劉群秀，蔣韋斌，馬碩嘉，袁耀華

（1.上海城建職業(yè)學(xué)院，上海，201415；2.上海師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海，200223；3.嘉興凱實(shí)生物技術(shù)有限公司，嘉興，314000；4.上海動(dòng)物園，上海，200335）

野生動(dòng)物體內(nèi)類固醇激素的分泌對(duì)生殖和應(yīng)激等生理活動(dòng)具有重要的調(diào)控作用，監(jiān)測(cè)各激素的變化特征是掌握動(dòng)物繁殖狀況及健康程度的重要途徑［1］。生殖類固醇代謝物水平可以反映動(dòng)物性腺的活動(dòng)規(guī)律，在野生動(dòng)物的生殖參數(shù)和發(fā)情周期等研究中得到廣泛應(yīng)用［2?3］。血液激素的測(cè)定一直被認(rèn)為是測(cè)定動(dòng)物生殖激素最直接有效的方法，然而對(duì)于野生動(dòng)物而言，血液樣品往往較難獲得，或是對(duì)動(dòng)物損傷較大，因此，基于尿樣或糞樣監(jiān)測(cè)動(dòng)物的內(nèi)分泌指標(biāo)，在不觸及動(dòng)物的前提下測(cè)定個(gè)體生理狀態(tài)，越來越成為準(zhǔn)確、實(shí)用的新方法［4］。研究表明，動(dòng)物糞樣中含有大量微生物，如果新鮮糞樣未及時(shí)提取或處理，糞樣內(nèi)外微生物將會(huì)分解糞樣中所含類固醇激素的代謝產(chǎn)物［5］，影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。同樣，采取的糞樣保存方法及保存時(shí)間等因素也會(huì)影響糞樣激素檢測(cè)結(jié)果［2］。因此，如何科學(xué)有效地保存糞樣，從而客觀真實(shí)地反應(yīng)動(dòng)物的生理狀態(tài)？是專家和學(xué)者重點(diǎn)關(guān)注的科學(xué)問題。

赤斑羚（Naemorhedus baileyi）又名紅斑羚，為國(guó)家一級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生動(dòng)物，IUCN 將其評(píng)估為易危（VU）［6］。由于棲息地資源的破壞和非法捕獵，赤斑羚種群數(shù)量極其稀少，生物學(xué)信息匱乏亟待制定保護(hù)策略和項(xiàng)目實(shí)施開展科學(xué)研究［7-8］。上海動(dòng)物園有國(guó)內(nèi)唯一的圈養(yǎng)赤斑羚種群，根據(jù)動(dòng)物園記載，目前存活的赤斑羚數(shù)量稀少且性比嚴(yán)重失衡，平均增長(zhǎng)率逐年下降［9］，科學(xué)的飼養(yǎng)和繁育是保證種群延續(xù)的必要條件。本研究以圈養(yǎng)赤斑羚為研究對(duì)象，基于糞便樣本測(cè)定生殖激素水平，同時(shí)探討不同糞樣保存方法對(duì)激素檢測(cè)結(jié)果的影響，以期為糞便類固醇激素檢測(cè)技術(shù)在野生動(dòng)物中的準(zhǔn)確應(yīng)用提供借鑒，并為確定赤斑羚繁殖生物學(xué)信息以及科學(xué)繁育提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

2018 年1 月—2019 年12 月，采集上海動(dòng)物園健康成年赤斑羚（1，1♀）的新鮮糞便樣本，裝入離心管中，根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)分組。

1.2 樣本分組

將雌、雄糞樣分開，按每份5 g 裝入離心管中保存。選取雌性糞樣分別測(cè)定雌二醇和孕酮激素，選取雄性糞樣測(cè)定睪酮，每個(gè)測(cè)試類別設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。其余樣本分為未處理組（Ⅰ）、乙醇浸泡組（Ⅱ）、干燥組（Ⅲ）、冷凍組（Ⅳ）和抗生素組（V）5 個(gè)處理組，以新鮮糞樣即時(shí)處理為對(duì)照，每個(gè)測(cè)試類別設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。除冷凍組外，其余4 組皆置于室溫中通風(fēng)保存（表1），環(huán)境溫度為（25±5）℃。

表1 赤斑羚糞樣5種不同保存方法Tab.1 Five different preservation methods for Naemorhedus baileyi fecal samples

將各處理組劃分為4個(gè)時(shí)間點(diǎn)：15、30、90、150 d，在達(dá)到不同時(shí)間點(diǎn)時(shí)處理糞樣，測(cè)定激素雌二醇、孕酮和睪酮水平，并與對(duì)照組比較。

