姜巖，李玉欣，陳立功，李文杰

(1.重慶工商大學(xué) 廢油資源化技術(shù)與裝備教育部工程研究中心，重慶 400067；2.哈爾濱工業(yè)大學(xué)(威海) 海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，山東 威海 264209)

生物柴油是一種重要的可再生能源，可以無(wú)限的生產(chǎn)，并具有許多環(huán)境友好的特性，如含硫量低、更易被降解，并且不包含對(duì)環(huán)境造成污染的芳香族化合物。由于用植物油為原料生產(chǎn)成本高且產(chǎn)量有限，而以餐飲廢棄油為原料，也存在原料難以收集等問(wèn)題，利用微生物油脂發(fā)酵成了一個(gè)重要的研發(fā)方向[1-2]。

單細(xì)胞油脂的組成和一般植物油相近，以C16和 C18脂肪酸，如油酸、棕櫚酸、亞油酸和硬脂酸等為主，但不飽和度更高[3]，因而生產(chǎn)的生物柴油的品質(zhì)好[4]。利用微生物油脂制備生物柴油具有很多優(yōu)勢(shì)，如：微生物生長(zhǎng)迅速、生長(zhǎng)周期短、生長(zhǎng)原料廣泛且價(jià)格便宜；可以人工調(diào)控且需要?jiǎng)趧?dòng)力少；受季節(jié)、場(chǎng)地、環(huán)境制約??；能連續(xù)大規(guī)模生產(chǎn)，生產(chǎn)成本較低[5]。因而通過(guò)微生物法制備生物柴油對(duì)柴油產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。本文對(duì)產(chǎn)油微生物的種類、篩選和微生物柴油的制備流程進(jìn)行了綜述，并對(duì)未來(lái)的研究方向進(jìn)行了展望。

1 產(chǎn)油微生物的研究現(xiàn)狀

部分微生物在適宜條件下生產(chǎn)并儲(chǔ)存的油脂含量占其生物總量的20%以上，具有這種特性的菌株一般被稱為產(chǎn)油微生物[6]。目前，已發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)油微生物包括酵母菌、霉菌、藻類和細(xì)菌等。其中，酵母菌作為單細(xì)胞真核微生物，常見(jiàn)的產(chǎn)油菌有產(chǎn)油油脂酵母(Lipomyceslipofer)、彎隱球酵母(Cryptococcusalbidum)、淺白色隱球酵母(Cryptococcusalbidus)、彎假絲酵母(Candidacurvata)、斯達(dá)氏油脂酵母(Lipomycesstarkeyi)、膠粘紅酵母 (Rhodotorulaglutinis)、圓紅冬孢酵母(Rhodosporidiumtoruloides)、茁芽絲孢酵母(Trichospironpullulans)、雙倒卵形紅冬孢酵母(Rhodosporidiumdiobovatum)等[7-8]，這類菌株細(xì)胞內(nèi)油脂含量較高，可達(dá)菌體干重的30%～70%。霉菌是形成分支菌絲的真菌統(tǒng)稱。目前發(fā)現(xiàn)的常見(jiàn)產(chǎn)油霉菌有深黃被孢霉(Mortierellaisabellina)、高山被孢霉(Mortierellaalpina)、葡酒色被孢霉(Mortu-erellavinacea)、拉曼被孢霉(Mortierellaramanniana)、卷枝毛霉(Mucorcircinelloides)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、紫癜麥角菌(Clavicepspurpurea)、高梁褶孢黑粉菌(Tolyposporiumehrenbergii)等[9-10]。霉菌油脂含量約為菌體干重的20%～70%。此外，海洋中許多藻類都能產(chǎn)生油脂，其中微藻以其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)在產(chǎn)油藻類中凸顯出來(lái)，近年來(lái)成為了研究的熱點(diǎn)。微藻個(gè)體小，平均大約只有5 mm，生長(zhǎng)繁殖快，對(duì)外界環(huán)境適應(yīng)力強(qiáng)，在陸地、海洋分布廣泛，幾乎在有光和潮濕的任何地方，微藻都能生存，并且產(chǎn)油培養(yǎng)過(guò)程容易，對(duì)光的利用效率高。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了幾百種富油微藻，直接提取得到的油脂組分與植物油類似，可以作為植物油的替代品，更是優(yōu)良的生物柴油生產(chǎn)原料?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)含油量較高的微藻有硅藻(Diatom)、綠藻(Chlorophyta)、葡萄藻(Botryococcusbraunii)、杜氏鹽藻(Dunaliellasalina)、小球藻(Chlorellavulgaris)等[11]。藻類油脂含量約為菌體干重的25%～65%。相比之下，產(chǎn)油細(xì)菌油脂含量較低，為20%～40%，常見(jiàn)的有：分枝桿菌(Mycobacterium)和棒狀桿菌(Corynebacterium)等。細(xì)菌在高葡萄糖時(shí)產(chǎn)生不飽和甘油三酸酯，但大多數(shù)產(chǎn)油細(xì)菌不產(chǎn)甘油三酯，而是積累復(fù)雜類脂，如磷脂與糖脂。由于細(xì)菌油脂主要分布于細(xì)胞外膜上，所以提取較為困難，故很難應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。

