劉凌婭,張 震,李 頎,耿園園,李 龍,姜 茜(首都兒科研究所遺傳研究室，北京 0000；首都兒科研究所附屬兒童醫(yī)院普外科；通訊作者,E-mail:teaco@6.com)

Currarino綜合征(CS, OMIM# 176450)于1981年首次描述，是一種以骶骨發(fā)育不全、肛門(mén)直腸畸形和骶前腫物為主要三聯(lián)征表現(xiàn)的罕見(jiàn)先天性疾病，發(fā)病率約為(1～9)/100 000[1,2]。骶骨發(fā)育不全常表現(xiàn)為鐮刀狀或新月?tīng)畎膑竟?，骶前腫物性質(zhì)多為良性，肛門(mén)直腸畸形可表現(xiàn)為肛門(mén)閉鎖、肛門(mén)狹窄和肛門(mén)異位等，患者也可伴有其他系統(tǒng)的異常[1,3,4]。研究發(fā)現(xiàn)CS臨床表型多變，部分患者并不表現(xiàn)為完全的三聯(lián)征。2004年Martucciello等[5]提出可將CS分為完全型(表現(xiàn)典型三聯(lián)征)、輕型(骶骨發(fā)育不全伴肛門(mén)直腸畸形或骶前腫物)及微型(僅有骶骨發(fā)育不全)3種[5]。CS患者的診斷常采用多學(xué)科聯(lián)合的方式進(jìn)行，對(duì)以肛門(mén)直腸畸形或不明原因慢性便秘為主要表現(xiàn)的患者根據(jù)其臨床表型特點(diǎn)、家族史、影像學(xué)、遺傳學(xué)檢查等進(jìn)行診斷，并對(duì)有可疑癥狀的親屬完善相關(guān)檢查以分析是否為家族性病例[4-6]。

遺傳學(xué)研究提示CS是一種常染色體顯性遺傳疾病，存在不完全外顯、臨床表型異質(zhì)性的特點(diǎn)[7]。MNX1基因(gene ID：3110)雜合突變被認(rèn)為與CS的發(fā)生密切相關(guān)[8]。既往研究在幾乎所有家族性CS病例和約30%的散發(fā)性CS病例中檢出MNX1突變[4,9]。MNX1基因位于染色體7q36，有3個(gè)外顯子，編碼一個(gè)由401個(gè)氨基酸構(gòu)成轉(zhuǎn)錄因子蛋白HB9，包含一個(gè)高度保守的同源異形盒區(qū)域(第244-297位氨基酸)[3,4,10]。迄今為止已在108例家族性病例及55例散發(fā)性病例中檢出MNX1基因變異[11]，但MNX1參與CS發(fā)生的具體機(jī)制至今尚未闡明，其上、下游作用因子及可能的參與致病的其他基因仍有待發(fā)掘。本次研究通過(guò)招募4個(gè)家系的CS先證者及其父母，分析所有檢出的CS患者的臨床表型特點(diǎn)，并通過(guò)遺傳學(xué)檢查檢測(cè)其是否攜帶MNX1基因致病突變及其他可疑突變，分析其遺傳學(xué)特征，以尋找可能存在的熱點(diǎn)突變及其他可能參與致病的候選基因及其變異。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

本研究收集從2021年4月到2021年11月期間在首都兒科研究所附屬兒童醫(yī)院普外科就診并接受治療的4個(gè)CS家系先證者的臨床資料，包括病史(確診年齡、診療經(jīng)過(guò)、三聯(lián)征表現(xiàn)及其他系統(tǒng)癥狀、家族史等)、影像學(xué)檢查等明確CS診斷。所有CS家系中先證者父母均非近親結(jié)婚，除家系1中先證者母親也被確診為CS外，家系2，3，4中先證者的父母均無(wú)類(lèi)似疾病家族史且兄弟姐妹均體健，收集并分析家系中檢出的CS患者的臨床表型信息。本研究經(jīng)過(guò)首都兒科研究所倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(SHERLL2019049)，所有患者的監(jiān)護(hù)人均已簽署知情同意書(shū)。

