譚 丹，陳 智，鄒建曾，劉增再，鄭姣妹，唐愛明，王文梅，耿相昌，賴詩(shī)嘉周元中，寧華杰，黃 甜，王洪亮*

（1.長(zhǎng)沙市動(dòng)植物疫病預(yù)防控制中心，湖南長(zhǎng)沙 410000；2.長(zhǎng)沙市農(nóng)業(yè)綜合行政執(zhí)法局，湖南長(zhǎng)沙 410000；3.寧鄉(xiāng)市動(dòng)植物疫病預(yù)防控制中心，湖南寧鄉(xiāng) 410600；4.瀏陽市佳和養(yǎng)殖專業(yè)合作社，湖南瀏陽 410300）

目前，在我國(guó)引起家禽傳染性腫瘤病主要有3種，即皰疹病毒引起的馬立克氏?。∕arek′s disease，MD)，網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病毒引起的網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥（Reticuloendotheliosis，RE)和禽白血病毒引起禽白血?。╝vian leukosis，AL)。現(xiàn)AL 和MD 在雞群中較為常見，在我國(guó)雖然MD 疫苗的使用具有一定保護(hù)性，但近年來國(guó)內(nèi)出現(xiàn)接種疫苗，雞群依然發(fā)病的情況時(shí)有發(fā)生，尤其多病原的混合感染造成雞生長(zhǎng)抑制、產(chǎn)蛋性能下降、出現(xiàn)免疫抑制現(xiàn)象，甚至引發(fā)雞群產(chǎn)生腫瘤和死亡等，給養(yǎng)雞業(yè)造成了巨大損失。該文主要對(duì)長(zhǎng)沙市某發(fā)病雞群進(jìn)行了ALV 和MDV 混合感染確診和鑒定，并對(duì)ALV 的env 和MDV-meq 基因進(jìn)行序列分析，豐富長(zhǎng)沙市關(guān)于禽病的分子流行病學(xué)數(shù)據(jù)，為長(zhǎng)沙市禽白血病和馬立克氏病的凈化與防治提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 病料來源

病料來源于2020 年長(zhǎng)沙市某養(yǎng)雞場(chǎng)，檢測(cè)為AIV 和MDV 感染陽性，采集發(fā)病和死亡雞的組織病料及血清。經(jīng)調(diào)查，該發(fā)病雞群存欄2000 羽，170 日齡左右，發(fā)病雞肉冠發(fā)白，消瘦、精神不良，翅膀下垂，排綠色稀薄糞便等臨床癥狀，發(fā)病雞陸續(xù)發(fā)生死亡，日死亡率為0.4%～2%。病死剖檢可見全身內(nèi)臟器官均出現(xiàn)腫大，尤其是肝臟、脾臟及腎臟，出現(xiàn)不同程度的腫瘤結(jié)節(jié)。

1.2 主要試劑

病毒DNA/RNA 提取試劑盒購(gòu)自西安天隆科技有限公司、一步法RT-PCR 試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京)有限公司、AIVH5/H7 雙熒光核酸檢測(cè)試劑盒、傳染性法氏囊病核酸檢測(cè)試劑盒、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥核酸檢測(cè)試劑盒、禽白血病核酸檢測(cè)試劑盒、馬立克氏病核酸檢測(cè)試劑盒5 種試劑盒均購(gòu)自達(dá)安基因公司，引物由通用生物系統(tǒng)（安徽)有限公司合成（見表1)。

1.3 引物合成

用于測(cè)定ALV-env 基因、MDV-meq 基因的引物主要引用于參考文獻(xiàn)[1，2]，引物序列見表1。

1.4 病毒鑒定與目的基因擴(kuò)增及測(cè)序

結(jié)合雞群的臨床和剖檢變化，初步懷疑為白血病和馬立克氏病毒感染，對(duì)病死雞的病料組織用病毒DNA/RNA 提取試劑盒進(jìn)行核酸提取，核酸-80℃保存?zhèn)溆?，取核酸分別加入禽流感、傳染性法氏囊病、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥、禽白血病、馬立克氏病的特異性引物進(jìn)行檢測(cè)，擴(kuò)增體系分別按照AIVH5/H7 雙熒光核酸檢測(cè)試劑盒、傳染性法氏囊病核酸檢測(cè)試劑盒、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥核酸檢測(cè)試劑盒、禽白血病核酸檢測(cè)試劑盒、馬立克氏病核酸檢測(cè)試劑盒5 種試劑盒說明書進(jìn)行熒光定量PCR 檢測(cè)。

目的基因擴(kuò)增：取5μL 核酸配制PCR 檢測(cè)體系分別添加ALV-env 基因、MDV-meq 基因擴(kuò)增引物進(jìn)行基因擴(kuò)增，ALV-env 基因擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?2℃30min；94℃ 5min；94℃ 45s，58℃ 45s，72℃3min，35 個(gè)循環(huán)；72℃10min。MDV-meq 基因擴(kuò)增反應(yīng)程序：42℃30min；94℃5min；94℃45s，60℃45s，72℃1min，35 個(gè)循環(huán)；72℃10min。將擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，確定為目的條帶后送至通用生物系統(tǒng)（安徽)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。

1.5 序列分析

對(duì)測(cè)序公司獲得的序列在NCBI 網(wǎng)站上對(duì)所測(cè)毒株進(jìn)行BLAST 比對(duì)，同時(shí)利用MEGA5.0、DNAStar進(jìn)行基因序列分析并繪制進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 病毒鑒定結(jié)果

經(jīng)檢測(cè)，馬立克氏病、禽白血病核酸檢測(cè)為陽性，結(jié)果見圖1、圖2，其他疫病檢測(cè)均為陰性，將毒株命名為ALV-2010HUNAN，MDV-2010HUNAN。

