杜泊羊連續(xù)超數(shù)排卵間隔時(shí)間對(duì)排卵效果的影響

付 樂，于 濤，徐振朋，陳大勇，何輝杰，仇春娟，王秀蓮，張澤文

（1.烏蘭察布市農(nóng)林科學(xué)研究所，內(nèi)蒙古烏蘭察布 012000；2.內(nèi)蒙古賽諾種羊科技有限公司，內(nèi)蒙古烏蘭察布 012000；3.烏蘭察布市畜牧工作站，內(nèi)蒙古烏蘭察布 012000；4.涼城縣六蘇木鎮(zhèn)人民政府，內(nèi)蒙古烏蘭察布 013750）

內(nèi)蒙古地區(qū)肉羊存欄量、產(chǎn)肉量常年居全國(guó)前列，多年來(lái)形成具有蒙古羊血統(tǒng)的多個(gè)優(yōu)質(zhì)肉羊品種，為了加快利用引進(jìn)品種改良本地品種的生長(zhǎng)速度及產(chǎn)肉性能等性狀，以超數(shù)排卵與胚胎移植技術(shù)（multiple ovulation and embryo transfer，MOET)為核心的現(xiàn)代化生物繁育技術(shù)是一條高效途徑，并已成為擴(kuò)繁良種和保護(hù)瀕危物種的有力輔助技術(shù)[1,2]。其中，超數(shù)排卵是胚胎移植等胚胎生物工程技術(shù)的重要環(huán)節(jié)，其目的是通過(guò)對(duì)動(dòng)物注射外源性促性腺激素盡可能地收獲更多胚胎，誘導(dǎo)胚胎移植或者使懷胎數(shù)量達(dá)到最大，提高優(yōu)良母畜的繁殖能力，從而可以在短時(shí)期內(nèi)大幅度地增加優(yōu)良個(gè)體母畜和公畜的后代數(shù)量，迅速擴(kuò)大良種畜群，加速育種和品種改良工作[3,4]。在肉羊胚胎移植中，超數(shù)排卵的效果直接影響肉羊胚胎移植的成敗。影響超排的因素分為動(dòng)物因素和環(huán)境因素，動(dòng)物因素主要包括個(gè)體的遺傳特性（品種)、年齡、生理狀態(tài)、營(yíng)養(yǎng)狀況等，環(huán)境因素則包括外源性激素（質(zhì)量、用量、方案)、季節(jié)、連續(xù)處理的間隔等[5,6]。有研究指出激素制劑中FSH/LH（促卵泡激素/促黃體素)比例、給藥途徑、劑量和頻率等不同，肉羊個(gè)體對(duì)超排處理的反應(yīng)也不同，具體影響程度和變化都需進(jìn)一步研究。因此，在胚胎移植產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)中不斷地摸索與研究各種內(nèi)源因素與外源因素對(duì)胚胎移植效果的影響，發(fā)現(xiàn)不同影響因素對(duì)超數(shù)排卵的作用，進(jìn)而完善改進(jìn)超數(shù)排卵技術(shù)方案，對(duì)提高單只羊的出胚率和胚胎移植效率，降低胚胎生產(chǎn)損失，加速生產(chǎn)性能改良，提高肉羊生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)效益有重要意義。超排過(guò)程中外源激素和手術(shù)等因素的刺激使供體的重復(fù)利用受到了限制，因此，如何減少重復(fù)超排過(guò)程中對(duì)供體的刺激與損傷，提高重復(fù)超排的有效率，最大限度地利用優(yōu)秀供體的繁殖機(jī)能，是做胚胎移植技術(shù)產(chǎn)業(yè)化特別關(guān)注的研究領(lǐng)域，也是行業(yè)今后研究的一個(gè)重點(diǎn)方向。本試驗(yàn)以杜泊綿羊?yàn)檠芯繉?duì)象，初步探索研究連續(xù)超排次數(shù)、重復(fù)超排時(shí)間間隔對(duì)供體母羊排卵效果的影響，為胚胎移植產(chǎn)業(yè)化合理安排生產(chǎn)、降低生產(chǎn)成本并提高效率以及科學(xué)利用引進(jìn)品種肉羊改良本土品種提供參考。