1.3 生殖激素測(cè)定

1.3.1 生殖激素提取

將不同保存方式下離心管中的糞便（每份5 g）按時(shí)間點(diǎn)放入烘箱中完全干燥，研磨，取0.5 g 干燥糞便加入5.0 mL 95%乙醇充分震蕩30 min，然后離心15 min（5 000 r/min），取上清液1.8 mL于真空干燥機(jī)中干燥3 h，待干燥完成后在樣品中加入100 μL 95%乙醇和400 μL Assay Buffer（Assay Buffer∶純水=1∶4），震蕩直至充分混合后，離心4 min（1 500 r/min），取上清液用Assay Buffer進(jìn)行10倍稀釋［V（上清液）∶V（Assay Buffer）=9∶1］，稀釋完成后將樣品置 于-20 ℃保存，待上機(jī)測(cè)定。

1.3.2 生殖激素水平測(cè)定

采用ELISA 法測(cè)定雌性赤斑羚的孕酮和雌二醇，以及雄性個(gè)體睪酮水平。測(cè)定儀器為邁瑞（Min?dray）酶標(biāo)儀（MR-96A），試劑盒為北京北方生物技術(shù)研究所有限公司生產(chǎn)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

分別統(tǒng)計(jì)、比較和分析雌二醇、孕酮和睪酮在4種糞樣保存方式、4個(gè)時(shí)間梯度下所測(cè)定的數(shù)據(jù)。將各組別在不同時(shí)間梯度（15、30、90、150 d）的測(cè)定結(jié)果與參照組比較，并比較不同時(shí)間梯度各組別之間的差異性。應(yīng)用Shapiro-Wilk 分析檢驗(yàn)每種糞樣保存方法的激素測(cè)定值是否符合正態(tài)分布，符合正態(tài)分布則應(yīng)用單因素方差分析（one-way ANOVA test），不符合正態(tài)分布則應(yīng)用卡方檢驗(yàn)（chi-square test）［10］。數(shù)據(jù)分析應(yīng)用SPSS 25.0軟件完成，顯著水平設(shè)定為α=0.05。

2 結(jié)果

共采集赤斑羚有效糞樣410 份，其中2018 年雄性62份，雌性65份，2019年雄性137份，雌性146份。所測(cè)定的生殖激素?cái)?shù)據(jù)值均符合正態(tài)分布（Shapiro-Wilk test，p>0.05）。

2.1 糞樣保存時(shí)效性

糞樣雌二醇檢測(cè)結(jié)果表明，未處理組（Ⅰ）檢測(cè)值隨時(shí)間推移波動(dòng)性較大，在15 d 和90 d 與參考值［（1.05±0.38）ng/mL］對(duì)比呈現(xiàn)顯著差異（p<0.05），并且樣本之間檢測(cè)值差異很大。乙醇浸泡組（Ⅱ）檢測(cè)值隨保存時(shí)間延長(zhǎng)逐漸降低，至150 d時(shí)低于參考值，但未呈現(xiàn)顯著差異（p>0.05）。干燥組（Ⅲ）和冷凍組（Ⅳ）在各時(shí)間點(diǎn)的測(cè)定值均位于參考值范圍內(nèi)，兩者的波動(dòng)幅度均較?。▓D1A）。

孕酮檢測(cè)結(jié)果表明，隨時(shí)間延長(zhǎng)，未處理組（Ⅰ）在15 d時(shí)測(cè)定值［（25.55±12.06）ng/mL］顯著高于參考值［（6.30±3.94）ng/mL］（p<0.05）；在30 d 和90 d時(shí)，測(cè)定值均高于參考值。乙醇浸泡組（Ⅱ）和冷凍組（Ⅳ）在各保存時(shí)間點(diǎn)均位于參考值范圍內(nèi)，波動(dòng)幅度小。干燥組（Ⅲ）糞樣測(cè)定的孕酮水平出現(xiàn)不規(guī)則波動(dòng)（圖1B）。

睪酮檢測(cè)結(jié)果表明，未處理組（Ⅰ）和冷凍組（Ⅳ）中睪酮水平始終在參考值范圍內(nèi)［（25.67±7.58）ng/mL］。乙醇浸泡組（Ⅱ）起伏較大，在30 d時(shí)測(cè)定值較低，為（12.78±4.29）ng/mL，與參考值間存在顯著差異（p<0.05）。干燥組（Ⅲ）測(cè)定值與乙醇浸泡組呈現(xiàn)相似的波動(dòng)趨勢(shì)（圖1C）。

