張鵬博,張 沅,李冰瀅,謝 歡,李 鑫,陳 芳,農(nóng)蔚霞,,羅 彬,,,謝小薰,,,張慶梅,,(山西省運(yùn)城市中心醫(yī)院神經(jīng)外二科,運(yùn)城 0000;廣西醫(yī)科大學(xué)組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室;廣西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;廣西醫(yī)科大學(xué)長(zhǎng)壽與老年相關(guān)疾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;通訊作者,E-mail:90785@qq.com)

膠質(zhì)瘤是一種常見(jiàn)的原發(fā)性神經(jīng)上皮腫瘤，約占中樞神經(jīng)系統(tǒng)所有腫瘤的35%，占成人原發(fā)性惡性腦腫瘤的75%[1]，目前其常規(guī)治療主要包括手術(shù)切除、替莫唑胺(TMZ)化療和放療，但這些還遠(yuǎn)不能達(dá)到對(duì)膠質(zhì)瘤的完全治愈，只能作為緩解其發(fā)展的手段[2]，迫切需求尋找新的治療手段。腫瘤免疫療法是一種新型的治療方法，其主要目的是提高抗腫瘤免疫反應(yīng)，比化療等直接殺死癌細(xì)胞的藥物脫靶效應(yīng)小，腫瘤免疫治療的主要障礙之一是確定最適合使用的腫瘤靶抗原。

黑色素瘤抗原基因(melanoma-associated antigen genes, MAGE)是近年來(lái)發(fā)展迅速的腫瘤分子靶點(diǎn)，1991年Bruggen等[3]發(fā)現(xiàn)MZ2-E(現(xiàn)稱為MAGE-A1)是一個(gè)編碼腫瘤特異性抗原的基因，此后根據(jù)基因結(jié)構(gòu)和組織特異性基因表達(dá)的差異，已經(jīng)鑒定出80多個(gè)MAGE基因，并將其分為Ⅰ型和Ⅱ型基因。與Ⅰ型基因相比，Ⅱ型MAGE-D基因具有更復(fù)雜的基因組結(jié)構(gòu)，具有一個(gè)由多個(gè)外顯子編碼的開(kāi)放閱讀框。MAGE-D4屬于MAGE-Ⅱ家族，已經(jīng)有多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)MAGE-D4在膠質(zhì)瘤中特異性表達(dá),并且其表達(dá)水平相比正常腦組織呈現(xiàn)過(guò)表達(dá)[4,5]，提示MAGE-D4可能在膠質(zhì)瘤中是腫瘤特異性抗原。

本課題組前期通過(guò)沉默膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中MAGE-D4的表達(dá)，顯示其可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞株的惡性生物學(xué)行為[6]，并進(jìn)一步通過(guò)RNA-Seq高通量測(cè)序，觀察到沉默MAGE-D4的表達(dá)可引起微小染色體維持蛋白3(minichromosome maintenance 3，MCM3)的表達(dá)明顯下降。為了分析MAGE-D4和MCM3在膠質(zhì)瘤中的關(guān)聯(lián)性及其臨床意義，本研究采用了基因表達(dá)譜交互式分析(Gene Expression Profiling Interactive Analysis，GEPIA)數(shù)據(jù)庫(kù)、癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas，TCGA)、中國(guó)腦膠質(zhì)瘤基因組圖譜計(jì)劃(The Chinese Glioma Genome Atlas，CGGA)、逆轉(zhuǎn)錄-定量聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)和小干擾RNA(small interfering RNA, siRNA)技術(shù)相結(jié)合的方式分析MAGE-D4和MCM3在膠質(zhì)瘤組織及細(xì)胞中的表達(dá)水平，及其臨床意義和相關(guān)性，探索二者是否共同參與了膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 在線數(shù)據(jù)庫(kù)分析