1 試驗(yàn)材料

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

本試驗(yàn)供體羊來(lái)自四子王旗查干補(bǔ)力格蘇木巴音嘎查賽諾種羊場(chǎng)的純種杜泊母羊，年齡1.5 周歲左右，臨床健康，生殖器官無(wú)異常供體母羊60 只，體重均為55～60kg。供體公羊?yàn)楣痉N公羊特一級(jí)純種杜泊。試驗(yàn)于2018 年6 月—2019 年12 月進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)藥品

孕酮海綿栓孕酮（CIDR)由新西蘭輝瑞公司生產(chǎn)；孕馬血清促性腺激素（PMSG)為內(nèi)蒙古松山獸藥廠生產(chǎn)；促卵泡激素（FSH)、氯前列烯醇鈉（PG)為上海計(jì)劃生育生物研究所生產(chǎn)；促黃體素（LH)為寧波第一激素廠生產(chǎn)；體外培養(yǎng)試劑除特殊標(biāo)注外皆由Sigma 公司生產(chǎn)。

2 方法

2.1 試驗(yàn)分組

本試驗(yàn)供體羊共計(jì)60 只，試驗(yàn)分為3 組，每組20 只，分別為間隔60d 組、間隔90d 組、間隔120d組。分別間隔每60、90、120d 超排一次，連續(xù)超排4次，重復(fù)超排母羊不變，試驗(yàn)過(guò)程中對(duì)輸卵管嚴(yán)重粘連的母羊，下次超排時(shí)剔除不用，讓其自然繁殖。

2.2 超數(shù)排卵和配種處理方法

所選擇的供體母羊在同一日早上7:00 放入陰道海綿栓1 枚，同時(shí)配置有潤(rùn)滑劑與土霉素源粉，在放置海綿栓的第10d 晚上7:00 開始超數(shù)排卵（開始放栓第一天為0d)，用連續(xù)遞減超排法，超排3d 注射FSH共計(jì)6 次，每天2 次，間隔12h 給藥一次，在注射FSH 第5 次時(shí)去掉海綿栓，用400IU 青霉素混合500mL 生理鹽水，每只羊10mL 沖洗陰道，并同時(shí)注射PG 1mL/只，第13 天試驗(yàn)羊只空腹24h，第14 天上午用試情公羊試情，發(fā)情母羊立即注射LH 280IU/只，并選用配種公羊進(jìn)行配種，采用腹腔鏡輸精法在子宮角處輸精，每只羊0.4mL（兩側(cè)各0.2mL)，精液稀釋至2～4 倍。

2.3 胚胎收集

在供體羊發(fā)情后36～48h 從輸卵管收集胚胎。手術(shù)前空腹24h，可以少量飲水，供體羊視體重而定，每千克體重肌注0.03～0.05mL 2%靜松靈；局部注射鹽酸利多卡因2.5mL/只。將母羊放到手術(shù)架上仰臥保定。在供體羊離乳房前端約2cm 處，腹中線的兩側(cè)均可，用手術(shù)刀將手術(shù)部位縱向切開6～8cm 長(zhǎng)的刀口，用6～8#頭皮針從子宮輸卵管接合部的子宮端導(dǎo)入到輸卵管峽部，將導(dǎo)卵管從輸卵管喇叭口插入3～4cm，導(dǎo)卵管遠(yuǎn)端與玻璃平皿相接，將5mL 沖胚液緩緩?fù)瞥?，胚胎即通過(guò)輸卵管回收于玻璃平皿中。另一側(cè)操作同上。把盛有沖胚回收液的玻璃皿放在立體顯微鏡下，仔細(xì)檢查，不可遺漏，將檢出的胚胎放入盛有保存液的培養(yǎng)皿中，待移植，沖胚完畢后，在子宮角和輸卵管處涂抹適量的普魯卡因青霉素，用30～35℃的生理鹽水將子宮和卵巢沖洗干凈，將250mL 的甲硝唑灌入腹腔。供、受體母羊創(chuàng)口采用三層縫合法。腹膜、肌肉和皮膚分層縫合。每縫好一層涂抹適量青鏈霉素溶液，以防創(chuàng)口感染。手術(shù)后供體母羊再進(jìn)行輸液加強(qiáng)護(hù)理。