圖1 禽白血病毒核酸熒光PCR 檢測(cè)結(jié)果

圖2 馬立克氏病毒核酸熒光PCR 檢測(cè)結(jié)果

2.2 ALV env 基因序列及遺傳進(jìn)化分析

對(duì)擴(kuò)增的ALV-env 基因序列測(cè)定后，下載參考序列進(jìn)行比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)該文分離毒株env 基因序列與內(nèi)源性E-ALV 代表毒株同源性最高為98.9%，與A-D群ALV 毒株同源性為81%～89.2%，與J 群ALV 毒株同源性最低為33.01%～40.5%。進(jìn)化樹顯示，該毒株與內(nèi)源性ALV 處于同一進(jìn)化枝，判定該毒株為內(nèi)源性ALV（圖3)。

圖3 分離毒株與參考毒株env 基因遺傳進(jìn)化樹

2.3 MDV meq 基因序列及遺傳進(jìn)化分析

對(duì)擴(kuò)增的MDV-meq 基因序列測(cè)定后，下載參考序列進(jìn)行比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)分離株MDV-2010HUNAN的meq 序列與參考野毒GX0101 和疫苗毒CVI19898相比，在提供的meq 序列中不含有CVI988 特有的插入，因此判定所提供的序列為MDV 野毒。進(jìn)一步對(duì)序列同源性和遺傳進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該毒株與我國(guó)MDV 野毒株處于同一進(jìn)化分支，同源性為96.5%～99.2%（詳見圖4-圖5)。

圖4 分離毒株與參考毒株meq 基因同源性比較

圖5 分離毒株與參考毒株meq 基因遺傳進(jìn)化樹

3 討論

根據(jù)本次雞群發(fā)病的臨床癥狀、病原學(xué)檢測(cè)及病毒基因序列測(cè)定結(jié)果顯示，引起本次雞群發(fā)病死亡的主要原因?yàn)轳R立克氏野毒和E 群禽白血病毒混合感染所致。從我們所測(cè)得ALV-env 基因比對(duì)分析該毒株為E 群屬于內(nèi)源性病毒，據(jù)報(bào)道，ALV-env 基因是ALV引發(fā)雞體產(chǎn)生腫瘤的主要基因之一，可根據(jù)核苷酸同源性比對(duì)來鑒定分離株的亞群[3]，本次分離毒株雖然為內(nèi)源性毒株，但雞場(chǎng)感染ALV 后會(huì)引起雞群的免疫抑制，一旦MDV 野毒進(jìn)入，兩種病毒共同感染，會(huì)迅速增加病毒對(duì)雞群的感染性和致病力，從而引起雞群的嚴(yán)重的免疫抑制及腫瘤癥狀[4]。

meq 是MDV 原癌基因，參與腫瘤形成及免疫抑制[5]，本次分離的毒株meq 序列同源性和遺傳進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該毒株與我國(guó)MDV 我國(guó)流行野毒株處于同一進(jìn)化分支，與國(guó)內(nèi)強(qiáng)毒株GX0101 代表毒株同源性97.2%，處于同一大分支，很可能分離毒株為流行的強(qiáng)毒株，其具體致病性和致病型如何還有待進(jìn)一步研究。

目前該類群ALV 尚無疫苗和藥物進(jìn)行防治，各地主要通過種禽場(chǎng)的凈化和生物安全措施進(jìn)行防控，長(zhǎng)沙市2020 年以來嘗試對(duì)培育的瀏黃雞等地方品種進(jìn)行流調(diào)及禽白血病凈化工作，雖然有些成效，但是還是存在零散發(fā)生。而MDV 的防控主要通過接種疫苗，疫苗主要有單價(jià)苗、二價(jià)苗、三價(jià)苗及重組DNA 疫苗4 大類[6]，雖然疫苗免疫能抵御一般毒株的侵襲，但有研究發(fā)現(xiàn)，部分MDV 的超強(qiáng)毒株及特超強(qiáng)毒株能突破疫苗免疫保護(hù)[7]，或者與其他免疫抑制性病毒的混合感染降低了雞群對(duì)MD 疫苗的免疫應(yīng)答效果，增加感染MDV 的幾率，引起MDV 在雞群的暴發(fā)。因此建議一是做好種雞群凈化，可在產(chǎn)蛋前經(jīng)ELISA 或其他血清學(xué)檢測(cè)，陽性雞一次性淘汰，經(jīng)三四代淘汰后，雞群達(dá)到凈化；二是做好疫苗免疫，嚴(yán)格按照免疫程序做好MD 及常規(guī)疫苗的免疫；三是加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，保持良好養(yǎng)殖環(huán)境衛(wèi)生，做好雞舍、放養(yǎng)區(qū)及飼養(yǎng)用具等消毒工作，消毒藥建議交替使用，同時(shí)做好球蟲等驅(qū)蟲工作。

4 結(jié)論

該文對(duì)采集病雞組織病料進(jìn)行病原的鑒定及重要基因的測(cè)序分析，表明此次病原主要是禽白血病病毒和馬立克氏病毒混合感染，進(jìn)一步序列分析ALV env 基因與內(nèi)源性ALV 處于同一進(jìn)化分支，MDV-meq 基因與我國(guó)MDV 野毒株處于同一進(jìn)化分支，進(jìn)一步說明該雞群為MDV 野毒株和內(nèi)源性ALV 的混合感染導(dǎo)致，建議后期雞場(chǎng)在種源凈化、疫苗免疫及生產(chǎn)管理方面做好禽白血病及馬立克氏等疫病防控。