2 產(chǎn)油微生物的篩選與培養(yǎng)

野生型產(chǎn)油菌株往往效率很低，因而高效誘變株成為發(fā)展方向。

傳統(tǒng)誘變方法。即利用物理誘變劑(如α射線、γ射線、紫外輻射等)和化學(xué)誘變劑(如烷化劑、核酸堿基類似物等)等誘使微生物發(fā)生突變，進(jìn)而篩選出高產(chǎn)油菌株的誘變方法。Yamada等[12]通過(guò)紫外線得到了誘變酵母突變株，產(chǎn)脂率是野生型的5倍。

針對(duì)微生物油脂代謝網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)行調(diào)整和結(jié)構(gòu)優(yōu)化，來(lái)提高細(xì)胞的油脂含量[8]。主要有以下幾種思路：①增加油脂合成相關(guān)酶的表達(dá)量。Zhang 等[13]使圓紅冬孢酵母(Rhodosporidiumtoruloides)的乙酰CoA羧化酶和二?；视王；D(zhuǎn)移酶基因過(guò)量表達(dá)，促使菌體油脂含量增加了2倍；②抑制脂肪酸β氧化途徑。Courchesne等[14]通過(guò)部分抑制β-氧化可增加細(xì)胞油脂含量；③抑制中間代謝產(chǎn)物流向其他分支途徑。Athanasios等[15]將編碼3-磷酸甘油脫氫酶的GUT2基因敲除，使Δgut2突變株的油脂含量增加了 3 倍。

用轉(zhuǎn)座子隨機(jī)插入基因組，從而找出油脂合成相關(guān)基因。Kamisaka等[16]則通過(guò)轉(zhuǎn)座子突變?cè)卺劸平湍?Saccharomycescerevisiae)中發(fā)現(xiàn)5個(gè)能促進(jìn)菌體油脂含量積累的基因。這條研究路線得到了較好的處理效果。