2.4 飼養(yǎng)管理

所有的供體母羊及種公羊，全部為放牧+舍飼，每天按照放牧?xí)r間放牧并根據(jù)營(yíng)養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)給足量精補(bǔ)料和苜蓿，提供充足的清潔飲水，防疫、驅(qū)蟲、藥浴每年春秋各進(jìn)行一次。

2.5 數(shù)據(jù)處理與分析

所有數(shù)據(jù)使用SPSS 12.0 統(tǒng)計(jì)軟件的t 檢驗(yàn)方法，以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

3 結(jié)果與分析

3.1 時(shí)間間隔60d 連續(xù)超排結(jié)果

當(dāng)供體母羊連續(xù)超排間隔60d 時(shí)，隨著超排次數(shù)的增加，處理供體數(shù)量減少，其中第3 次超排淘汰的2 只供體母羊與第4 次超排淘汰的1 只供體母羊，均為輸卵管粘連嚴(yán)重，淘汰出試驗(yàn)組，每次處理供體羊均100%發(fā)情受孕。隨著超排次數(shù)的增加，回收胚胎數(shù)量和可用胚胎數(shù)量呈逐漸下降趨勢(shì)，組內(nèi)各次，回收胚胎數(shù)量和可用胚胎數(shù)量相比較下降顯著（P＜0.05)；受體羊兩側(cè)排卵點(diǎn)，隨著超排次數(shù)的增加，呈逐漸下降趨勢(shì)，每一次超排后的排卵點(diǎn)與前一次相比較差異顯著（P＜0.05)。平均每次每只供體羊能夠出胚胎數(shù)6.1，排卵點(diǎn)為11.23 個(gè)（表1)。

表1 時(shí)間間隔60d 連續(xù)超排結(jié)果

3.2 時(shí)間間隔90d 連續(xù)超排結(jié)果

由表2 可見，當(dāng)供體母羊連續(xù)超排間隔90d 時(shí)，隨著超排次數(shù)的增加，處理供體數(shù)量不變，且每次處理供體羊100%發(fā)情受孕。隨著超排次數(shù)的增加，回收胚胎數(shù)量和可用胚胎數(shù)量呈逐漸下降趨勢(shì)，組內(nèi)各次，回收胚胎數(shù)量和可用胚胎數(shù)量相比較顯著差異（P＜0.05)，受體羊兩側(cè)排卵點(diǎn)，隨著超排次數(shù)的增加，呈逐漸下降趨勢(shì)，經(jīng)顯著性分析，每一次超排后的排卵點(diǎn)與前一次相比較差異顯著（P＜0.05)。平均每次每只供體羊能夠出胚胎數(shù)6.7 個(gè)，平均每次每只供體羊排卵點(diǎn)為14.56 個(gè)。

表2 時(shí)間間隔90d 連續(xù)超排結(jié)果

3.3 時(shí)間間隔120d 連續(xù)超排結(jié)果

由表3 可見，當(dāng)供體母羊連續(xù)超排間隔120d 時(shí)，隨著超排次數(shù)的增加，處理供體數(shù)量不變，且每次處理供體羊100%發(fā)情受孕。數(shù)據(jù)用SPSS12.0 軟件分析處理，進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。隨著超排次數(shù)的增加，回收胚胎數(shù)量和可用胚胎數(shù)量呈逐漸下降趨勢(shì)，組內(nèi)各次，回收胚胎數(shù)量和可用胚胎數(shù)量相比較顯著差異（P＜0.05)，受體羊兩側(cè)排卵點(diǎn)，隨著超排次數(shù)的增加，呈逐漸下降趨勢(shì)，經(jīng)顯著相分析，每一次超排后的排卵點(diǎn)與前一次相比較差異顯著（P＜0.05)。平均每次每只供體羊能夠出胚胎數(shù)6.76 個(gè)，平均每次每只供體羊排卵點(diǎn)為14.15。

表3 時(shí)間間隔120d 連續(xù)超排結(jié)果

3.4 不同超排間隔對(duì)重復(fù)超排效果的影響

由表4 可知，與超排間隔60d 組相比，超排間隔60d 組和120d 組可回收胚胎數(shù)量、可用胚胎數(shù)量和排卵點(diǎn)數(shù)量均增加；且超排間隔60d 組回收胚胎數(shù)量、可用胚胎數(shù)量及排卵點(diǎn)數(shù)量明顯少于間隔90d 組和間隔120d 組（P＜0.05)，間隔90d 組和間隔120d組之間則變化不顯著（P＞0.05)。