1.2 研究方法

1.2.1 臨床表型分析 4個(gè)家系中，確診患者均符合CS的診斷標(biāo)準(zhǔn)，即檢出骶骨畸形，同時(shí)合并肛門(mén)直腸畸形、骶前腫物或其他CS的相關(guān)異常。通過(guò)收集分析患者家族史，對(duì)先證者家庭中有相關(guān)病史的親屬完善檢查以判斷是否為家族性病例。依據(jù)2004年Martucciello等[5]提出的分型方法對(duì)4個(gè)家系中的所有CS患者進(jìn)行臨床分型：①完全型，表現(xiàn)典型三聯(lián)征，即骶骨發(fā)育不全、骶前腫物、肛門(mén)直腸畸形；②輕型，骶骨發(fā)育不全伴肛門(mén)直腸畸形或骶前腫物；③微型，僅表現(xiàn)骶骨發(fā)育不全。

1.2.2 目標(biāo)基因全外顯子組測(cè)序及突變分析 留取先證者及其父母的外周血樣本，使用Miller經(jīng)典鹽析法提取基因組DNA，于北京邁基諾基因科技股份有限公司對(duì)患者基因組DNA進(jìn)行目標(biāo)基因全外顯子組的高通量測(cè)序，過(guò)濾后的數(shù)據(jù)與人類(lèi)基因組(GRCh37/hg19)進(jìn)行比對(duì)，對(duì)檢出的突變根據(jù)美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)會(huì)(American College of Medical Genetics and Genomics, ACMG)遺傳變異分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)與指南[12]進(jìn)行致病性分析，最終篩選出與臨床表型高度相關(guān)且致病性證據(jù)較為充分的基因變異。同時(shí)對(duì)檢出點(diǎn)突變患者的父母DNA使用Sanger測(cè)序法驗(yàn)證以確定變異來(lái)源。

1.2.3 文獻(xiàn)復(fù)習(xí) 利用PubMed、dbVar、ClinVar數(shù)據(jù)庫(kù)查閱CS相關(guān)文獻(xiàn)，比較分析與本次檢出的點(diǎn)突變位點(diǎn)相同或缺失范圍近似的Currarino綜合征患者的臨床表型特點(diǎn)。

2 結(jié)果

2.1 CS患者的臨床表型特征

共納入4個(gè)CS家系，收集并分析先證者家族史后，發(fā)現(xiàn)家系1中先證者母親既往有CS相關(guān)臨床表現(xiàn)，完善檢查后也被確診為CS，其余家系中的先證者父母、兄弟姐妹均未報(bào)告CS相關(guān)臨床癥狀，因此4個(gè)家系中共檢出5例CS患者，包括1名男性、4名女性。按照Martucciello等提出的方法進(jìn)行臨床分型，3例患者表現(xiàn)為完全型CS，2例患者表現(xiàn)為輕型CS。所有CS患者均表現(xiàn)骶骨畸形和肛門(mén)直腸畸形，除典型三聯(lián)征外，本次檢出患者還伴有神經(jīng)系統(tǒng)(脊柱裂、脊髓栓系)、泌尿系統(tǒng)(膀胱順應(yīng)性降低)、生殖系統(tǒng)(雙子宮畸形)及骨骼系統(tǒng)(恥骨及髂骨畸形)中的部分異常表現(xiàn)(見(jiàn)表1)。

表1 4個(gè)家系中5個(gè)CS患者的臨床表型Table 1 Clinical phenotype of five CS patients in 4 pedigrees

2.2 目標(biāo)基因全外顯子組測(cè)序與突變檢測(cè)

采集上述4個(gè)家系中CS先證者及其父母、兄弟姐妹的外周血并提取基因組DNA，共收集13人樣本。通過(guò)對(duì)兒童腸道先天發(fā)育異常性疾病已知的目標(biāo)基因全部外顯子進(jìn)行高通量測(cè)序，共檢出來(lái)自不同家系的3種MNX1基因的致病突變，包括1個(gè)錯(cuò)義突變(c.877C>T p.R293W，家系1)，1個(gè)移碼突變(c.53dupC p.R19Tfs*37，家系2)和1個(gè)拷貝數(shù)缺失(家系3，位于7q36.3，約0.219 Mb，缺失區(qū)域內(nèi)包括MNX1基因和LMBR1基因)，全部為雜合突變。3種突變位點(diǎn)的分布模式見(jiàn)圖1。

灰色斜線(xiàn)區(qū)域表示7q36.3(區(qū)域：chr7:156583817-156803063)0.219 Mb缺失范圍，黑色填充框表示該缺失范圍內(nèi)包含的基因B.家系3中先證者攜帶的染色體7q36.3區(qū)域拷貝數(shù)缺失示意圖(GRCh37/hg19)圖1 CS患者突變位點(diǎn)模式圖Figure 1 Schematic representation of the mutation sites in CS patients