3 生物柴油的制備

生物柴油制備的主要過(guò)程為：發(fā)酵→菌體的收集與預(yù)處理→油脂提取→生物柴油制備。

3.1 發(fā)酵

發(fā)酵過(guò)程作適當(dāng)優(yōu)化調(diào)整可以提高油脂含量。除了通過(guò)控制通氣量、溫度、pH、光照，還可以控制營(yíng)養(yǎng)元素的比例或添加一些小分子物質(zhì)來(lái)提高油脂含量。①調(diào)整C/N比例。李永紅等[17]發(fā)現(xiàn)C/N 比在一定范圍內(nèi)增加時(shí)，圓紅冬孢酵母菌(Rhodosporidiumtoruloides)油脂含量也隨之增加，達(dá)到420 時(shí)，油脂含量達(dá)到最高值76%。②調(diào)整C/P比。李永紅等[17]還發(fā)現(xiàn)C/P比適度增加，也會(huì)提高菌體油脂含量。③調(diào)整C/S比。Wu等[18]在研究Rhodosporidumtoruloides時(shí)發(fā)現(xiàn)，S同樣起著很重要的作用，硫限制時(shí)，細(xì)胞油脂含量不再隨C/N而變化。④添加其他一些小分子物質(zhì)。Papanikolaou等[19]發(fā)現(xiàn)加少量甜橙精油到Y(jié)arrowialipolytica的培養(yǎng)基質(zhì)中，便能使產(chǎn)物中飽和脂肪酸含量大幅增加。

另外還可以應(yīng)用不同發(fā)酵模式調(diào)控油脂發(fā)酵。通常利用微生物生產(chǎn)胞內(nèi)產(chǎn)物，可以采用的培養(yǎng)方式有3種：批式培養(yǎng)、補(bǔ)料-批式培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)。其中補(bǔ)料-批式培養(yǎng)模式可方便控制限制因子濃度，獲得了廣泛應(yīng)用。Liang等[20]利用粗甘油為碳源培養(yǎng)Cryptococcuscurvatus，發(fā)現(xiàn)補(bǔ)料-批式培養(yǎng)條件下，在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，菌體量和油脂含量均比批式培養(yǎng)高。

3.2 菌體預(yù)處理

油脂多包含在菌體細(xì)胞內(nèi)，為了提高油脂的萃取率，有必要在提取油脂之前對(duì)菌體細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，使得內(nèi)部油脂更容易釋放出來(lái)。菌體常見(jiàn)的預(yù)處理方法有：①基于機(jī)械剪切力的研磨、高壓、激光、超聲波、電場(chǎng)等；②反復(fù)凍融法，即利用低溫冰凍后生成的冰晶達(dá)到破壁目的；③與稀鹽酸共煮法，即是用一定濃度的稀鹽酸對(duì)菌體細(xì)胞進(jìn)行處理，破壞其細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，再加熱煮沸進(jìn)一步使得細(xì)胞裂解；④菌體自溶法，如將酵母在50 ℃下保溫 2～3 d，自行消化后回收油脂；⑤酶處理法，即用細(xì)胞壁降解酶，如木聚糖酶、纖維素酶等處理菌體；⑥有機(jī)溶劑處理，如利用乙醇或丙酮破壞細(xì)胞膜，使結(jié)合蛋白變性[21-23]。

預(yù)處理方法選擇上還要根據(jù)原料材質(zhì)決定[24]，研發(fā)高效低成本的預(yù)處理技術(shù)對(duì)后續(xù)油脂提取很重要。

3.3 油脂提取

油脂提取也是制備生物柴油的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，常用的方法包括有機(jī)溶劑法、索氏提取法、超臨界CO2萃取法(SFE)等。這些方法在諸多工業(yè)領(lǐng)域中應(yīng)用，屬于通用技術(shù)。

3.4 化學(xué)法制備生物柴油

目前，生物柴油的制備方法主要有化學(xué)法、物理法、生物酶法三類，以化學(xué)酯交換法研究最為廣泛。該法是采用脂肪酸甘油酯和甲醇在催化劑的催化下進(jìn)行酯交換反應(yīng)，產(chǎn)生脂肪酸甲酯和甘油。

3.4.1 均相催化酯交換 通過(guò)加入鹽酸、硫酸、磷酸，或NaOH、KOH等均相酸或堿催化劑，使催化反應(yīng)高效進(jìn)行。與均相酸催化法相比，堿催化更快，約為酸催化劑4 000倍，但堿會(huì)與游離的脂肪酸發(fā)生皂化反應(yīng)，發(fā)生乳化，使得催化劑不易去除，水又會(huì)促進(jìn)甲酯的水解。均相酸催化法雖受游離脂肪酸影響小，但耗時(shí)較長(zhǎng)，對(duì)設(shè)備有一定腐蝕，且耗用甲醇量較多，當(dāng)體系中水和游離脂肪酸含量較高時(shí)，可考慮選擇酸催化劑催化[25]。