表4 不同超排間隔對(duì)重復(fù)超排效果的影響

4 討論

4.1 超排重復(fù)次數(shù)對(duì)超排的影響

一般認(rèn)為對(duì)于同一供體，只要操作得當(dāng)，重復(fù)超排數(shù)次之間留有一定的時(shí)間間隔，重復(fù)超排的效果并不隨著超排次數(shù)的增加而降低[7,8]。但也有研究表明首次超排與重復(fù)超排的胚胎回收率和獲卵數(shù)各有不同[9]。尹峰[10]對(duì)3 組不同周齡的東北細(xì)毛羊幼母羔的超排效果進(jìn)行比較，結(jié)果首次超排的獲卵數(shù)均明顯多于重復(fù)超排。辛英霞等發(fā)現(xiàn)對(duì)同一批絨山羊分別間隔0d、300d、60d 連續(xù)進(jìn)行3 次超數(shù)排卵，然后收集胚胎，結(jié)果顯示前2 次的平均采胚數(shù)和平均有效胚胎數(shù)均較高，第三次則明顯下降（P＜0.05)[11]。另有文獻(xiàn)報(bào)道，肉羊做胚胎移植時(shí)，在FSH 保持不變的條件下，隨超排次數(shù)增加，超排回收胚胎數(shù)量、排卵點(diǎn)呈現(xiàn)顯著下降趨勢(shì)[12]。本試驗(yàn)也是在保持肉羊超排中使用的FSH 劑量不變的條件下，其他飼養(yǎng)管理、手術(shù)條件一致的情況下，研究連續(xù)重復(fù)超排對(duì)超數(shù)排卵的影響。試驗(yàn)結(jié)果顯示，各試驗(yàn)組組內(nèi)，隨著超排重復(fù)次數(shù)不斷增加，回收胚胎數(shù)量和可用胚胎數(shù)量及排卵點(diǎn)均呈逐漸下降趨勢(shì)（P＜0.05)。趙霞等[13]對(duì)20 頭波爾山羊以45d 為間隔實(shí)施超排處理，結(jié)果顯示前2 次超排所獲得的平均可用胚胎數(shù)差異不顯著，而第二次超排效果顯著優(yōu)于第三次超排，研究表明，這可能是由于隨著超排次數(shù)的增加以及外源激素的連續(xù)使用，供體羊的卵巢對(duì)激素的反應(yīng)可能會(huì)有減弱的趨勢(shì)，進(jìn)而引起發(fā)育的卵泡數(shù)和排卵數(shù)有所下降。一般來(lái)說(shuō)，經(jīng)過(guò)多次超排處理的母羊超排效果比較穩(wěn)定，但并不是隨著超排次數(shù)越多其超排的效果就越好，多數(shù)羊經(jīng)過(guò)幾次超排處理后，其超排效果會(huì)逐漸降低。一般認(rèn)為，連續(xù)超排反應(yīng)的降低和肉羊?qū)に禺a(chǎn)生的抗體有關(guān)，Valasi 等[14]研究表明，卵巢對(duì)激素的反應(yīng)性降低是導(dǎo)致重復(fù)超排所獲卵母細(xì)胞數(shù)量下降的主要原因。同時(shí)在重復(fù)超排過(guò)程中，多次超排處理也可能會(huì)對(duì)卵巢和子宮造成損傷，降低超排效果[15,16]。所以我們?cè)趯?shí)際胚胎移植生產(chǎn)中做連續(xù)超排時(shí)，并不能不考慮連續(xù)超排次數(shù)這一因素，進(jìn)行連續(xù)超排時(shí)需要根據(jù)供體羊的胚胎移植次數(shù)和營(yíng)養(yǎng)狀況不斷調(diào)整FSH 的使用劑量，同時(shí)要注意減輕手術(shù)對(duì)母羊的損傷，降低手術(shù)粘連和對(duì)卵巢的損傷程度，提高供體的超排利用效率，達(dá)到理想的超排效果。本試驗(yàn)因?yàn)槭中g(shù)和術(shù)后護(hù)理不當(dāng)?shù)仍?，造成輸卵管?yán)重粘連而淘汰。