4個(gè)家系中所有CS患者的信息及其攜帶MNX1基因致病突變的測(cè)序結(jié)果見(jiàn)圖2、圖3。家系1中，先證者及其母親被確診為CS并均攜帶1個(gè)位于MNX1基因第3外顯子的雜合錯(cuò)義突變c.877C>T(p.R293W)，先證者父親未檢出突變且無(wú)CS相關(guān)臨床表現(xiàn)(見(jiàn)圖2)。該突變位點(diǎn)編碼的氨基酸位于高度保守的同源異形盒結(jié)構(gòu)域(見(jiàn)圖1A)，曾在既往CS病例中被報(bào)道[13]，根據(jù)美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)(American College of Medical Genetics and Genomics, ACMG)遺傳變異分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)與指南評(píng)估為致病性變異(PS4+PM1+PM2+PM5+BP4)(見(jiàn)表2)。

家系圖中黑色填充圖形表示CS確診患者，(+)表示攜帶MXN1致病突變(具體突變位點(diǎn)及缺失區(qū)域在家系圖下方注明)，(-)表示未檢出MNX1致病突變圖2 CS家系1、家系2的家系圖及測(cè)序結(jié)果Figure 2 Pedigree and sequencing results of the pedigree 1 and pedigree 2 with CS

黑色填充圖形表示CS確診患者，(+)表示攜帶MXN1致病突變，(-)表示未檢出MNX1致病突變；紅色箭頭指示拷貝數(shù)缺失區(qū)域，該區(qū)域累及MNX1、LMBR1基因圖3 CS家系3的家系圖及測(cè)序結(jié)果Figure 3 Pedigree and sequencing results of the pedigree 3 with CS

家系2中，高通量測(cè)序結(jié)果顯示先證者攜帶1個(gè)位于MNX1基因第1外顯子的雜合移碼突變c.53dupC(p.R19Tfs*37)，變異來(lái)源自先證者父親，但先證者父母均無(wú)CS相關(guān)臨床表現(xiàn)(見(jiàn)圖2)。該突變?cè)诩韧墨I(xiàn)中曾8次報(bào)道于不相關(guān)的CS患者[4,7,14-17]，確定為致病性變異(PVS1+PS4)(見(jiàn)表2)。

表2 CS家系先證者遺傳學(xué)檢測(cè)結(jié)果Table 2 Genetic results of the CS probands

家系3中，先證者攜帶1個(gè)位于染色體7q36.3(區(qū)域：chr7:156583817-156803063)的拷貝數(shù)缺失，為大小約0.219 Mb的雜合缺失(見(jiàn)圖3)，該區(qū)域內(nèi)包含MNX1基因及LMBR1基因，為致病性變異，先證者父母及其妹妹均未檢出該致病突變，為新發(fā)突變(見(jiàn)表2)。先證者父母及妹妹均無(wú)CS相關(guān)臨床表現(xiàn)。dbVar數(shù)據(jù)庫(kù)中(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/dbvar/)已有相似區(qū)域拷貝數(shù)缺失的CS病例報(bào)道(病歷號(hào)：nsv997030|區(qū)域：chr7:156797547-156803347|Pathogenic|病例臨床表型：Currarino綜合征)，具體表型不詳。

家系4中，先證者經(jīng)高通量測(cè)序未檢出MNX1基因的致病突變，但攜帶1個(gè)位于SHH基因的雜合錯(cuò)義突變c.488G>A(p.R163H)(見(jiàn)圖4)，變異來(lái)源為先證者母親，先證者父母均無(wú)CS相關(guān)臨床表現(xiàn)。SHH基因突變?cè)诙鄠€(gè)CS病例中報(bào)道[18,19]。

2.3 文獻(xiàn)回顧

我們回顧了既往報(bào)道中與本研究CS患者中檢出的MNX1基因致病點(diǎn)突變的基因型相同或缺失范圍近似的CS患者的臨床表型，并對(duì)散發(fā)性病例及家族性病例中的先證者臨床表型進(jìn)行分型(見(jiàn)表3)。本次檢出的錯(cuò)義突變?cè)谝粋€(gè)CS家族性病例中被報(bào)道，但該文獻(xiàn)未詳述先證者及家系中其他患者的突變攜帶情況及對(duì)應(yīng)表型信息，故無(wú)法進(jìn)行臨床分型。本次檢出的移碼突變?cè)诙噙_(dá)8個(gè)CS病例中被報(bào)道，除1例臨床表型信息不明外，其他7名患者的臨床分型均為完全型CS。家系3中檢出的拷貝數(shù)缺失，dbVar數(shù)據(jù)庫(kù)曾報(bào)道1例攜帶近似區(qū)域拷貝數(shù)缺失的CS患者，但臨床表型未明。

