆積發(fā)酵處理和塑料罐密閉儲存處理(厭氧發(fā)酵)能在30 d左右完成對捻轉(zhuǎn)血矛線蟲蟲卵的殺滅和降解，比舍內(nèi)自然放置處理的蟲卵殺滅效果更明顯。李紅霞[13]研究表明，堆肥從0 d開始迅速進入升溫階段，在2 d達到50 ℃，在2 ～ 8 d一直維持在50 ℃以上，然后開始降溫，在14 d時溫度下降到26 ℃，最后與環(huán)境溫度保持一致。而在生產(chǎn)操作過程中，為加速堆積發(fā)酵進程可添加一些微生態(tài)制劑[14]。本研究表明，添加枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和綠色木霉等組成的復(fù)合制劑好氧堆肥同樣對球蟲卵囊具有顯著的殺滅和降解效果，但不同組合的發(fā)酵菌劑效果存在差別。

球蟲卵囊活力與溫度和持續(xù)時間相關(guān)。影響寄生蟲蟲卵或卵囊生存的因素有多種，其中溫度的影響最為明顯，當(dāng)環(huán)境溫度低于10 ℃或高于30 ℃都不適合其生存和發(fā)育，某些寄生蟲蟲卵或卵囊在 40～42 ℃環(huán)境下1～2 d 即出現(xiàn)死亡[12,15]。堆肥內(nèi)

圖5 不同發(fā)酵時間球蟲孢子化培養(yǎng)后卵囊孢子化率Fig.5 The sporulation rate of Eimeria oocysts after incubation in different fermentation time

部溫度的變化影響微生物的活性，也可判斷堆肥的無害化效果和穩(wěn)定性[16]。有研究報道，60 ℃處理20 min或80 ℃處理10 min即可徹底殺滅球蟲孢子化卵囊，高溫長時間處理是殺滅全部雞球蟲卵囊的有效方式，殺滅卵囊的時間隨溫度的升高而縮短[17]。本研究中，堆肥在1～14 d會保持在較高的溫度，隨后還會有數(shù)個溫度高峰。3個組數(shù)據(jù)說明在經(jīng)過14 d的高溫后，絕大多數(shù)卵囊會被滅活分解，但仍有部分卵囊需要再次的溫度回升才會被滅活分解。所以菌劑堆肥發(fā)酵處理下，28 d是徹底殺滅所有球蟲卵囊的一個更保險的時間點。國家標(biāo)準(zhǔn)《糞便無害化衛(wèi)生要求》(GB 7959—2012)[8]中對羊糞等畜禽糞便的好氧發(fā)酵要求為：人工堆肥，堆溫≥50 ℃，至少持續(xù)10 d；機械堆肥，堆溫≥50 ℃，至少持續(xù)2 d。此時蛔蟲卵死亡率≥95%。而本研究發(fā)現(xiàn)，堆積發(fā)酵10 d后對球蟲卵囊的殺滅作用比較完全，而7 d時仍有部分卵囊具有活性(可以孢子化)，表明國家標(biāo)準(zhǔn)《糞便無害化衛(wèi)生要求》(GB 7959—2012)[8]中人工堆肥好氧發(fā)酵的要求同樣適用于球蟲卵囊。國家標(biāo)準(zhǔn)《畜禽糞便無害化處理技術(shù)規(guī)范》(GB/T 36195—2018)[18]規(guī)定的“堆溫≥50 ℃以上的維持時間不少于7 d或45 ℃以上不少于14 d”要求對球蟲卵囊的完全失活還不夠充分，在實際應(yīng)用中應(yīng)延長堆溫持續(xù)時間。

就單個樣品來講，雖不能確定孢子化球蟲是糞樣發(fā)酵處理前就存在的，還是經(jīng)過處理仍有活性的卵囊繼續(xù)孢子化的，但孵育后孢子化率提高可以表明未孢子化的卵囊仍具有活力，也就是說，糞樣的發(fā)酵處理時間還不足夠殺死所有的卵囊。而隨著發(fā)酵時間延長，能夠檢到的球蟲卵囊數(shù)量明顯減少，表明好氧堆肥對球蟲卵囊具有明顯的滅活和降解作用。

好氧堆肥發(fā)酵處理羊糞便對消化道寄生蟲的殺滅效果明顯，而由于羊糞自身的特點，使其糞便比其他動物糞便更適合堆肥[19-20]。在經(jīng)過堆肥發(fā)酵后，寄生蟲蟲卵或卵囊?guī)缀醣粴纾m合用于農(nóng)作物的基肥使用[21]。添加合適的發(fā)酵菌劑后，能讓堆肥升溫更高更快，這既能提高羊糞有機肥生產(chǎn)效率，也能確保糞堆中寄生蟲卵囊和其他病原體的滅活效果。本研究表明，糞樣中的球蟲卵囊孢子化活性檢測可作為堆肥中病原體是否完全殺滅的檢測指標(biāo)，為畜禽糞便資源化利用的有機肥產(chǎn)業(yè)提供評價標(biāo)準(zhǔn)。