4.2 超排時(shí)間間隔對(duì)超排的影響

在發(fā)情周期的不同時(shí)期進(jìn)行超排處理，超排效果不一樣。且超排處理對(duì)母羊會(huì)產(chǎn)生較大的應(yīng)激，超排間隔時(shí)間過(guò)短時(shí)，供體的生殖系統(tǒng)和內(nèi)分泌的自我調(diào)節(jié)功能不能完全恢復(fù)，重復(fù)超排效果不穩(wěn)定，超排間隔時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，盡管能消除外源激素對(duì)卵巢刺激產(chǎn)生的影響，但會(huì)降低供體母羊的利用率[17]。適宜的超排時(shí)間間隔對(duì)超排效果以及后續(xù)胚胎移植效率有一定影響。對(duì)供體牛來(lái)說(shuō)，一般同一供體個(gè)體超排間隔至少在60d 以上超排處理效果好。本試驗(yàn)是在保持肉羊超排中使用的FSH 劑量不變的條件下，其他飼養(yǎng)管理、手術(shù)條件一致的情況下，研究改變連續(xù)超排的時(shí)間間隔（間隔期分別為60、90、120d)對(duì)超數(shù)排卵的影響。試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，間隔60d 組供體羊平均每次可用胚胎數(shù)6.10 枚/只，平均每次排卵點(diǎn)為11.23 個(gè)/只；間隔90d 組供體羊平均每次可用胚胎數(shù)6.70 枚/只，平均每次排卵點(diǎn)為14.56 個(gè)/只；間隔120d 組供體羊平均每次可用胚胎數(shù)6.76 枚/只，平均每次排卵點(diǎn)為14.15 個(gè)/只。數(shù)據(jù)分析顯示，試驗(yàn)間隔60d 組回收胚胎數(shù)量、可用胚胎數(shù)量及排卵點(diǎn)數(shù)量比間隔90d 組和間隔120d 組明顯減少，間隔90d 組和間隔120d 組之間變化不顯著。表明超排時(shí)間間隔較長(zhǎng)利于超數(shù)排卵的數(shù)量與質(zhì)量。這可能與試驗(yàn)的供體羊機(jī)體需要時(shí)間修復(fù)和機(jī)體對(duì)激素產(chǎn)生了抗體有關(guān)。但在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中，超排時(shí)間間隔太長(zhǎng)影響經(jīng)濟(jì)效益和性能改良速度。所以在肉羊胚胎產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)中，結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)效益，要求超數(shù)排卵效果達(dá)到最佳的同時(shí)又要保證肉羊生產(chǎn)效益，這就需要研究確定適合本品種的超排間隔時(shí)間，或者通過(guò)讓母羊超排后正常懷孕產(chǎn)羔一次，恢復(fù)供體母羊的生殖系統(tǒng)，以保證供體母羊的正常繁殖和優(yōu)秀供體重復(fù)利用。本研究結(jié)果表明，杜泊母羊超數(shù)排卵最佳時(shí)間間隔為90d。

另外需要注意的是，采用手術(shù)法收集胚胎，除了考慮供體羊連續(xù)超排對(duì)激素產(chǎn)生抗體外，更重要的是要考慮連續(xù)手術(shù)對(duì)母羊生殖系統(tǒng)的損傷，這也是造成供體母羊超排胚胎數(shù)量下降的主要原因，嚴(yán)重者會(huì)發(fā)生粘連，失去正常的繁殖能力。手術(shù)中，操作要輕柔，盡量避免卵巢、輸卵管、子宮體的牽拉損傷和出血，防止粘連，降低手術(shù)對(duì)超排的影響。

5 結(jié)論

肉羊進(jìn)行連續(xù)超數(shù)排卵，隨著超排次數(shù)的增加，回收胚胎數(shù)量和可用胚胎數(shù)量及排卵點(diǎn)個(gè)數(shù)呈逐漸下降趨勢(shì)，需根據(jù)供體羊的胚胎移植次數(shù)和營(yíng)養(yǎng)狀況不斷調(diào)整FSH 的使用劑量，保證超數(shù)排卵的效果；另超數(shù)排卵間隔較長(zhǎng)有利于超數(shù)排卵的數(shù)量與質(zhì)量，杜泊羊超排最少間隔90d 最佳。