表3 既往攜帶相同點(diǎn)突變或近似缺失范圍的CS患者基因型與表型信息Table 3 Genotype and phenotype information of previously reported CS patients carrying same point mutations or similar deletions

3 討論

3.1 CS患者的臨床表型特征

本研究圍繞4個(gè)CS家系進(jìn)行，其中3個(gè)散發(fā)性病例，1個(gè)家族性病例，共檢出5名CS患者，臨床分型2人為輕型CS，3人為完全型CS(見(jiàn)表1)。除典型的三聯(lián)征外，5例患者還分別伴有神經(jīng)系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、骨骼系統(tǒng)及生殖系統(tǒng)等其他系統(tǒng)的部分異常表現(xiàn)，其中3例患者有神經(jīng)系統(tǒng)的異常表現(xiàn)并均攜帶MNX1致病突變(見(jiàn)表1)，包括脊柱裂伴或不伴脊膜膨出、脊髓低位、脊髓圓錐低位和脊髓栓系，這可能提示攜帶MNX1突變的CS患者中神經(jīng)系統(tǒng)受累并不罕見(jiàn)。2008年Crétolle等[4]在50例CS患者中發(fā)現(xiàn)約70%攜帶MNX1基因突變者有神經(jīng)管畸形的表現(xiàn)，其中脊髓栓系、脊髓圓錐低位和椎管內(nèi)脂肪瘤較多見(jiàn)，與本研究結(jié)果相似，因此也有研究者認(rèn)為神經(jīng)系統(tǒng)畸形應(yīng)被列為CS的第四大臨床表型特征。

值得注意的是，本次檢出的家族性病例中先證者母親表現(xiàn)雙子宮畸形，回顧既往CS病例發(fā)現(xiàn)CS患者可伴有雙子宮畸形、雙角子宮、陰道隔等多種女性生殖系統(tǒng)畸形[7,21]。有研究認(rèn)為這些生殖系統(tǒng)畸形與苗勒氏管發(fā)育畸形(Müllerian duct anomalies, MDAs)有關(guān)，CS患者合并MDAs的發(fā)生率高達(dá)15%[9,22]，而普通女性人群中MDAs患病率約為6.7%[23]，提示CS女性患者有更高風(fēng)險(xiǎn)患生殖系統(tǒng)畸形疾病，應(yīng)在臨床診療過(guò)程予以關(guān)注。

本研究中CS患者男女比例為1 ∶4，但限于樣本量較小，尚不足以說(shuō)明男女比例存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。既往研究提示CS患者中男女患者比例約為1 ∶1.39，可能與CS女性患者M(jìn)DAs的發(fā)生率較高有關(guān)[4]。

3.2 基因型-表型關(guān)聯(lián)

目前研究認(rèn)為MNX1為CS的致病基因，本研究4個(gè)家系中共檢出3種MNX1基因致病突變，包括2個(gè)點(diǎn)突變及1個(gè)累及MNX1基因的拷貝數(shù)缺失。攜帶相同點(diǎn)突變或近似缺失的CS病例在既往研究中已有報(bào)道[4,7,13-17]。家系1檢出的MNX1錯(cuò)義突變c.877C>T(p.R293W)曾在1個(gè)臨床表現(xiàn)為肛門(mén)直腸畸形、半骶骨畸形、骶前腫物及輸尿管膀胱返流的CS家族性病例中報(bào)道(見(jiàn)表3)，但先證者臨床表型未明，故無(wú)法進(jìn)行臨床分型[13]。該錯(cuò)義突變位于MNX1基因編碼蛋白中高度保守的同源異形盒區(qū)域內(nèi)，既往研究表明該區(qū)域參與HB9蛋白與“TAAT”DNA基序靶標(biāo)的結(jié)合，或通過(guò)體外核定位信號(hào)(NLS)基序參與其核定位，因此該區(qū)域的突變可能影響DNA結(jié)合特異性或影響突變蛋白的核定位[10,24]。既往CS患者檢出位于同源異形盒區(qū)域內(nèi)的突變較為常見(jiàn)，該功能域參與疾病發(fā)生、發(fā)展的過(guò)程及機(jī)制值得進(jìn)一步研究[4,21]。