采用GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)(http://gepia.cancer-pku.cn)分析MAGE-D4和MCM3 mRNA在膠質(zhì)瘤和正常腦組織中的表達(dá)，其中包括低級(jí)別膠質(zhì)瘤518例，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤163例和正常腦組織207例；此外，分別下載TCGA及CGGA數(shù)據(jù)庫(kù)中675例及326例膠質(zhì)瘤中MAGE-D4和MCM3 mRNA的生存資料，分析MAGE-D4和MCM3 mRNA的表達(dá)情況與患者預(yù)后總體生存率的相關(guān)性。

1.2 臨床資料與組織標(biāo)本

本研究方案經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，納入本研究的所有患者均獲得書(shū)面知情同意。收集2009-2018年廣西醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科住院患者并接受手術(shù)治療的腦膠質(zhì)患者組織標(biāo)本62例和正常腦組織標(biāo)本11例。根據(jù)WHO中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類中低膠質(zhì)瘤分類，Ⅰ級(jí)12例，Ⅱ級(jí)26例，Ⅲ級(jí)12例，Ⅳ級(jí)12例。將Ⅰ～Ⅱ級(jí)膠質(zhì)瘤歸為低級(jí)別膠質(zhì)瘤(low-grade gliomas, LGG)，Ⅲ～Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤歸為高級(jí)別膠質(zhì)瘤(high-grade gliomas, HGG)。病理檢查結(jié)果：星型細(xì)胞瘤41例，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM)12例，少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤5例，室管膜瘤4例。所有膠質(zhì)瘤患者在術(shù)前均未接受放療及化療。作為陰性對(duì)照的正常腦組織標(biāo)本11例，來(lái)自于腦外傷后去骨瓣減壓過(guò)程中去除的正常腦組織。膠質(zhì)瘤標(biāo)本選取腫瘤中心組織，盡量避開(kāi)出血及壞死部位，離體后立即置入液氮罐中并迅速轉(zhuǎn)運(yùn)到-80 ℃冰箱保存。通過(guò)醫(yī)院病歷系統(tǒng)收集膠質(zhì)瘤患者的一般臨床資料及病理檢查結(jié)果。

1.3 主要試劑

人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251和SF126均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞培養(yǎng)庫(kù)，培養(yǎng)細(xì)胞所用的胎牛血清、青-鏈霉素混合液、MEM-EBSS培養(yǎng)基及DMEM培養(yǎng)基均購(gòu)于南京維森特生物技術(shù)有限公司，轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM3000購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司，RNA提取試劑盒、HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR試劑盒購(gòu)自美國(guó)Vazyme公司，超微量分光光度計(jì)購(gòu)自天根生化科技有限公司，LightCycler480Ⅱ熒光定量PCR儀購(gòu)自Roche公司,siRNA由上海吉瑪基因股份有限公司合成。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)

人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251和SF126培養(yǎng)于DMEM、MEM-EBSS培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/L鏈霉素)中；培養(yǎng)條件為37 ℃，5%CO2。

1.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

于6孔板中以3×105個(gè)/孔的細(xì)胞密度接種SF126及U251，37 ℃，5%CO2培養(yǎng)24 h，待融合度約70%時(shí)，開(kāi)始進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染時(shí)首先將siRNA和轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM3000混合形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物，接著更換無(wú)血清培養(yǎng)基，并將靜置15 min，將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入6孔板中，混勻后置于細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24～72 h，培養(yǎng)完成后收集細(xì)胞進(jìn)行沉默效率及最佳干擾時(shí)間檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，沉默效率實(shí)驗(yàn)采用RT-qPCR對(duì)轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞(U251，SF126)檢測(cè)MAGE-D4的表達(dá)，并計(jì)算沉默效率及最賤干擾時(shí)間。干擾MAGE-D4表達(dá)的siRNA和陰性對(duì)照siRNA(靶基因MAGE-D4的無(wú)關(guān)序列)的序列為：MAGE-D4 siRNA Sense:5′-GUGCAAUCGGAAAGCUACATT-3′,Antisense:5′-UGUAGCUUUCCGAUUGCACGC-3′;陰性對(duì)照siRNA Sense:5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′,Antisense:5′-CGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。