圖1 保存時(shí)間對(duì)不同保存方式糞樣中激素質(zhì)量濃度的影響Fig.1 Changes in testosterone at varying storage time under four storage methods

抗生素組在15 d 時(shí)糞樣已全部融化，且液面表面長(zhǎng)滿絮狀真菌，無法進(jìn)行激素測(cè)定，視為保存失敗。

2.2 發(fā)情周期判定

基于糞樣保存時(shí)效性的研究結(jié)果，采用冷凍法保存赤斑羚糞便并測(cè)定生殖激素。雌二醇于2018年1 月上旬及12 月出現(xiàn)波峰，其余月份相對(duì)平穩(wěn)。2019 年2—4 月激素水平較高，并于10 月初和11 月中下旬—12月出現(xiàn)高峰（圖2A）。

孕酮水平在2018 年1 月初出現(xiàn)高峰，在2018 年11 月—12 月中旬出現(xiàn)多個(gè)峰值，持續(xù)時(shí)間較短；2019 年1 月初及1 月中旬出現(xiàn)短暫高峰，2 月保持穩(wěn)定，但水平較高，2019年9月下旬—12月中旬出現(xiàn)波動(dòng)（圖2B）。

睪酮水平在2018 年1 月初出現(xiàn)高峰，在2018 年11 月—2019 年2 月末，以及10 月和11 月出現(xiàn)峰值（圖2C）。

圖2 赤斑羚糞便激素水平變化曲線（2018—2019年）Fig.2 Fecal testosterone level of red goral from 2018 to 2019

根據(jù)雌二醇和孕酮2 年的波動(dòng)數(shù)據(jù)，初步預(yù)測(cè)雌性赤斑羚發(fā)情期為10月—翌年3月末，其中12月—翌年1月為發(fā)情高峰期，雄性赤斑羚發(fā)情期為10月—翌年2月末。

3 討論

研究表明，類固醇激素在排出體外前會(huì)在動(dòng)物消化器官內(nèi)進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化或滅活［5］，排出后，所含的腸道細(xì)菌和外界微生物可能與糞樣中類固醇激素發(fā)生反應(yīng)［11］，導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生波動(dòng)［12］。環(huán)境溫度、樣品新鮮程度、保存試劑選用，以及動(dòng)物繁殖狀態(tài)等多種因素均會(huì)影響激素檢測(cè)的準(zhǔn)確性［2，5，13?16］。本研究首次嘗試探討不同赤斑羚糞樣保存方法（無處理、乙醇浸泡、干燥和冷凍）對(duì)生殖激素檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性的影響，其中未經(jīng)處理的赤斑羚糞樣在不同保存時(shí)間點(diǎn)激素含量起伏很大，與參考值差異顯著（p<0.05）。Millspaugh等［17］嘗試對(duì)麋鹿（Elaphurus davidianus）糞樣不做任何處理，常溫運(yùn)輸6 d，發(fā)現(xiàn)其中的糖皮質(zhì)激素含量明顯下降。Yamauchi等［15］研究發(fā)現(xiàn)，梅花鹿（Cervus nippon）糞樣在20 ℃保存時(shí)，孕酮含量會(huì)在24 h 內(nèi)顯著上升。因此建議，新鮮動(dòng)物糞樣應(yīng)及時(shí)提取或適當(dāng)處理，以減少糞樣中類固醇激素的異常波動(dòng)或損失。

乙醇具有殺菌、抑制微生物代謝及分解酶活動(dòng)的作用［18?19］，有助于輔助類固醇激素穩(wěn)定［3］。乙醇浸泡法易于操作，對(duì)于糞樣保存是很好地選擇。殷亞杰等［20］在對(duì)馴鹿（Rangifer tarandus）糞便類固醇激素保存時(shí)效的研究中發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用95%乙醇保存的糞便樣本，睪酮、孕酮和雌二醇保存時(shí)長(zhǎng)分別為20、15、45 d。黃英等［21］采用95%乙醇和低溫保存川金絲猴（Rhinopithecus roxellana）的糞樣，樣本中睪酮和雌二醇可保存30 d，孕酮可保存10 d。需要強(qiáng)調(diào)的是，隨著時(shí)間推移，乙醇的揮發(fā)會(huì)導(dǎo)致類固醇共軛鍵斷裂，使糞樣內(nèi)共軛類固醇代謝物分解或重新結(jié)合成單軛或無軛代謝物，并逐漸被微生物分解［22］。本研究中，應(yīng)用乙醇浸泡保存的糞樣隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)于孕酮檢測(cè)結(jié)果尚可，但對(duì)于雌二醇和睪酮檢測(cè)結(jié)果并不準(zhǔn)確，因此認(rèn)為乙醇浸泡法適合短期的糞樣保存（少于15 d），建議綜合應(yīng)用抗生素或乙醇洗脫劑等抑制糞便中微生物的增殖［15］。