家系2攜帶的MNX1基因移碼突變c.53dupC(p.R19Tfs*37)曾在8個(gè)互不相關(guān)的CS散發(fā)性患者及家族性病例中被報(bào)道，除1例先證者的臨床表型不明外，其他先證者均為完全型CS(見(jiàn)表3)[4,7,14-17]，而本研究中家系2先證者的臨床分型為輕型CS，即病例7/8攜帶該突變且臨床表型明確的CS先證者為完全型CS，存在顯著表型異質(zhì)性。

家系3檢出1個(gè)累及MNX1基因與LMBR1基因的拷貝數(shù)缺失，攜帶相似區(qū)域拷貝數(shù)缺失的CS病例在dbVar數(shù)據(jù)庫(kù)中已有報(bào)道，但其臨床表型未明。早在1996年就有研究人員指出部分CS患者的染色體7q36區(qū)域發(fā)生雜合缺失[25]，后續(xù)研究提示這些染色體缺失往往不僅累及MNX1基因，還累及SHH等位于染色體7q36上的其他基因，并被認(rèn)為可能與CS患者的一些表型相關(guān)，如SHH基因被認(rèn)為可能和部分CS患者的小頭畸形等表現(xiàn)有關(guān)[4,18,19]。而本次累及的LMBR1基因變異曾在2個(gè)不相關(guān)的攜帶MNX1突變的CS病例中被報(bào)道，目前LMBR1是否參與CS發(fā)生尚未明確[26]。

家系4先證者雖未檢出MNX1基因致病突變，但檢出一個(gè)SHH基因的錯(cuò)義突變c.488G>A(p.R163H)。既往有研究分析10例攜帶染色體7q36.3區(qū)域缺失的CS患者臨床表型，發(fā)現(xiàn)5例患者有不同程度CS臨床表現(xiàn)，認(rèn)為SHH基因可能參與CS的發(fā)生[8,18]。SHH是表達(dá)最廣泛的哺乳動(dòng)物HH信號(hào)分子，在中胚層分化中發(fā)揮重要作用，并參與調(diào)控胚胎骶骨發(fā)育、神經(jīng)管發(fā)育、人類(lèi)胚胎期腸道發(fā)育及區(qū)域特化等多個(gè)過(guò)程[27]。目前研究對(duì)SHH是否參與CS的發(fā)生尚無(wú)定論，也有研究者認(rèn)為CS的發(fā)生可能與SHH無(wú)關(guān)[28]。該突變的檢出提示對(duì)CS致病機(jī)制的進(jìn)一步研究或可從SHH基因入手，重點(diǎn)關(guān)注該基因及SHH通路中的重要分子是否參與CS的發(fā)生發(fā)展。

CS患者臨床表型復(fù)雜多變，即使在家族性病例中攜帶相同MNX1致病突變的個(gè)體間臨床表型亦不相同，提示可能有其他基因或調(diào)節(jié)元件直接或間接參與疾病發(fā)生，未來(lái)研究應(yīng)重視并收集CS患者中多次檢出的非MNX1基因變異并分析、評(píng)估其是否參與CS致病，以尋找新的候選基因。

綜上，CS患者臨床表型變異大，部分患者經(jīng)多次診療后才得以確診，分析CS的臨床表型與基因型特征，探討CS家系中需要關(guān)注的臨床表現(xiàn)(如三聯(lián)征、神經(jīng)系統(tǒng)或女性患者生殖系統(tǒng)的異常等)及MNX1基因突變特點(diǎn)，對(duì)幫助更多患者明確診斷、檢出家系中其他攜帶者、提供遺傳咨詢(xún)具有重要意義。盡管MNX1基因在CS中的致病機(jī)制尚不明確，其上、下游作用因子仍有待研究，攜帶熱點(diǎn)突變位點(diǎn)的患者得到確診可能提示新的研究思路，同時(shí)也應(yīng)重視收集在多個(gè)不相關(guān)病例中反復(fù)檢出的非MNX1基因變異并進(jìn)行遺傳學(xué)分析以尋找新的候選基因。目前隨著對(duì)CS這一罕見(jiàn)病的認(rèn)識(shí)逐漸提高、診療技術(shù)的進(jìn)步及遺傳學(xué)檢測(cè)的大規(guī)模開(kāi)展，更多的CS患者得以確診，未來(lái)隨著更多臨床病例的收集及遺傳學(xué)的深入研究有望最終明確其發(fā)生機(jī)制，為臨床診療提供更多幫助。