1.6 RT-qPCR檢測(cè)MAGE-D4和MCM3 mRNA的表達(dá)

按照細(xì)胞/組織總RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取組織標(biāo)本和膠質(zhì)瘤細(xì)胞株總 RNA,接著利用超微量分光光度計(jì)及瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)上述提取RNA的濃度、純度及完整性；確定RNA完整無(wú)降解后，采用HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，得到的cDNA首先經(jīng)過(guò)擴(kuò)增管家基因檢測(cè)質(zhì)量，采用LightCycler480Ⅱ熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，以GAPDH為內(nèi)參對(duì)照，每個(gè)樣品重復(fù)3個(gè)孔，整體實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次；上述反應(yīng)體系為：SYBR Green Ⅰ Master 10 μl，ddH2O 7.2 μl，上、下游引物各0.4 μl，cDNA 2 μl；反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)；MAGE-D4、MCM3和GAPDH引物序列分別見(jiàn)參考文獻(xiàn)[7,8]。采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因MAGED4和MCM3相對(duì)表達(dá)水平。RT-qPCR引物見(jiàn)表1。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1 Primer sequences for RT-qPCR

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

上述MAGE-D4和MCM3的表達(dá)是以其mRNA的中位數(shù)將其分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，并應(yīng)用SPSS 27.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，其中多組間的比較使用單因素方差分析，以SNK檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較；MAGE-D4和MCM3 mRNA表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系使用卡方檢驗(yàn)(Chi-square test)；表達(dá)相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)系數(shù)法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，以上統(tǒng)計(jì)分析采用Graphpad Prism 9.0作圖。

2 結(jié)果

2.1 膠質(zhì)瘤中MAGE-D4和MCM3的表達(dá)

GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)查詢結(jié)果顯示：與正常腦組織相比，MAGE-D4和MCM3 mRNA無(wú)論在低級(jí)別膠質(zhì)瘤還是高級(jí)別膠質(zhì)瘤組織中均呈高表達(dá)(P<0.05，見(jiàn)圖1)。檢測(cè)本實(shí)驗(yàn)室所收集的62例膠質(zhì)瘤樣本，RT-qPCR結(jié)果證實(shí):膠質(zhì)瘤組織中MAGE-D4表達(dá)為正常腦組織的3.95倍，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.989,P=0.004<0.05)；膠質(zhì)瘤組織中MCM3表達(dá)為正常腦組織的3.49倍，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.294,P=0.025<0.05，見(jiàn)圖2)。

與正常腦組織比較,*P<0.05圖1 GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)中不同組織MAGE-D4和MCM3 mRNA的表達(dá)水平比較Figure 1 Comparison of MAGE-D4 and MCM3 mRNA expression levels in different tissues in GEPIA database

與正常腦組織比較,*P<0.05,**P<0.01圖2 腦膠質(zhì)瘤組織與正常腦組織MAGE-D4和MCM3 mRNA表達(dá)水平比較Figure 2 Comparison of MAGE-D4 and MCM3 mRNA expression levels between glioma tissue and normal brain tissue

2.2 膠質(zhì)瘤患者M(jìn)AGE-D4和MCM3的生存分析

通過(guò)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)查詢顯示：MAGE-D4及MCM3在總體膠質(zhì)瘤中表達(dá)與總體生存率明顯相關(guān)(P<0.001，見(jiàn)圖3)；接著通過(guò)在CGGA數(shù)據(jù)庫(kù)中查詢顯示：MAGE-D4在原發(fā)膠質(zhì)瘤中的表達(dá)與總體生存率密切相關(guān)(P<0.05)，而在復(fù)發(fā)膠質(zhì)瘤中MAGE-D4表達(dá)與總體生存率無(wú)明顯相關(guān)性；MCM3在原發(fā)及復(fù)發(fā)膠質(zhì)瘤中均與總體生存率明顯相關(guān)(P<0.001，見(jiàn)圖4)。

圖3 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中不同MAGE-D4和MCM3表達(dá)膠質(zhì)瘤患者的生存分析Figure 3 Survival analysis of glioma patients with different MAGE-D4 and MCM3 expression in TCGA database