3.4.2 多相催化酯交換 多相催化法最大的優(yōu)點(diǎn)在于大大方便了催化劑的分離，有利于去除游離脂肪酸雜質(zhì)[26]。采用的催化劑常有硫酸化金屬氧化物、磺酸離子交換樹(shù)脂、磺酸改性介孔二氧化硅、磺化碳基催化劑等[27]，并且具有對(duì)設(shè)備腐蝕性小、環(huán)境污染小的優(yōu)點(diǎn)。但反應(yīng)速率較慢，主要是因?yàn)榇己陀蛢上嗖换ト?，阻礙了反應(yīng)的進(jìn)行。夏禹杰等[28]使用雙醚類物質(zhì)作為共溶劑，使甘油三酸酯和低級(jí)醇形成均相反應(yīng)體系，從而增大了反應(yīng)界面，加快了反應(yīng)速度。

3.4.3 亞臨界酯交換法 在溫度接近甲醇超臨界溫度下，催化酯交換反應(yīng)，在一定程度上彌補(bǔ)了均相、多相催化酯交換和超臨界酯交換的缺陷。該方法使用固體催化劑，使后續(xù)的催化劑分離更加容易；在亞臨界狀態(tài)下甲醇和油脂的互溶度增加，提高了反應(yīng)速度；對(duì)原料的含水量、酸值要求不高，降低了預(yù)處理等成本；解決了高溫高壓?jiǎn)栴}，對(duì)設(shè)備的要求降低[29]。

3.4.4 超臨界酯交換法 甲醇在超臨界狀態(tài)下與油脂的互溶度極大增加，甲醇既是反應(yīng)物又是催化劑，使分離更加簡(jiǎn)單；反應(yīng)對(duì)油脂要求低，使預(yù)處理簡(jiǎn)單。此外，甲基酯的轉(zhuǎn)化率高，并且對(duì)環(huán)境污染小。主要的缺點(diǎn)為反應(yīng)是在高溫高壓下進(jìn)行，對(duì)設(shè)備條件要求高，使大規(guī)模應(yīng)用受阻。Kusdiana等[30]提出超臨界流體二步法，即水解、酯化二步法合成生物柴油的工藝。首先將油脂在亞臨界狀態(tài)下水中水解成脂肪酸，脂肪酸在超臨界甲醇條件下發(fā)生甲酯化反應(yīng)生成脂肪酸甲酯。此法的脂肪酸與甲醇發(fā)生酯化的溫度壓力條件更溫和，但工藝流程變得相對(duì)復(fù)雜，目前研究還不夠深入，在未來(lái)此種改進(jìn)方法可能會(huì)有很好的應(yīng)用[31]。

4 結(jié)束語(yǔ)

開(kāi)發(fā)綠色替代能源已經(jīng)成為發(fā)展趨勢(shì)。微生物油脂以其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)很可能成為生物柴油的重要原料來(lái)源，然而以微生物油脂為原料的第三代生物柴油技術(shù)還未成熟，原因在于生產(chǎn)成本較高、不能高效規(guī)模化生產(chǎn)采集油脂。未來(lái)可從以下幾方面進(jìn)行研究：

(1)尋求更加廉價(jià)而高效的原料用于產(chǎn)油微生物發(fā)酵。

(2)繼續(xù)深入研究產(chǎn)油微生物的篩選、改良和培育，最好能結(jié)合處理有機(jī)廢棄資源，創(chuàng)造更加經(jīng)濟(jì)環(huán)保的生產(chǎn)方式。

(3)對(duì)微生物油脂合成代謝網(wǎng)絡(luò)繼續(xù)深入分析，找到關(guān)鍵因素，在提高油脂產(chǎn)量上，找到新突破口。

(4)優(yōu)化工藝，探求可廉價(jià)高效提取微生物油脂的新方法。