本研究中，干燥保存法對(duì)雌二醇檢測(cè)結(jié)果較為理想。Brockman等［23］應(yīng)用干燥法保存維氏冕狐猴（Propithecus verreauxi）糞樣，發(fā)現(xiàn)雌二醇和睪酮含量可以穩(wěn)定儲(chǔ)存3 周。然而，糞便中類固醇分布都具有不均勻性且水分含量各不相同，不同物種糞便烘干最佳時(shí)長(zhǎng)與溫度也不相同，不適當(dāng)?shù)暮娓蓷l件會(huì)導(dǎo)致糞便內(nèi)類固醇激素流失［1］，即干燥糞樣保存法的時(shí)間和溫度選取尚處于摸索階段。冷凍糞樣保存是最簡(jiǎn)單快速的保存方法，廣泛應(yīng)用于糞樣類固醇激素的保存［24］。研究表明，相對(duì)于多種糞樣保存方法，低溫冷凍糞樣中微生物稍有波動(dòng)，與新鮮樣本最為相似，未經(jīng)冷凍的糞樣中類固醇激素會(huì)升高［25?26］，因此低溫保存是最為理想的糞樣保存方式［22］。在不具備冷凍條件情況下，干燥法為較好的替代方式，也可綜合應(yīng)用幾種方法，如同時(shí)使用有機(jī)溶劑和冷凍保存法，以延長(zhǎng)糞樣保存時(shí)效。對(duì)于糞便樣本保存，抗生素可以起到良好抑菌作用［12］。本研究亦嘗試使用抗生素（乳酸左氧氟沙星）保存糞樣，但出現(xiàn)了大量白毛狀真菌，無法進(jìn)行激素檢測(cè)?？股啬軌蛞种撇糠治⑸锷L(zhǎng)［27?28］，但對(duì)于赤斑羚糞便，乳酸左氧氟沙星不足以抑制更廣譜的微生物在糞樣中的生長(zhǎng)繁殖。本研究中，試驗(yàn)設(shè)定的保存時(shí)間較長(zhǎng)，抗生素并不適用，在后續(xù)研究中應(yīng)對(duì)抗生素短時(shí)保存糞樣效果進(jìn)行評(píng)估。

動(dòng)物繁殖行為的變化是其生殖生理狀況的外在表現(xiàn)，而生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)的調(diào)控作用主要是通過性腺分泌性激素來實(shí)現(xiàn)［29］。上海動(dòng)物園赤斑羚合籠主要依據(jù)行為來判斷，如雌、雄個(gè)體隔欄頻繁接觸，雌性個(gè)體表現(xiàn)出邀配行為等，通常合籠時(shí)間為12 月—翌年2 月，然而行為觀察主要由經(jīng)驗(yàn)豐富的保育員在晝間工作時(shí)隨機(jī)發(fā)現(xiàn)，缺少系統(tǒng)觀察和記錄，加之工作時(shí)間以外很多行為可能被錯(cuò)過，因此僅僅基于行為判定赤斑羚的發(fā)情狀況存在很大誤差。本研究中，依據(jù)激素水平的年度波動(dòng)，發(fā)現(xiàn)雌性赤斑羚在10月—翌年4月都可能存在發(fā)情，發(fā)情高峰為12月和1月，因此建議在日常飼養(yǎng)過程中，延長(zhǎng)雌、雄合籠時(shí)間（10 月—翌年3 月），并加強(qiáng)合籠期間行為觀察和記錄，從而提升繁殖成功率。本試驗(yàn)樣本采集在部分月份出現(xiàn)缺失，有待于在后續(xù)工作中補(bǔ)充。在不同保存條件下，赤斑羚糞便中3種生殖激素水平呈現(xiàn)不同波動(dòng)趨勢(shì)，因此認(rèn)為糞便內(nèi)激素含量除了受保存方法的影響外，還需考慮其他因素。糞便中類固醇激素含量反映的是一段時(shí)間內(nèi)的平均水平，應(yīng)持續(xù)采集、長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)，從而獲得更加客觀、準(zhǔn)確的研究結(jié)果。

致謝：研究的開展得到上海動(dòng)物園繁殖場(chǎng)主管周鋒、保育員李海國(guó)，以及科研中心的大力支持，在此一并表示感謝。