圖4 CGGA數(shù)據(jù)庫(kù)中不同MAGE-D4和MCM3表達(dá)的原發(fā)膠質(zhì)瘤和復(fù)發(fā)膠質(zhì)瘤患者的生存分析Figure 4 Survival analysis of primary and recurrent glioma patients with different MAGE-D4 and MCM3 in CGGA database

2.3 MAGE-D4和MCM3表達(dá)與膠質(zhì)瘤患者臨床指標(biāo)的關(guān)系

為了解MAGE-D4和MCM3在膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)的臨床意義，將MAGE-D4及MCM3 mRNA與膠質(zhì)瘤患者臨床指標(biāo)的關(guān)系進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示：MAGE-D4及MCM3 mRNA的表達(dá)水平與患者年齡、性別、WHO分級(jí)、病理類型、卡氏評(píng)分(Karnofsky performance score, KPS)、腫瘤大小及Ki-67、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)、S-100和波形蛋白(vimentin)表達(dá)均無(wú)相關(guān)性(P>0.05，見(jiàn)表2)。

表2 MAGE-D4及MCM3 mRNA表達(dá)情況與膠質(zhì)瘤患者臨床指標(biāo)的關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果 例(%)Table 2 Correlation between mRNA expression of MAGE-D4 and MCM3 and clinical indicators of glioma patients cases(%)

2.4 膠質(zhì)瘤組織MAGE-D4與MCM3 mRNA表達(dá)相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，所檢測(cè)的膠質(zhì)瘤組織中MAGE-D4與MCM3 mRNA表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.075 51，P=0.030 7，見(jiàn)圖5)。

圖5 膠質(zhì)瘤樣本中MAGE-D4和MCM3的相關(guān)性分析Figure 5 Correlation between MAGE-D4 mRNA and MCM3 mRNA in glioma samples

2.5 膠質(zhì)瘤細(xì)胞株沉默MAGE-D4表達(dá)對(duì)MCM3表達(dá)的影響

細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)MAGE-D4 siRNA沉默后,SF126細(xì)胞中沉默效率為57%，而且MCM3 mRNA的表達(dá)水平較沉默前顯著下降(P<0.05，見(jiàn)圖6)；U251細(xì)胞經(jīng)MAGE-D4 siRNA沉默后，沉默效率為83%，MCM3 mRNA的表達(dá)水平同樣顯著下降(P<0.05，見(jiàn)圖6)。

與MOCK組比較，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001圖6 膠質(zhì)瘤細(xì)胞株沉默MAGE-D4表達(dá)后MCM3的表達(dá)Figure 6 Expression of MCM3 in glioma cell lines after silencing MAGE-D4 expression

3 討論

膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤，其包括多種組織學(xué)類型，如星形細(xì)胞瘤、少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤、室管膜瘤和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM)，根據(jù)WHO分類可進(jìn)一步分為4個(gè)級(jí)別。WHO Ⅰ和Ⅱ分級(jí)為生長(zhǎng)緩慢且預(yù)后較好的病灶，也稱為低級(jí)別膠質(zhì)瘤；而WHO Ⅲ級(jí)和Ⅳ級(jí)通常被認(rèn)為是高級(jí)別膠質(zhì)瘤，具有侵襲性行為和不良預(yù)后[9-11]。目前來(lái)說(shuō)，癌癥免疫治療可以成為膠質(zhì)瘤治療的一種新的方向，其可通過(guò)操縱免疫系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)腫瘤的長(zhǎng)期緩解，且副作用最小。篩選腫瘤特異性抗原正是開(kāi)展腫瘤免疫治療的基礎(chǔ)。

MAGE家族是目前來(lái)說(shuō)研究進(jìn)展較快的一類腫瘤相關(guān)抗原，目前來(lái)說(shuō)，有許多MAGE家族成員已被深入研究，并認(rèn)為是理想的腫瘤靶抗原，如MAGE-A1、MAGE-A3、MAGE-A9等已在某些腫瘤中進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，并呈現(xiàn)出相對(duì)良好的療效[12,13]。因此，MAGE家族具有重大研究?jī)r(jià)值，本文中的MAGE-D4已有多項(xiàng)研究證實(shí)其在肺癌[14,15]、肝癌[16,17]、乳腺癌[18]等多種類型的腫瘤中高表達(dá)，并且有實(shí)驗(yàn)已經(jīng)開(kāi)始對(duì)MAGE-D4進(jìn)行多克隆抗體的制備[19]。有研究表明MAGE-D4表達(dá)下調(diào)可引起P53突變型膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的細(xì)胞周期S期和G2/M期細(xì)胞比例增加，表明MAGE-D4對(duì)細(xì)胞周期的影響可能依賴于P53[6]。本研究通過(guò)GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)及臨床實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證實(shí)MAGE-D4在膠質(zhì)瘤組織中呈高表達(dá)，而在正常腦組織中低表達(dá)或不表達(dá)，這與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果相似[4,6]，并且通過(guò)CGGA及TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)證實(shí)了MAGE-D4的表達(dá)與總體生存率有明顯的相關(guān)性，這些提示MAGE-D4在膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可能發(fā)揮重要作用。

腫瘤的發(fā)生及發(fā)展離不開(kāi)體內(nèi)、體外各種因素及多種基因間的相互作用。為了尋找與MAGE-D4相互作用的各種基因分子，本課題組前期通過(guò)RNA-seq高通量測(cè)序篩選發(fā)現(xiàn)了MCM3[20]。目前已知MCM3屬于微小染色體維持蛋白的一員。MCM3編碼808個(gè)氨基酸的核蛋白，分子量為105 kD[21,22]。以前的研究表明，MCMs蛋白復(fù)合物與DNA復(fù)制的起始和延伸有關(guān)[23]，MCMs被認(rèn)為是細(xì)胞周期S期的特殊啟動(dòng)標(biāo)志蛋白，其可以在不同的細(xì)胞周期中大量表達(dá)，并在靜止、衰老和分化步驟中降解，因此MCMs可以用作組織中細(xì)胞周期狀態(tài)的特定標(biāo)記蛋白[24]。MCMs基因在增殖細(xì)胞中的這一特征已導(dǎo)致其潛在的臨床應(yīng)用作為癌癥篩查的標(biāo)志物。有研究表明，MCM3s是一種P53結(jié)合蛋白[25]。同時(shí)有文獻(xiàn)指出，MCM3在多種腫瘤中過(guò)度表達(dá),如腎細(xì)胞癌[26]、子宮內(nèi)膜癌[27]、乳腺癌[28]、髓母細(xì)胞瘤[29]、惡性黑色素瘤[30]等。但MCM3在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)情況和作用機(jī)制國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)研究并不多。本研究首先通過(guò)GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)及臨床實(shí)驗(yàn)檢測(cè)證實(shí)MCM3在膠質(zhì)瘤中高表達(dá)，接著通過(guò)CGGA及TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)證實(shí)了MCM3的表達(dá)與總體生存率有明顯的相關(guān)性，這與文獻(xiàn)的研究結(jié)果類似[31,32]。但令人遺憾的是本研究結(jié)果并未觀察到MAGE-D4和MCM3 mRNA與膠質(zhì)瘤患者臨床指標(biāo)存在相關(guān)性，可能的原因有標(biāo)本例數(shù)有限、臨床資料不夠完善等，可擴(kuò)充樣本進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，MAGE-D4與MCM3 mRNA表達(dá)水平呈正相關(guān)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并且沉默MAGE-D4 mRNA在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)后，MCM3 mRNA表達(dá)水平隨之顯著下降，這提示MAGE-D4可能與MCM3之間存在相互作用，綜合上述結(jié)果及文獻(xiàn)分析，猜測(cè)MGGE-D4與MCM3可能通過(guò)p53信號(hào)通路共同參與對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)，從而參與了膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展。

綜上所述，MAGE-D4和MCM3在膠質(zhì)瘤組織中呈高表達(dá)，且二者表達(dá)水平呈正相關(guān)，可能共同參與了膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。MAGE-D4和MCM3具有成為膠質(zhì)瘤免疫治療新靶點(diǎn)的潛力。